一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法

本发明属于生物成像，具体涉及一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法。

背景技术：

1、为了研究生物组织样本的结构与功能，获取精细结构，光学成像是获取生物组织高分辨结构信息的有效手段。但光在组织中的散射特性使其难以穿透深层组织，限制了光学成像在大体积样本的应用。未解决这一问题，发展了两种样本处理结合成像技术，从一定程度上减少组织光散射的干扰。一种是通过透明化处理样本，减少组织中脂质等吸光物质以及高散射物质，通过使用与处理完样本折射率相近的高折射率匹配液从而实现完整组织的三维成像；另一种方法是通过包埋介质包埋，为组织提供硬度支撑和力学特性，结合机械切削，在样本表层成像，避免直接对深度组织成像时的强散射干扰，最后通过数据处理三维重建获取完整样本结构信息。

2、组织透明化虽然可以获取完整组织三维结构信息，但处理的时间周期较长，同时存在样本变形、内源荧光信号损失等问题。目前常见的包埋方式有很多：石蜡、树脂、水凝胶等。通常会根据处理样本的类型和制片方法选择不同的包埋剂。为了获取较薄切片，通常选择石蜡、树脂等包埋方式，但由于石蜡、树脂包埋需要经过脱水等步骤，比较复杂。对于包埋现有的生物组织包埋方法包埋时间长，还会涉及到脱水、复水等步骤，此过程易造成生物组织形变，例如石蜡包埋、树脂包埋。现有的水凝胶包埋材料多采用pnaga水凝胶，但是该水凝胶单体需要经过复杂的制备和提纯才能得到；且现有的包埋样本模具在包埋过程中无法控制样本方位，需要修块等方式矫正生物样本的位置。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法。

2、本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，它包括以下步骤：

3、s1.制备ham水凝胶：

4、将n-(羟甲基)丙烯酰胺或n-(羟乙基)丙烯酰胺加入到溶剂中，制成浓度为20～50wt％的ham水凝胶单体溶液；其中，所述溶剂为ph为7～9的水溶液或磷酸盐缓冲液；

5、向ham水凝胶单体溶液中加入交联剂和引发剂，充分混匀，制得ham水凝胶预聚溶液；其中，ham水凝胶单体溶液、交联剂与引发剂的重量比为20～50:0.1～1:0.05～0.5；

6、s2.生物组织处理：将待处理的生物组织固定漂洗后在ham水凝胶预聚溶液中渗透2～48h；s3.包埋：将渗透后的生物组织放入方向定位模具中用3～6wt％琼脂糖进行包埋，其中，所述方向定位模具包括底座、主体和内置挡板，所述主体为由五面组成的中空长方体，上端开口，所述底座与主体通过设置在底座和主体底面的卯榫结构(3)连接；所述内置挡板包括横挡板和竖挡板，横挡板和竖挡板将主体的内部空间分成小格。

7、本发明中，ham水凝胶预聚溶液配制好后，可在4℃存放6-8个月。生物组织处理的处理时间长短与生物组织的大小有关，生物组织体积越大，处理时间越长。生物组织样本为小鼠脑、小鼠外周器官等，可以选用转基因小鼠。

8、进一步地，所述交联剂为甘油-二烯丙基醚、n,n′-亚甲基双丙烯酰胺、1,3-二烯丙基脲或n,n'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺中的至少一种，浓度为1～5wt％。

9、进一步地，所述引发剂为过硫酸铵或偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐中的至少一种，浓度为0.05～0.5wt％。

10、进一步地，所述固定漂洗的是采用2～6wt％的pfa固定，用pbs进行漂洗。

11、进一步地，所述方向定位模具在使用前在-20℃或4℃中进行冷藏处理。

12、进一步地，所述包埋的具体操作为：将55～65℃的琼脂糖倒入方向定位模具中，然后迅速将渗透后的生物组织放入模具中，并调整好方向。低于55℃琼脂糖易快速凝固，可能造成生物组织还未确定好方位就凝固；高于65℃可能会对生物组织样本热损伤。底部和四周的琼脂糖经过模具预冷会先行凝固，这样可以避免样本包埋时贴壁。

13、进一步地，所述主体的四个侧面内部设置有竖直的卡槽，所述横挡板和竖挡板的两端设置有与卡槽相匹配的卡条，所述竖挡板的两面也设置有与横挡板卡条相匹配的卡槽。

14、进一步地，所述底座为不锈钢材质，主体为防冻透明塑料，所述内置挡板为防冻透明硅胶。

15、进一步地，所述主体的侧面边缘设有刻度线。可依据包埋生物组织样本的大小，确定尺寸。

16、本发明具有以下优点：本发明公开了一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，采用ham水凝胶进行包埋，ham水凝胶的单体获取途径简单，同时分子更小，更易通过渗透进入生物组织内部；本发明还公开了一种方向定位模具，解决了普通包埋样本模具在包埋过程中无法控制样本方位，包埋后需要修块等方式矫正生物样本位置的问题，方向定位模具可根据样本大小和需求，任意变化大小，同时可实现单个或多个样本同时包埋，还能固定样本的方位，适用于多种包埋场景。本发明公开的包埋方法制备工艺简单，可以固定样本包埋的方位，与此同时包埋后的样本切削性能稳定，适用于内源荧光样本等多种生物样本。

技术特征：

1.一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，它包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述交联剂为甘油-二烯丙基醚、n,n′-亚甲基双丙烯酰胺、1,3-二烯丙基脲或n,n'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述引发剂为过硫酸铵或偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述固定漂洗的是采用2～6wt％的pfa固定，用pbs进行漂洗。

5.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述方向定位模具在使用前在-20℃或4℃中进行冷藏处理。

6.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述包埋的具体操作为：将55～65℃的琼脂糖倒入方向定位模具中，然后迅速将渗透后的生物组织放入模具中，并调整好方向。

7.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述主体(2)的四个侧面内部设置有竖直的卡槽，所述横挡板(4)和竖挡板(5)的两端设置有与卡槽相匹配的卡条，所述竖挡板(5)的两面也设置有与横挡板(4)卡条相匹配的卡槽。

8.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述底座(1)为不锈钢材质，主体(2)为防冻透明塑料，所述内置挡板为防冻透明硅胶。

9.根据权利要求1所述的一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法，其特征在于，所述主体(2)的侧面边缘设有刻度线(6)。

技术总结
本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种可控制生物组织样本方位的水凝胶包埋方法。包括制备HAM水凝胶、生物组织处理和包埋。采用HAM水凝胶进行包埋，HAM水凝胶的单体获取途径简单，同时分子更小，更易通过渗透进入生物组织内部；本发明还公开了一种方向定位模具，解决了普通包埋样本模具在包埋过程中无法控制样本方位，包埋后需要修块等方式矫正生物样本位置的问题，方向定位模具可根据样本大小和需求，任意变化大小，同时可实现单个或多个样本同时包埋，还能固定样本的方位，适用于多种包埋场景。本发明公开的包埋方法制备工艺简单，可以固定样本包埋的方位，与此同时包埋后的样本切削性能稳定，适用于内源荧光样本等多种生物样本。

技术研发人员：王小俊,罗雅馨,王亚龙,韩建华,何治国
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21