一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法与流程

本发明属于血型检测，具体涉及一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法。

背景技术：

1、免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。标记微球的种类有多种，包括聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、乳胶微球、荧光微球等。常见的标记抗原或抗体的过程中，由于样品孔之间存在空隙，而抗原或抗体会被吸附在其中，进而产生较多非特异性的信号，从而影响实验的准确性。

2、目前使用微球（例如常见的荧光微球）来标记抗原或抗体的实验过程中，往往需要使用惰性分子将微球进行封闭，其目的是将微球表面的非特异位点堵住，避免微球与其他物质的非特异性结合。常见的惰性分子包括bsa，其工作浓度通常较高。例如，公开号为cn111077315a（公开日20200428），发明名称为“一种荧光微球与抗体的偶联方法”的中国专利公开一种含20%bsa的封闭液。该专利主要是通过控制抗体与荧光微球的添加量，以及控制荧光微腔的粒径等来提高偶联效率及偶联强度，而封闭液本身对于微球的特异性封闭效果并不理想。

3、公开号为cn116087501a（公开日20230509），发明名称为“微球封闭试剂和试剂盒”的中国专利公开了一种包含第一封闭液和第二封闭液的微球封闭试剂，该专利对封闭液的成分进行了优化。但专利需要额外引入动物igg抗体来封闭微球表面的非特异性位点，因此成本较高；此外igg抗体本身的保存条件要求也更高。

4、实际应用中对于好的封闭液的要求包括能够封闭微球上所有未结合的位点而不替换上面已经结合的靶蛋白，同时还要做到不结合靶蛋白的表位以及不与后续抗体或检测试剂发生交叉反应。但现有技术里仅依靠封闭液本身成分能够同时满足上述条件依然具有较大的技术难度，或者需要较高的工艺成本。因此，仍有必要提出新的方法策略，以缓解现有技术的不足。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法，具体技术方案如下。

2、一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液，所述封闭液包括羊血清、乙醇胺、tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的klh（血蓝蛋白）、casein（酪蛋白）、ova（卵白蛋白）或pva（聚乙烯醇）中的一种或多种。

3、进一步，所述封闭液包括1%-5%羊血清、0.5%-2%乙醇胺、0.01%-0.05% tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的klh（血蓝蛋白）、casein（酪蛋白）、ova（卵白蛋白）或pva（聚乙烯醇）中的一种或多种。

4、进一步，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mm tris缓冲液，以及0.3%-0.9% klh（血蓝蛋白）、0.3%-0.9% casein（酪蛋白）、0.3%-0.9% ova（卵白蛋白）或0.3%-0.9% pva（聚乙烯醇）中的一种或多种。

5、进一步，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mm tris缓冲液，以及0.3%-0.9% klh（血蓝蛋白）、0.3%-0.9% casein（酪蛋白）、0.3%-0.9% ova（卵白蛋白）或0.3%-0.9% pva（聚乙烯醇）中的任意一种。

6、进一步，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mm tris缓冲液，以及0.3%-0.9% klh（血蓝蛋白）。

