一种基于化学发光的单分子检测装置及检测分析方法

本发明涉及化学发光，具体涉及到一种基于化学发光的单分子检测装置及检测分析方法。本方法可适用于单分子反应动力学分析、热力学分析、催化剂性能分析和其他类似地单分子分析领域。

背景技术：

1、化学反应生成的产物是原子间化学键断裂和形成过程中电子转移的结果，并伴随着热转换和光产生等物理现象。对化学反应的观察可通过监测反应物和生成物的变化或探测伴随的物理效应来实现，然而这些观察通常都是在体相的集合水平上进行的。虽然已有一些观察单个化学反应的技术研究出现，但在单分子水平直接观测溶液中的化学反应及其动力学一直是化学领域的一项长期挑战。由于单个反应的物理信号非常微弱，现有的大多数单分子方法都是通过化学反应的输出信号来测量化学物质的性质的，如利用基于扫描探针的方法测量物质的电导率或者利用单分子荧光显微镜观测反应发射的荧光信号。然而，这些方法往往受到时间分辨率或者激光带来的背景荧光的限制，而且在不受表面限制的由溶液中分子自由扩散和随机碰撞引发的一般单分子化学发光反应事件会导致巨大的反应位置和反应时间的不确定性。所以在单分子水平上揭示这种化学反应动力学仍然具有挑战性。

2、化学发光是一类通过化学反应产生光辐射的现象，在这一过程中无需外加任何激发光源。化学发光有两种发光形式，一种是产生的电子激发产物直接发光，另一种是将其产生中间体的能量转移到荧光团后间接发光。由于具有无需外加光源，灵敏度高，生物毒性小，无自荧光干扰等优点，化学发光反应被广泛应用于分析检测领域，如免疫标记测定，药物分析，临床测定，环境监测等。然而，这些化学发光的研究往往都是在体相进行的，能得到的平均结果往往缺乏时间和空间分辨率信息，无法获得更多有效数据。单分子技术的开发突破了以往体相试验的限制，使得物质的观测提升到了单分子水平。所以在单分子尺度上观测化学发光反应并研究其热动力学性质是非常有必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于化学发光的单分子检测方法用于单分子化学反应的直接观测，成像，动力学分析和热力学研究，公开了一种基于化学发光的单分子检测装置及检测分析方法。该方法突破传统的化学发光检测缺乏时空分辨率信息无法达到单分子水平的局限，实现了单个光子的检出和计数，并确定了相关动力学常数和热力学活化能。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明开发了一种基于化学发光的单分子检测装置，所述装置包含电源、温度控制器、加热膜、测温探针、化学发光反应样品池、倒置显微成像显微镜、单光子检测器、主机，所述温度控制器分别与电源、测温探针、加热膜相连，所述加热膜包裹在所述化学发光反应样品池的外侧，所述测温探针插入化学发光反应样品池中，所述倒置显微成像显微镜位于化学发光样品池正下方，且与单光子检测器相连，所述单光子检测器另一端与主机相连。

4、作为进一步的改进，本发明所述的倒置显微成像显微镜中装有高数值孔径(大于1)的油浸显微物镜。

5、作为进一步的改进，本发明所述的单光子检测器为电子倍增相机或互补氧化物半导体相机或光电倍增二极管或雪崩光电二极管,或具有高灵敏度的光电探测器及其阵列。

6、本发明开发了一种基于化学发光的单分子检测分析方法，所述的具体步骤如下：

7、化学发光反应样品池中装有化学发光反应物分子和催化剂分子，温度控制器通过程序设置所需温度，向加热膜导通电流对化学发光反应样品池进行加热，并由所述的测温探针测得化学发光反应样品池实时温度并反馈至温度控制器以保持温度稳定，在化学发光反应样品池中，控制溶液中分子密度，使化学发光反应物分子在催化剂分子的作用下发生碰撞反应从而产生化学发光信号，所述化学发光信号被倒置显微成像显微镜收集并沿光路发送至单光子检测器，所述单光子检测器通过控制采集频率在时间上分离化学发光信号，并经过光电转化步骤将化学发光信号转变成单光子信号，所述主机通过灰度值转化公式分析单光子检测器传来的单光子信号得到单光子计数结果和单光子位置信息。

8、作为进一步的改进，本发明所述的化学发光反应物分子包括化学发光探针分子和氧化物分子，所述的催化剂分子包括溶液中游离的催化剂或固定相催化剂。

9、作为进一步的改进，本发明所述的化学发光反应的开启由化学发光反应物分子和催化剂分子的加入所控制，所述化学发光反应的开启与所述单光子检测器的采集同步进行。

10、作为进一步的改进，本发明所述的控制溶液中分子密度的方法是通过改变化学发光反应池中化学发光反应探针分子浓度和氧化物分子浓度和催化剂分子浓度实现的，通过调节不同的浓度得到不同强度的化学发光信号，并选择适宜浓度分离出空间上孤立的单光子信号，所述的化学发光反应探针分子浓度范围为1pm～1m，所述的氧化物分子浓度范围为1pm～1m，所述的催化剂分子的浓度范围为1pm～1mm。

11、作为进一步的改进，本发明所述的控制检测装置采集频率的方法是通过改变所述单光子检测器采集化学发光信号时的曝光时间实现的，通过调整不同的曝光时间得到时间上孤立的单光子信号，所述的采集时的曝光时间范围为：0.0005s～20s。

