一种乳制品中碱性蛋白的检测方法与流程

本申请属于检测分析，尤其涉及一种乳制品中碱性蛋白的检测方法。

背景技术：

1、碱性蛋白指的是乳中存在的一些含量极低或寡量的蛋白质，尽管它们的含量很少，但在生物调控等方面具有极其重要的生物学功能，如乳铁蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素和内源性酶等，它们大多以结合态或非活性结构形式存在，难以分离和精准定量。

2、乳中提取的乳清蛋白和酶，包含碱性蛋白如乳铁蛋白、乳过氧化物酶、免疫球蛋白、核糖核酸酶和血管生成素等众多活性物质，在保护细胞免受有害细菌和病毒感染的过程中发挥重要作用，具有抗炎特性，可以调节炎症问题。有研究表明，低丰度活性蛋白，具有最大化的功能性和健康益处，远比它的任何单一成分更有效，碱性蛋白部分项目有检测方法，但是只能单独检测，无法进行全部组分分析。目前已有的检测试剂盒，能够增加检测到碱性蛋白的几率，但还是要依据产品成分进行选择。

3、近年来蛋白质组学的发展为碱性蛋白检测提供支持。蛋白质组学可以被用于研究牛奶、乳清、酪蛋白和乳糜等蛋白质组分的表达、结构、功能和相互作用，评估其功能和质量，并探索其在营养和健康方面的作用。有研究报道了通过二维凝胶分离电泳分析热加工过程对乳中碱性蛋白的影响，但是利用二维电泳计数鉴定出的蛋白数目较少，未能全面揭示乳中碱性蛋白的组成。随着高分辨率质谱与液相技术的联用和推广，鉴定到的乳中的蛋白种类高达1000种，影响乳中的蛋白质组成的影响因素有很多，如物种、产奶季节、饲料、哺乳期、胎次等。目前针对乳中碱性蛋白的研究只要集中在乳清和乳脂肪球膜组分中，且大量的研究主要集中在比较不同物种之间以及不同哺乳期间乳中蛋白组分的差异。同时，乳中的高丰度蛋白往往会屏蔽碱性蛋白的响应信号，导致测试结果出现偏差，不能准确实现对其定性和定量。研究碱性蛋白时，往往需要把这些高丰度蛋白去除或者通过某种形式富集碱性蛋白，同时这也加大乳中蛋白质研究的复杂性。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种乳制品中碱性蛋白的检测方法，旨在解决碱性蛋白只能单独检测，无法进行全部组分的精确分析的问题。

2、为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

3、本申请提供一种乳制品中碱性蛋白的检测方法，包括以下步骤：

4、提供待测的乳制品；

5、将所述乳制品中的酪蛋白和脂肪分离后，得到含碱性蛋白的蛋白提取液；

6、测定所述蛋白提取液的总蛋白浓度，当总蛋白浓度≥0.01μg/ml时视为有效提取；

7、将所述蛋白提取液进行酶切，得到酶切肽段溶液；

8、将所述酶切肽段溶液依次进行除盐处理和过滤处理，得到待测样品；

9、获取以所述碱性蛋白的特异性肽段标准品质量浓度为横坐标、以所述碱性蛋白的特异性肽段标准品色谱峰面积为纵坐标的标准工作曲线；

10、采用高分辨质谱仪对所述待测样品进行定量分析，得到待测样品中各碱性蛋白特异性肽段的测试色谱峰面积，将所述测试色谱峰面积代入到所述标准工作曲线中，得到碱性蛋白特异性肽段的实测质量浓度，利用所述实测质量浓度计算各碱性蛋白的含量。

11、本申请提供的一种乳制品中碱性蛋白的检测方法，首创乳中各碱性蛋白(包括乳铁蛋白、乳过氧化物酶、溶酶体-α-甘露糖苷酶、免疫球蛋白g、血管生成素、核糖核酸酶、黄嘌呤氧化脱氢酶和β微球蛋白)的同时定量检测方法。

12、本申请提供的检测方法中，样品前处理方法采用沉淀高丰度酪蛋白，避免了高丰度蛋白的干扰。以各碱性蛋白的特异性肽段标准品建立线性曲线，对碱性蛋白进行绝对定量分析。

13、本申请简化蛋白提取方法，并优化了采集方法，该方法具有高通量、高分辨率、高灵敏度、高准确性等特点，可鉴定多种碱性蛋白的一级结构和组成多肽。

技术特征：

1.一种乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，所述碱性蛋白包括乳铁蛋白、乳过氧化物酶、溶酶体-α-甘露糖苷酶、免疫球蛋白g、血管生成素、核糖核酸酶、黄嘌呤氧化脱氢酶和β微球蛋白；各碱性蛋白的特异性肽段氨基酸序列如下：

3.如权利要求2所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱串联质谱检测所述碱性蛋白的特异性肽段标准品，获得如下标准工作曲线：

4.如权利要求3所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，各所述碱性蛋白的含量按照下述公式计算：

5.如权利要求3所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱的条件为：

6.如权利要求1所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，将所述乳制品中的酪蛋白和脂肪分离的步骤包括：首先采用离心方式分离所述乳制品中的脂肪及杂质沉淀，得到脱脂乳，然后将所述脱脂乳的ph调节为4～6，静置，使酪蛋白和发生变性的乳清蛋白沉淀，然后取上清液离心，取中间层乳清即得到所述蛋白提取液。

7.如权利要求1-6任一项所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，采用考马斯亮蓝法测定所述蛋白提取液的总蛋白浓度。

8.如权利要求1-3任一项所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，将所述蛋白提取液进行酶切的步骤包括：

9.如权利要求1-6任一项所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，所述除盐处理包括：将酶切肽段溶液通过c18除盐柱富集，然后加入平衡液洗去酶切肽段溶液中的盐，再加入洗脱液洗脱得到除盐后的酶切肽段溶液。

10.如权利要求1-6任一项所述的乳制品中碱性蛋白的检测方法，其特征在于，所述过滤处理包括：将所述除盐处理后的酶切肽段溶液通过聚醚砜滤膜过滤，然后放置于40～50℃下进行浓缩。

技术总结
本申请涉及检测分析技术领域，提供了一种乳制品中碱性蛋白的检测方法。所述碱性蛋白包括乳铁蛋白、乳过氧化物酶、溶酶体‑α‑甘露糖苷酶、免疫球蛋白、血管生成素、核糖核酸酶、黄嘌呤氧化脱氢酶和β微球蛋白。该检测方法基于蛋白质组学技术采用超高效液相色谱‑高分辨质谱定量检测乳中碱性蛋白含量的方法。本申请检测方法可同时对8种碱性蛋白进行定性和/或定量检测，而且，本申请检测方法在样品前处理过程中采用沉淀高丰度酪蛋白，避免了高丰度蛋白的干扰。以各碱性蛋白的特异性肽段标准品建立线性曲线，对碱性蛋白进行绝对定量分析。

技术研发人员：张影,孟亦田,张婵,吉利利,张乃宁,张莉,郑丽宏,刘婧怡
受保护的技术使用者：上海华测艾研医学检验所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6