高迁移率族蛋白1检测试剂盒及其检测方法、强直性脊柱炎患者治疗后评估方法

本发明涉及生物检测，尤其涉及高迁移率族蛋白1检测试剂盒及其检测方法、强直性脊柱炎患者治疗后评估方法。

背景技术：

1、强直性脊柱炎(as)是一种慢性炎症性疾病，主要累及骶髂关节和脊柱，也可累及非对称性下肢外周关节、足底等附着点，甚至可以有关节外表现包括银屑病、葡萄膜炎和炎症性肠病等。2014年首次提出as达标治疗(treat-to-target，t2t)，as的常用临床评价指标包括巴氏as疾病活动性指数(bath as disease activity index，basdai)、as疾病活动性评分(as diease activity score，asdas)和改善标准(asas20和asas40)。强直性脊柱炎监测疾病控制的血清指标有限，包括hla-b27阳性、c反应蛋白(c-reactive protein，crp)升高和急性期反应物升高，但相当比例的as患者呈hla-b27阴性，且疾病活动时并未出现急性期反应物升高，因此，目前仍缺乏有临床意义的as相关疾病活动和结构损伤相关标志物。

2、高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，hmgb1)是一种促炎介质，在无菌损伤或微生物入侵后，刺激先天性和适应性免疫系统，参与多种急性和慢性炎症过程。hmgb1已被认为与许多自身免疫性疾病的发病机制有关。研究表明，as患者的血清hmgb1水平明显高于健康人群，与basdai、巴氏as功能性指数(basfi)、红细胞沉降率(esr)、crp、asdas-esr和asdas-crp呈正相关，而与hla-b27、前葡萄膜炎、复发性腹泻无关。但是血清hmgb1水平检测被指出检测数据可能偏离实际值，as患者的血清样本的稀释比例以及检测浓度范围在现有研究中尚存在争议。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题在于，提供一种高迁移率族蛋白1检测试剂盒及其检测方法、强直性脊柱炎患者治疗后评估方法。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种高迁移率族蛋白1检测试剂盒，检测试剂盒包括高迁移率族蛋白1标准品、洗涤液、抗体稀释液、检测抗体、偶联二抗和终止液，洗涤液和抗体稀释液均为磷酸盐吐温缓冲液，检测抗体为人高迁移率族蛋白1抗体，偶联二抗为辣根过氧化物酶偶联的人高迁移率族蛋白1抗体，终止液为1-3mol/l硫酸。

3、优选地，磷酸盐吐温缓冲液含有0.03-0.07％吐温-20，磷酸盐吐温缓冲液的ph为7.3-7.5。

4、一种上述高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

5、s1、配制标准液：将高迁移率族蛋白1标准品溶解于磷酸盐吐温缓冲液，配制成具有梯度浓度的若干标准液，若干标准液的浓度均为0-2000pg/ml；

6、s2、加样：分别取80-120μl若干标准液和80-120μl待测血浆样本，进行第一次孵育；

7、s3、加检测抗体：弃去s2步骤的孵育液，并加入150-250μl洗涤液，洗涤2-4次，随后加入80-120μl用抗体稀释液稀释后的检测抗体，进行第二次孵育；

8、s4、加偶联二抗：弃去s3步骤的孵育液，并加入150-250μl洗涤液，洗涤3-5次，随后加入80-120μl用抗体稀释液稀释后的偶联二抗，进行第三次孵育；

9、s5、测定：弃去s4步骤的孵育液，并加入150-250μl洗涤液，洗涤3-5次，随后加入40-60μl终止液，并测定吸光度，对吸光度和对应的标准液浓度进行线性拟合，获得待测血浆样本的高迁移率族蛋白1浓度。

10、优选地，检测抗体和抗体稀释液以体积比为1:(500-1500)进行混合，偶联二抗和抗体稀释液以体积比为1:(500-1500)进行混合。

11、优选地，s2步骤中，第一次孵育为35-39℃孵育1-2h。

12、优选地，s3步骤中，第二次孵育为室温孵育0.5-1.5h。

13、优选地，s4步骤中，第三次孵育为室温孵育0.3-1h。

14、一种强直性脊柱炎患者治疗后评估方法，包括以下步骤：

15、a、准备待测血浆样本：对治疗后的强直性脊柱炎患者进行抗凝采血，采血后在30min内将血样进行离心，随后在2-6℃将离心后的上层血浆进行0.3-0.7ml分装，得到待测血浆样本，待测血浆样本在-90～-70℃下保存；

