一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法与流程

本发明属于呼吸道合胞病毒检测，具体是指一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒（英文简称：rsv）属副粘液病毒科，肺炎病毒属，是一种下呼吸道感染最主要的rna病毒，rsv感染极广且为母传抗体，因而不能完全预防感染发生，2岁以下儿童感染极为常见且感染率高达97%，rsv主要以3种方式传播：飞沫、直接接触和分泌排泄物，感染后由咳嗽、流鼻涕等上呼吸道症状渐变为下呼吸道感染，引起支气管等病理变化，更为严重的是可引起哮喘、呼吸衰竭等重症表现，目前还没有安全有效的产品应用于rsv的临床治疗，对感染rsv的患儿快速识别并采取有效的预防措施可降低rsv感染患儿的发病率和病率。

2、rsv是一种包膜病毒，含有单链非节段性的负链rna，由一个15.2kb的rsv基因组编码，大小为150-300nm，分为a、b两个亚型。rsv基因组含有10个基因，编码11种蛋白质：三种包膜糖蛋白g、f蛋白（g蛋白负责黏附，f蛋白负责融合和穿膜）、小的疏水蛋白（sh），五种结构性蛋白：l、n（核酸蛋白：在整个复制过程中，n蛋白包住rna，防止其降解）、p、m、m2（其中m2基因编码m2-1、m2-2），以及两个非结构性蛋白ns1、ns24，在病毒粒子表面的三种蛋白质中，只有f蛋白是rsv感染所必需的，在人类血清实验中也证明了f蛋白是中和抗体的主要靶标。

3、目前rsv的常用检测技术有聚合酶链式反应（pcr）-荧光探针法、酶联免疫吸附试验（elisa）、胶体金免疫层析法（gica），其中，pcr-荧光探针法结合了pcr和荧光探针两种技术，具备灵敏度高、漏检率低及特异度高的特点，但该方法需要专业pcr检测实验室和专业检测人员，试验要求严格、成本高，检测时限在3种检测方法中最长，不适合在基层医疗单位推广使用；elisa虽然操作简单，但易造成漏检，不适合临床广泛推广；gica法不仅操作简单、成本低廉、试验要求不高，而且检测时限在三种检测方法中最短，而且阳性检出率高，但是对灵敏度和特异性的要求较高，因此提供一种的特异性好、耐性好且稳定性强的抗体对实现rsv病毒早期检测和诊断具有重要意义。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法，本发明通过自主构建噬菌体展示文库，以高诱导性的rsv-f蛋白为抗原钓取rsv特异性纳米抗体，然后通过基因工程构建rsv特异性纳米抗体真核表达系统获得rsv重组纳米抗体，rsv重组纳米抗体可以特异性识别呼吸道合胞病毒，具有广泛的应用价值，此外，本发明获得的高特异性的rsv重组纳米抗体应用于胶体金平台，从而提高检测的灵敏度和稳定性，降低检测时的假阳率，节省时间和成本。

2、为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了一种基于重组抗体的呼吸道合胞病毒检测方法，所述呼吸道合胞病毒检测方法为使用rsv纳米重组抗体制备的胶体金平台检测生物样品中的呼吸道合胞病毒。

3、优选地，所述生物样品选自感染rsv的体外细胞、鼻分泌物、鼻洗液、咽分泌物、支气管分泌物的一种。

4、进一步地，所述rsv纳米重组抗体至少包含三组互补决定区，所述互补决定区包括seq id no:1所示的cdr1，seq id no:2所示的cdr2和seq id no:3所示的cdr3。

5、进一步地，所述rsv纳米重组抗体包含与seq id no:4中任一序列具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列。

6、优选地，所述rsv纳米重组抗体包含seq id no:4所示的氨基酸序列。

7、进一步地，所述rsv纳米重组抗体包含编码seq id no:4所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seq id no:5所示。