7、进一步，所述封闭液进一步包括2% 羊血清、1% 乙醇胺和0.01% tween-20。

8、一种封闭抗原-微球指示系统的方法，包括以下步骤：

9、s01：将微球加入mes溶液中混匀；

10、s02：进一步加入nhs和edc，旋转，使微球活化；

11、s03：在活化的微球体系（包括微球和溶液）中加入红细胞血型抗原，超声，旋转反应1-2h，使所述微球标记所述红细胞血型抗原形成抗原-微球指示系统；

12、s04：加入上述的封闭液与所述抗原-微球指示系统混合均匀后共孵育1-2h，所述封闭液对微球表面的非特异位点进行封闭；

13、s05：封闭结束后离心，分离出完成封闭的抗原-微球指示系统进行保存。

14、进一步，s04中加入的封闭液与抗原-微球指示系统的比例为1ml封闭液封闭10mg微球。

15、进一步，所述红细胞血型抗原包括a抗原和b抗原。

16、由上述方法封闭的抗原-微球指示系统在制备侧向免疫层析试剂盒、免疫渗滤试剂盒和/或免疫比浊试剂盒中的应用。

17、有益技术效果

18、1）本发明提供的封闭液可以有效的封闭微球表面上未与红细胞血型抗原结合的位点，从而阻断非特异反应，血型抗原除了和对应的抗体结合，不会和其它非特异性物质结合。从而使微球标记抗原后形成的抗原-微球指示系统的灵敏度和特异性都提高。本发明重点对封闭液中惰性封闭组合物的组成进行了筛选，采用比浊法检测封闭液的封闭效果。其中n值代表阴性孔的od值；n值越小，说明血型抗原和抗体结合特异性越好；p/n越大，说明反应的灵敏度越高。本发明优选成分的封闭液封闭后的红细胞血型抗原-微球指示系统可以达到检测时n值小于0.3，p/n值大于5.0的效果，以此作为确定优选惰性封闭组合物组成的指标。

19、2）本发明采用的惰性封闭组合物中的惰性分子（klh、casein、ova或pva）均为低浓度，最高浓度为不大于0.9%。进一步复配其他的溶剂成分，实现了对微球的有效封堵，且不与反应体系中其他试剂成分发生交叉反应，特别是当用于封闭微球标记的人工合成的血型抗原-蛋白偶联物指示系统时，低浓度的惰性封闭组合物不会干扰偶联的蛋白成分和干扰检测结果，且不会替换微球表面标记的靶蛋白。相较于现有技术中常用的高浓度单一惰性分子（如，20% bsa），本发明的低浓度封闭液对蛋白的作用更加稳定。

20、3）本发明创新性的使用了klh作为惰性封闭组合物中的核心成分，其封闭效果最优。

技术特征：

1.一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括羊血清、乙醇胺、tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的klh、casein、ova或pva中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的封闭液，其特征在于，所述封闭液包括1%-5%羊血清、0.5%-2%乙醇胺、0.01%-0.05% tween-20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的klh、casein、ova或pva中的一种或多种。

3.如权利要求2所述的封闭液，其特征在于，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mm tris缓冲液，以及0.3%-0.9% klh、0.3%-0.9% casein、0.3%-0.9% ova或0.3%-0.9% pva0中的一种或多种。

4.如权利要求2所述的封闭液，其特征在于，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mm tris缓冲液，以及0.3%-0.9% klh、0.3%-0.9% casein、0.3%-0.9% ova或0.3%-0.9% pva中的任意一种。

5.如权利要求4所述的封闭液，其特征在于，所述惰性封闭组合物包括0.01%-0.05% 甘油和50-100mm tris缓冲液，以及0.3%-0.9% klh。

6.如权利要求5所述的封闭液，其特征在于，所述封闭液进一步包括2% 羊血清、1% 乙醇胺和0.01% tween-20。

7.一种封闭抗原-微球指示系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，s04中加入的封闭液与抗原-微球指示系统的比例为1ml封闭液封闭10mg微球。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述红细胞血型抗原包括a抗原和b抗原。

10.权利要求7或8所述的方法封闭的抗原-微球指示系统在制备侧向免疫层析试剂盒、免疫渗滤试剂盒和/或免疫比浊试剂盒中的应用。

技术总结
本发明属于血型检测技术领域，具体涉及一种用于封闭抗原‑微球指示系统的封闭液及封闭方法。本发明提供的封闭液包括羊血清、乙醇胺、Tween‑20和惰性封闭组合物；所述惰性封闭组合物包括甘油和Tris缓冲液，以及浓度不大于0.9%的KLH、Casein、OVA或PVA中的一种或多种。该封闭液可以使微球标记红细胞血型抗原后形成的抗原‑微球指示系统的灵敏度和特异性都提高。

技术研发人员：庞伟,魏立巧,黄志刚,王伟权,王秀柱,郝进学,王丽
受保护的技术使用者：天津德祥生物技术股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1