一种明胶微载体裂解液残留的检测方法

：本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种明胶微载体裂解液残留的检测方法。

背景技术

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背景技术：

1、明胶是近年来发展起来的一种新型细胞培养基质，具有优良的生物相容性和生物降解性，无毒、无免疫原性等优点。它由动物胶原水解得到，可被人体组织吸收和利用。明胶的主要成分是胶原蛋白，与细胞外基质中的胶原蛋白相似，因此能够提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，同时保护细胞不受外界环境的影响，从而提高细胞的生长和分裂速度。

2、明胶微载体的尺寸一般处于微米级，在悬浮培养体系中能够为单层细胞的生长繁殖提供较大的面积。这种微载体材料的设计可以更好地满足细胞生长和繁殖的需求，同时也有利于细胞的形态和功能表达。明胶微载体在细胞培养中具有广泛的应用。它可以作为细胞培养的支架材料，提供细胞生长的三维环境，促进细胞的贴附、生长和增殖。

3、传统的微载体在细胞培养中通常用于收集细胞产物，例如疫苗、蛋白质和病毒。然而，使用传统微载体生产细胞治疗所需的细胞存在一个难题，即在培养后有效地收集微载体上的细胞。在传统微载体的应用领域中，分离细胞时需要使用edta和胰蛋白酶溶液将细胞从微载体表面消化，使细胞与微载体分离。分离后的细胞可通过自然沉降法或筛网过滤去除微载体，然后进行离心和过滤液来获取细胞。然而，这种方法需要进一步的分离步骤，增加了整个生产过程的成本和复杂性。此外，长时间的细胞消化会对细胞造成损伤，因此无法获得高质量的用于治疗的细胞制品已经成为常见问题。另外，如果微载体颗粒不能有效去除，其残留物可能会引起后续细胞制品注射到体内时的安全性问题。

4、为了解决这一问题，我们可以采用明胶微载体和微载体裂解液的组合。通过微载体裂解液对微载体进行裂解，将微载体从固态溶解为液态，从而释放载体上的细胞到溶液中。通过离心的方式，我们可以将细胞与溶液分离，从而获得纯净的细胞样品。与传统方法不同的是，裂解液仅针对微载体进行裂解，对细胞本身温和，保持细胞的活性并保留其自身分泌的蛋白质。这样一来，我们不再需要繁琐的步骤去除微载体颗粒，并且避免了由此产生的安全隐患。

5、然而，引入微载体裂解液也带来了新的挑战。为了确保细胞制剂在临床应用中的安全性，需要对微载体裂解液残留进行检测。目前，有技术采用了荧光修饰明胶的方法，根据荧光显示确定微载体裂解液的残留量。但传统荧光修饰需要专门的定向可修饰荧光基团，成本高，原料受限，修饰之后有些基团会丧失荧光特性从而造成灵敏度下降，还需要进一步的改进。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明要解决的技术问题是传统荧光修饰需要专门的定向可修饰荧光基团，成本高，原料受限，修饰之后有些基团会丧失荧光特性从而造成灵敏度下降，还需要进一步的改进。

2、为解决上述问题，本发明通过包埋的方式，利用包埋物与裂解液反应，产生单独游离的荧光素，即可以实现光谱性应用，不需要用到专门的定向可修饰荧光基团。并且游离基团灵敏度要高于修饰基团，检测效果更准确。

3、为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，一种明胶微载体裂解液残留的检测方法，将包封有荧光素钠的明胶底物与待测样品混合反应(在37℃下反应1-60min)，在吸收波长495nm、发射波长515nm处检测样品的荧光强度，判定待测样品中明胶微载体裂解液的残留程度。若待测样品中含有明胶微载体裂解液，则明胶底物被明胶微载体裂解液催化，包埋在内的荧光素钠会释放出来，其荧光强度与待测样品中胶原酶活性成正比。

4、进一步的，以明胶微载体裂解液配置一系列的标准品溶液，绘制浓度与荧光强度的标准曲线，实现定量检测微载体裂解液的残留浓度。

5、进一步的，所述包封荧光素钠的明胶底物的制备方法，包括以下步骤:

