大鼠睾丸Leydig祖细胞标志蛋白及其筛选方法和应用

本发明属于生物医学，具体涉及大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、睾丸leydig细胞，又称睾丸间质细胞，主要功能是合成雄激素及胰岛素样因子3(insl3)。睾丸leydig细胞对男性生殖系统的发育、成年生殖功能的维持及精子发生等起到极关键作用。人类成年期睾丸leydig细胞(alcs)主要是在青春期时由睾丸leydig细胞干细胞(stem lc，slc)发育而成。slc向alc发育成熟的流程及调控机理仍然知之甚少。在大鼠中，在3周龄slc已经分化成睾丸leydig祖细胞(plc)，5周龄发育成leydig幼细胞(ilc)，最终在8周龄时完全为发育成熟的alc(见图1)。plc是睾丸leydig细胞发育过程中的关键中间步骤，可见，plc发育情况一定程度上反映睾丸leydig细胞的数量和发育情况。

2、研究plc的生物学功能对研究其分化鉴定和增殖具有重要作用。开发细胞特异性标志蛋白对于掌握对应细胞的数量和增殖情况是一种有效手段。然而遗憾的是plc每个阶段的细胞特征、标志蛋白及其调控机制仍然未知。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，通过单细胞测序、qpcr、免疫印迹及免疫组化手段筛选出在alc发育过程中特异性的出现plc发育时期的3种蛋白，可以作为plc标志蛋白。

2、本发明提供了大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，包括以下一种或两种以上蛋白：slc38a4、cpa1和srd5a1。

3、优选的，所述slc38a4的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、优选的，所述cpa1的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、优选的，所述srd5a1的氨基酸序列如seq id no:3所示。

6、本发明提供了所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白的筛选方法，包括以下步骤：

7、利用乙烯二甲磺酸酯处理雄性大鼠，制备睾丸leydig细胞发育模型，从所述乙烯二甲磺酸酯处理后1周和3周的发育模型中采集睾丸，从睾丸的间质中分离细胞进行单细胞测序，筛选睾丸leydig祖细胞中差异表达基因；

8、以1周至8周的sd雄性大鼠、孕15天至21天的sd孕大鼠中的大鼠胚胎和初生当天大鼠为对象，分离睾丸，以睾丸组织为材料，采用qpcr验证所述差异表达基因，采用免疫印迹和免疫组化检测方法验证所述差异表达基因对应的蛋白，当验证结果一致时，以所述睾丸leydig祖细胞中差异表达基因对应的蛋白为大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白。

9、优选的，所述睾丸leydig祖细胞中差异表达基因包括slc38a4、cpa1和srd5a1；

10、优选的，所述slc38a4的qpcr检测引物包括核苷酸序列如seq id no:4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:5所示的反向引物；

11、所述cpa1的qpcr检测引物包括核苷酸序列如seq id no:6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7所示的反向引物；

12、所述srd5a1的qpcr检测引物包括核苷酸序列如seq id no:8所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:9所示的反向引物。

13、本发明提供了所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白或所述筛选方法得到的大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白在鉴定或筛选大鼠睾丸leydig祖细胞中的应用。

14、本发明提供了大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，包括以下至少两种蛋白：slc38a4、cpa1和srd5a1。本发明利用乙烯二甲磺酸酯(eds)处理大鼠，作为alc发育模型，在eds处理1周及3周后取睾丸，收集分离的睾丸中间充质里面的细胞进行单细胞测序，筛选plc阶段特异表达基因，同时对1周至8周龄发育阶段的sd雄性大鼠睾丸、孕15天至21天大鼠中胚胎和初生当天大鼠为对象，取睾丸，以rt-qpcr、wb及免疫组化技术，对eds实验单细胞测序所筛选出的特异基因进行验证。结果表明，单细胞测序分析发现eds处理1周后alc消失，3周后leydig细胞(plc阶段)出现；plc阶段特异表达基因除开始表达类固醇合成基因外，也一过性地高表达slc38a4、cpa1和srd5a1，同时免疫组化和免疫印迹检测结果与rt-qpcr检测结果一致，因此，可见，slc38a4、cpa1和srd5a1作为具有良好的特异性和灵敏性，可以作为大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白用于后续研究的鉴定和检测。

技术特征：

1.大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，其特征在于，包括以下一种或两种以上蛋白：slc38a4、cpa1和srd5a1。

2.根据权利要求1所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，其特征在于，所述slc38a4的氨基酸序列如seq id no:1所示。

3.根据权利要求1所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，其特征在于，所述cpa1的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4.根据权利要求1所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白，其特征在于，所述srd5a1的氨基酸序列如seq id no:3所示。

5.权利要求1～4中任意一项所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述睾丸leydig祖细胞中差异表达基因包括slc38a4、cpa1和srd5a1。

7.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述slc38a4的qpcr检测引物包括核苷酸序列如seq id no:4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:5所示的反向引物。

8.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述cpa1的qpcr检测引物包括核苷酸序列如seq id no:6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:7所示的反向引物。

9.根据权利要求5所述筛选方法，其特征在于，所述srd5a1的qpcr检测引物包括核苷酸序列如seq id no:8所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:9所示的反向引物。

10.权利要求1～4中任意一项所述大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白或权利要求5～9中任意一项所述筛选方法得到的大鼠睾丸leydig祖细胞标志蛋白在鉴定或筛选大鼠睾丸leydig祖细胞中的应用。

技术总结
本发明提供了大鼠睾丸Leydig祖细胞标志蛋白及其筛选方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明利用乙烯二甲磺酸酯处理雄性大鼠，制备睾丸Leydig细胞发育模型，从所述乙烯二甲磺酸酯处理后1周和3周的发育模型中采集睾丸，从睾丸的间质中分离细胞进行单细胞测序，筛选睾丸Leydig祖细胞中差异表达基因；以1周至8周的SD雄性大鼠、孕15天至21天的SD孕大鼠中的大鼠胚胎和初生当天大鼠为对象，分离睾丸，采用RT‑qPCR、免疫印迹和免疫组化检测方法验证，筛选得到大鼠睾丸Leydig祖细胞标志蛋白，包括SLC38A4、CPA1和SRD5A1，可应用于鉴定或筛选大鼠睾丸Leydig祖细胞。

技术研发人员：管小菊,陈浩林,陈聪德,袁启超,杨紫晗,洪扬刚,徐培宇
受保护的技术使用者：温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4