分析用试样的制备方法及分析方法与流程

本发明涉及分析用试样的制备方法及分析方法。

背景技术：

1、唾液酸也包含于生物体内的糖蛋白中，这种情况下主要存在于糖链末端。唾液酸容易配置在糖蛋白分子的外侧，因此容易参与到其它分子的识别中。唾液酸与邻接的糖之间的结合方式有时各不相同。例如，已知在人的n-结合型糖链中主要是α2,3-及α2,6-，在o-结合型糖链及鞘糖脂中除了这些以外已知还有α2,8-及α2,9-的结合方式。结合方式的不同可导致唾液酸被不同的分子识别、可具有不同的作用，因此唾液酸结合方式的解析很重要。

2、但是，唾液酸具有负电荷且唾液酸容易分解，因此含有唾液酸的唾液酸基糖链的解析并非易事。另外，唾液酸结合方式的不同不会改变糖链的质量，因此无法利用质谱分析对结合方式进行区别、解析。

3、为了对唾液酸结合方式进行区别、解析，提出了对唾液酸进行结合方式特异性修饰的方法。该方法利用α2,3-唾液酸相较于α2,6-唾液酸而言更容易因脱水缩合剂而发生分子内脱水的性质，使α2,3-唾液酸通过分子内脱水而内酯化，并且使α2,6-唾液酸与醇或胺等亲核剂反应。由此，根据唾液酸结合方式而生成质量不同的分子，从而能够通过质谱分析对唾液酸结合方式进行区别、解析。非专利文献1公开了一种用于质谱分析的试样制备方法，其中，对游离出的n-结合型糖链添加含有异丙胺和脱水缩合剂的溶液而对α2,3-唾液酸进行内酯化、对α2,6-唾液酸进行酰胺化。

4、现有技术文献

5、非专利文献

6、非专利文献1：nishikaze t.,tsumoto h.,sekiya s.,iwamoto s.,miura y.,tanaka k.,analytical chemistry,2017,89,2353-2360.

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、本发明人们发现，在对唾液酸结合方式进行解析时，存在α2,6-唾液酸与α2,3-唾液酸的判别精度下降的情况。认为这是由于，对从糖蛋白游离出的o-结合型糖链进行唾液酸结合方式特异性修饰(酰胺化)时，o-结合型糖链的还原末端的n-乙酰基半乳糖胺(galnac)上所结合的α2,6-唾液酸没有被正确地修饰，一部分进行了与α2,3-唾液酸同样的反应。本发明是鉴于上述情况做出的，目的在于，能够对o-结合型糖链上所连接的α2,6-唾液酸和α2,3-唾液酸进行区别、修饰，并且使进行了结合方式特异性修饰的o-结合型糖链从糖蛋白游离并高精度地进行分析。

3、用于解决问题的方案

4、本发明涉及：

5、一种对进行了唾液酸结合方式特异性修饰的o-结合型糖链进行分析的方法，其包括：

6、修饰步骤，对包含结合上述o-结合型糖链的糖蛋白的样品添加能对上述o-结合型糖链进行唾液酸结合方式特异性修饰的修饰剂；

7、游离步骤，使进行了上述唾液酸结合方式特异性修饰的o-结合型糖链从上述糖蛋白游离；和

8、分析步骤，对游离出的进行了上述唾液酸结合方式特异性修饰的o-结合型糖链进行分析。

9、发明的效果

10、根据本发明，能够对o-结合型糖链上所连接的α2,6-唾液酸和α2,3-唾液酸进行区别、修饰，能够使进行了结合方式特异性修饰的o-结合型糖链从糖蛋白游离并高精度地进行分析。

技术特征：

1.一种对进行了唾液酸结合方式特异性修饰的o-结合型糖链进行分析的方法，其包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述唾液酸结合方式特异性修饰包括第1反应，所述第1反应对唾液酸进行内酯化。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述唾液酸结合方式特异性修饰还包括第2反应，所述第2反应用于对通过所述第1反应而得到的内酯结构进行酰胺化。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，使用包含选自由氨、胺及它们的盐组成的组中的至少1种的溶液进行所述第2反应。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述第2反应为氨解反应。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述第2反应后的唾液酸受到了质量因结合方式而不同的修饰。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述唾液酸结合方式包括α-2,3唾液酸及α-2,6唾液酸。

8.根据权利要求2或3所述的方法，其中，对所述样品添加包含脱水缩合剂的溶液，进行所述第1反应。

9.根据权利要求2或3所述的方法，其中，α-2,6唾液酸在所述第1反应后被酰胺化。

10.根据权利要求2或3所述的方法，其中，还包括在所述第1反应之后通过蛋白质沉淀法纯化所述糖蛋白的步骤。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过β消除反应或肼解反应使所述糖链从所述糖蛋白游离。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在ph11.0以下进行所述β消除反应。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中，还包括利用固相载体来纯化所述游离出的糖链的步骤。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述分析包括选自由质谱分析、色谱及电泳组成的组中的至少1种。

技术总结
一种对进行了唾液酸结合方式特异性修饰的O‑结合型糖链进行分析的方法，其包括：修饰步骤，对包含结合所述O‑结合型糖链的糖蛋白的样品添加能对所述O‑结合型糖链进行唾液酸结合方式特异性修饰的修饰剂；游离步骤，使进行了所述唾液酸结合方式特异性修饰的O‑结合型糖链从所述糖蛋白游离；和，分析步骤，对游离出的进行了所述唾液酸结合方式特异性修饰的O‑结合型糖链进行分析。

技术研发人员：西风隆司,古川润一,花松久寿
受保护的技术使用者：株式会社岛津制作所
技术研发日：
技术公布日：2025/2/5