6、(1)连续相配置：将连续相与表面活性剂进行混合，连续相可为正己烷，液体石蜡，植物油，表面活性剂可为span80、span85；

7、(2)分散相和交联剂溶液配置：分别将明胶溶解在水或磷酸盐缓冲液中作为分散相，将交联剂溶解在水或磷酸盐缓冲液中作为交联剂溶液，交联剂可为戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶、edc/nhs；

8、(3)包封荧光素钠的明胶底物制备：将连续相分散均匀后，将分散相与交联剂混合5～300s，迅速置于连续相中100～3000转/min搅拌0～24h。

9、(4)明胶底物的清洗、分离：将乳化体系中的连续相倒出，用乙醇、丙酮溶液和去离子水或其任意比例混合溶液洗涤大孔水凝胶微球，去除残余连续相和表面活性剂，随后可用不同目数的筛网获得不同粒径分布的包封荧光素钠的明胶底物，在避光条件下冷冻干燥备用。

10、进一步的，步骤(1)连续相与表面活性剂的配比为200：1～20(v/v)。

11、进一步的，步骤(2)中分散相的浓度为5～40g/l；交联剂溶液的浓度为5～25g/l。

12、进一步的，步骤(3)中连续相、分散相与交联剂的配比为体积比200：10～50：2.4～12.5。

13、本发明的有益效果在于：

14、(1)本发明利用明胶包埋荧光基团的方式，若待测样品中含有明胶微载体裂解液，则明胶底物被明胶微载体裂解液催化，包埋在内的荧光素钠会释放出来，其荧光强度与待测样品中胶原酶活性成正比，即可实现明胶微载体裂解液的定性和定量检测。

15、(2)本发明利用明胶包埋荧光基团的方式，其制备过程、应用过程不需要避光，制备过程简单，不会出现荧光淬灭。制备得到的包封荧光素钠的明胶底物可永久保留，适应性强。

16、(3)本发明利用包埋在明胶内的荧光基团进行检测，其灵敏度要高于修饰基团，检测效果更准确。

技术特征：

1.一种明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：将包封有荧光素钠的明胶底物与待测样品混合反应，在吸收波长495nm、发射波长515nm处检测样品的荧光强度，判定待测样品中明胶微载体裂解液的残留程度。

2.如权利要求1所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：以明胶微载体裂解液配置一系列的标准品溶液，绘制浓度与荧光强度的标准曲线，实现定量检测微载体裂解液的残留浓度。

3.如权利要求1所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于所述包封荧光素钠的明胶底物的制备方法，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：所述连续相为正己烷、液体石蜡、植物油中的一种或一种以上的混合物，表面活性剂为span80、span85中的一种或一种以上的混合物。

5.如权利要求3所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：所述交联剂为戊二醛、京尼平、谷氨酰胺转氨酶、edc/nhs中的一种或一种以上的混合物。

6.如权利要求3所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：步骤(1)连续相与表面活性剂的配比为体积比200：1～20。

7.如权利要求3所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：步骤(2)中分散相的浓度为5～40g/l；交联剂溶液的浓度为5～25g/l。

8.如权利要求3所述的明胶微载体裂解液残留的检测方法，其特征在于：步骤(3)中连续相、分散相与交联剂的配比为体积比200：10～50：2.4～12.5。

技术总结
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种明胶微载体裂解液残留的检测方法。将包封有荧光素钠的明胶底物与待测样品混合反应，在吸收波长495nm、发射波长515nm处检测样品的荧光强度，判定待测样品中明胶微载体裂解液的残留程度。若待测样品中含有明胶微载体裂解液，则明胶底物被明胶微载体裂解液催化，包埋在内的荧光素钠会释放出来，其荧光强度与待测样品中胶原酶活性成正比。本发明利用包埋物与裂解液反应，产生单独游离的荧光素，即可以实现光谱性应用，不需要用到专门的定向可修饰荧光基团。并且游离基团灵敏度要高于修饰基团，检测效果更准确。

技术研发人员：郑洪伟,薛长湖,周旋,刘烨
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19