16、b、检测：采用上述高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，对待测血浆样本进行高迁移率族蛋白1浓度检测；

17、c、评估：将待测血浆样本与正常人血浆的高迁移率族蛋白1浓度进行对比，评估待测血浆样本中的高迁移率族蛋白1水平。

18、优选地，a步骤中，离心操作的离心力为800-1500g，离心时间为10-20min。

19、优选地，评估方法还包括d步骤：

20、d、治疗达标评定：结合正常人血浆与治疗达标的强直性脊柱炎患者血浆的高迁移率族蛋白1浓度，确定治疗达标的强直性脊柱炎患者血浆中的高迁移率族蛋白1的浓度临界值，若待测血浆样本中的高迁移率族蛋白1浓度低于浓度临界值，则强直性脊柱炎患者治疗达标。

21、本发明的有益效果：

22、本发明的高迁移率族蛋白1检测试剂盒包括高迁移率族蛋白1标准品、洗涤液、抗体稀释液、检测抗体、偶联二抗和终止液，试剂配方简单，试剂容易获得，生产成本低，可推广至大规模生产。

23、本发明的高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，采用本发明的检测试剂盒进行高迁移率族蛋白1浓度检测，操作方法简单方便，样本检测可重复性强，检测准确性高，可用于as患者的血浆高迁移率族蛋白1浓度检测。

24、本发明的强直性脊柱炎患者治疗后评估方法，以hmgb1蛋白作为标志物，采用本发明的检测方法检测as患者的血浆hmgb1水平，评估as患者治疗后疾病活动达标，治疗达标的as患者的hmgb1水平明显低下，与健康人群的血浆hmgb1水平具有明显差异，评估方法的诊断准确性高，可行性好。

技术特征：

1.一种高迁移率族蛋白1检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括高迁移率族蛋白1标准品、洗涤液、抗体稀释液、检测抗体、偶联二抗和终止液，所述洗涤液和所述抗体稀释液均为磷酸盐吐温缓冲液，所述检测抗体为人高迁移率族蛋白1抗体，所述偶联二抗为辣根过氧化物酶偶联的人高迁移率族蛋白1抗体，所述终止液为1-3mol/l硫酸。

2.根据权利要求1所述的高迁移率族蛋白1检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐吐温缓冲液含有0.03-0.07％吐温-20，所述磷酸盐吐温缓冲液的ph为7.3-7.5。

3.一种权利要求1或2所述的高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测抗体和所述抗体稀释液以体积比为1:(500-1500)进行混合，所述偶联二抗和所述抗体稀释液以体积比为1:(500-1500)进行混合。

5.根据权利要求3所述的高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，其特征在于，s2步骤中，第一次孵育为35-39℃孵育1-2h。

6.根据权利要求3所述的高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，其特征在于，s3步骤中，第二次孵育为室温孵育0.5-1.5h。

7.根据权利要求3所述的高迁移率族蛋白1检测试剂盒的检测方法，其特征在于，s4步骤中，第三次孵育为室温孵育0.3-1h。

8.一种强直性脊柱炎患者治疗后评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的强直性脊柱炎患者治疗后评估方法，其特征在于，a步骤中，离心操作的离心力为800-1500g，离心时间为10-20min。

10.根据权利要求8所述的强直性脊柱炎患者治疗后评估方法，其特征在于，所述评估方法还包括d步骤：

技术总结
本发明公开了一种高迁移率族蛋白1检测试剂盒及其检测方法、强直性脊柱炎患者治疗后评估方法，检测试剂盒包括高迁移率族蛋白1标准品、洗涤液、抗体稀释液、检测抗体、偶联二抗和终止液，洗涤液和抗体稀释液均为磷酸盐吐温缓冲液，检测抗体为人高迁移率族蛋白1抗体，偶联二抗为辣根过氧化物酶偶联的人高迁移率族蛋白1抗体，终止液为1‑3mol/L硫酸；检测方法：S1、配制标准液、S2、加样、S3、加检测抗体、S4、加偶联二抗、S5、测定；评估方法：A、准备待测血浆样本、B、检测、C、评估。本发明通过检测血浆HMGB1浓度，评估AS患者治疗后疾病活动达标，样本检测可重复性强，诊断准确性高，可行性好。

技术研发人员：黄进贤,孙天浩,扶忠超
受保护的技术使用者：香港大学深圳医院
技术研发日：
技术公布日：2024/6/30