12、作为进一步的改进，本发明所述的单光子信号指包括连续时间内不同时刻不同位置的光子所在的像素位置以及像素包含的灰度值信息。

13、本发明的有益效果如下：

14、本发明的技术方案没有激光，自发荧光和电激发造成的任何背景，对探测催化反应非常有利。该方法操作简单，通过单光子信号的采集，处理，分析可以实现动力学模型的研究，以及催化反应动力学参数、热力学活化能的测定，有利于从单分子水平理解化学反应过程并评估催化剂性能，指导催化剂的未来研究。

15、本发明突破传统化学发光体相检测的局限，通过对化学反应输出的单光子进行捕捉和成像实现了单分子水平的具有时间和空间分辨率的化学发光反应的直接观测。

16、本发明利用温度控制器，实现化学发光反应溶液温度的调控和实时监测，可以实现溶液中化学发光反应活化能的测定。

17、本发明利用了含有高数值孔径油浸显微物镜的倒置显微成像显微镜，具有高的光子收集能力和空间分辨率。

18、本发明采用0.0005s～0.005s的低曝光时间，实现了具有时间分辨率的单分子化学发光信号探测。

19、本发明采用1pm～1m的反应物浓度范围，实现了具有空间分辨率的单分子化学发光信号探测。

20、本发明通过光子计数研究了单分子水平催化剂催化化学发光的反应动力学和热力学信息，发现了受增强剂影响的的两种动力学机制的存在，并计算出了单分子水平反应机制的动力学参数和单颗粒水平的热力学活化能。

21、本发明研究了催化剂颗粒上的单分子化学发光反应，分析不同颗粒之间以及单个颗粒上不同位置的反应动力学，揭示了催化剂催化位点的异质性现象。

技术特征：

1.一种基于化学发光的单分子检测装置，其特征在于，所述装置包含电源、温度控制器、加热膜、测温探针、化学发光反应样品池、倒置显微成像显微镜、单光子检测器、主机，所述温度控制器分别与电源、测温探针、加热膜相连，所述加热膜包裹在所述化学发光反应样品池的外侧，所述测温探针插入化学发光反应样品池中，所述倒置显微成像显微镜位于化学发光样品池正下方，且与单光子检测器相连，所述单光子检测器另一端与主机相连。

2.根据权利要求1所述的基于化学发光的单分子检测装置，其特征在于，所述的倒置显微成像显微镜中装有高数值孔径(大于1)的油浸显微物镜。

3.根据权利要求1所述的基于化学发光的单分子检测装置，其特征在于，所述的单光子检测器为电子倍增相机或互补氧化物半导体相机或光电倍增二极管或雪崩光电二极管,或具有高灵敏度的光电探测器及其阵列。

4.一种基于化学发光的单分子检测分析方法，其特征在于，所述的具体步骤如下：

5.根据权利要求4所述的基于化学发光的单分子检测分析方法，其特征在于，所述的化学发光反应物分子包括化学发光探针分子和氧化物分子，所述的催化剂分子包括溶液中游离的催化剂或固定相催化剂。

6.根据权利要求5所述的基于化学发光的单分子检测分析方法，其特征在于，所述化学发光反应的开启由化学发光反应物分子和催化剂分子的加入所控制，所述化学发光反应的开启与所述单光子检测器的采集同步进行。

7.根据权利要求4或5或6所述的基于化学发光的单分子检测分析方法，其特征在于，所述的控制溶液中分子密度的方法是通过改变化学发光反应池中化学发光反应探针分子浓度和氧化物分子浓度和催化剂分子浓度实现的，通过调节不同的浓度得到不同强度的化学发光信号，并选择适宜浓度分离出空间上孤立的单光子信号，所述的化学发光反应探针分子浓度范围为1pm～1m，所述的氧化物分子浓度范围为1pm～1m，所述的催化剂分子的浓度范围为1pm～1mm。

8.根据权利要求7所述的基于化学发光的单分子检测分析方法，其特征在于，所述的控制检测装置采集频率的方法是通过改变所述单光子检测器采集化学发光信号时的曝光时间实现的，通过调整不同的曝光时间得到时间上孤立的单光子信号，所述的采集时的曝光时间范围为：0.0005s～20s。

9.根据权利要求4或5或6或8所述的基于化学发光的单分子检测分析方法，其特征在于，所述的单光子信号指包括连续时间内不同时刻不同位置的光子所在的像素位置以及像素包含的灰度值信息。

技术总结
本发明公开了一种基于化学发光的单分子检测装置及检测分析方法，突破传统化学发光体相检测的局限，通过对化学反应输出的单光子进行捕捉和成像实现了单分子水平的具有时间和空间分辨率的化学发光反应的直接观测，采用0.0005s～0.005s的低曝光时间，实现了具有时间分辨率的单分子化学发光信号探测，采用1pM～1M的反应物浓度范围，实现了具有空间分辨率的单分子化学发光信号探测，通过光子计数研究了单分子水平催化剂催化化学发光的反应动力学和热力学信息，发现了受增强剂影响的的两种动力学机制的存在，并计算出了单分子水平反应机制的动力学参数和单颗粒水平的热力学活化能。

技术研发人员：冯建东,张紫晴
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17