8、此外，本发明还提供了一种核酸分子及其表达调控原件的表达载体，所述核酸分子编码rsv纳米重组抗体。

9、作为本发明进一步地，所述rsv纳米重组抗体还结合至允许其检测的标记，所述标记选自荧光团、生物素、放射性同位素、金属和酶。

10、进一步地，所述胶体金平台包括pvc底板、样品垫、胶体金垫、测试t线、控制c线、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，所述样品垫固定连接于pvc底板的一端，所述吸水滤纸固定连接于pvc底板上远离样品垫的一端，所述胶体金垫设于样品垫的一侧，所述硝酸纤维素膜设于胶体金垫的一侧，所述测试t线设于硝酸纤维素膜上靠近胶体金垫的一侧，所述控制c线设于硝酸纤维素膜上靠近吸水滤纸的一侧。

11、优选地，所述样品垫与胶体金垫之间重叠1-2mm，所述胶体金垫与硝酸纤维素膜之间重叠1-2mm，所述硝酸纤维素膜与吸水滤纸之间重叠1-2mm。

12、优选地，所述胶体金垫中含有使用胶体金标记rsv重组纳米抗体的溶液和抗体，所述测试t线上包被rsv抗原，所述控制c线上包被二抗。

13、优选地，所述抗体选自人igg、鸡igy或小鼠igg的一种，所述二抗包括但不限于鼠抗人igg、羊抗鸡igy和羊抗鼠igg，只要能实现相同功能的现有抗体及对应的二抗均可作为可选择的范围，在此不作限定。

14、优选地，所述硝酸纤维素膜的爬升速度为95s/4cm、120s/4cm或140s/4cm的一种。

15、进一步地，所述胶体金平台的使用方法为将生物样品滴于样品垫上，当生物样品中含有rsv抗原，由于吸水滤纸的吸附作用使生物样品中的抗原与胶体金垫中的rsv重组纳米抗体接触并结合，从而当液体流动至测试t线时，rsv重组纳米抗体无法与测试t线上包被rsv抗原结合，从而不显示颜色，而液体流动至控制c线时，二抗与胶体金标记的人igg、鸡igy或小鼠igg结合，产生颜色；因此当生物样品含有rsv抗原时，测试t线不显色而控制c线显色；当生物样品中不含有rsv抗原时，测试t线显色且控制c线也显色；如控制c线不显色，则表明检测无效。

16、采用上述结构本发明取得的有益效果如下：

17、（1）本发明通过构建噬菌体展示文库，以高诱导性的rsv-f蛋白为抗原钓取rsv特异性纳米抗体，然后通过基因工程构建rsv特异性纳米抗体真核表达系统获得rsv重组纳米抗体，rsv重组纳米抗体具有独特的cdr1、cdr2和cdr3区序列，使所述纳米抗体对rsv-f蛋白具有特异的识别和结合能力，而与其他非特异性交叉反应性蛋白没有反应，具有广泛的应用价值；

18、（2）f蛋白需要通过构象变化来介导病毒包膜和宿主细胞的融合，在宿主细胞膜锚定后，经氨基端糖基化修饰，f0前体被酪氨酸蛋白酶裂解成为由二硫键相连的f1、f2两个亚单位，随后形成三聚体的发夹结构，促进两层膜融合，本发明使用的rsv-f蛋白为构象变化前的蛋白，诱导抗体的效果更佳；

19、（3）本发明对rsv密码子进行优化，更有利于rsv重组纳米抗体的表达，且rsv重组纳米抗体制备简单，进行无需进行血清提取，稳定性更强，提高了生产效率，适用于大批量的进行生产；

20、（4）本发明搭建的胶体金平台可以特异性检测呼吸道合胞病毒，与流感病毒、副流感病毒、呼吸道腺病毒和肺炎支原体无交叉反应，特异性强；

21、（5）本发明使用高稳定性和高特异性的重组抗体应用于胶体金平台，从而提高检测的灵敏度和稳定性，达到简单操作、价格低廉的目的，不需要专业技术人员或大型仪器设备即可实施检测，尤其适合在偏远贫困地区使用；

22、（6）可适用于早期诊断，通过肉眼即可读出检测结果，从而获取更多的相关信息，辅助临床医生给予正确的医疗诊断等，早发现、早诊断、早治疗、早痊愈，具有重要的临床意义。