一种简单快捷的胚胎免疫荧光双染法的制作方法

本发明涉及样本制备，具体涉及一种简单快捷的胚胎免疫荧光双染法。

背景技术：

1、免疫荧光染色技术指在抗体上结合荧光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，通过化学反应使标记抗体显色剂显色来检测细胞或组织中是否有目标抗原蛋白的存在，并对其进行定位和相对定量的研究。体外胚胎生产经过几十年的发展，已经成为了水牛高效扩繁和品种改良的一个重要手段，但胚胎生产效率还有很大的提升空间。而筛选出调控胚胎早期发育相关基因和蛋白可为提高胚胎体外生产效率提供技术开发的理论基础，但目前针对水牛早期胚胎的发育调控仍然处于研究阶段。应用免疫荧光染色应用于胚胎可为胚胎发育机制和胚胎干细胞研究等领域提供理论参考意义。但对胚胎进行免疫荧光染色时，存在以下几个问题：一是胚胎出现染不上色的现象；二是在洗涤和压片等操作过程中会出现胚胎丢失的现象；三是一次免疫荧光染色只能检测一个蛋白，且抗体使用量较大，染色成本较高。因此发展出适用于水牛胚胎的免疫荧光双染法，有助于推进水牛早期胚胎发育调控的关键蛋白研究，进而开发出提高水牛胚胎的体外生产效率的新方法和新手段，推动良种水牛繁育和水牛品种改良。

2、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，旨在克服传统免疫荧光染色时胚胎染色用时长、抗体用量大，及染色效果差、胚胎易丢失等缺陷。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，包括以下步骤：

3、s1，制作微穴：用打孔装置在操作装置底部制作凹槽，制得微穴；

4、s2，固定：室温条件下，用4％多聚甲醛溶液孵育胚胎20min，取出所述胚胎，放入矿物油覆盖的保存液中，4℃保存至染色，从4℃取出4孔板，在每个微穴中加入1-4个所述胚胎，清洗所述胚胎3次，得到固定后胚胎；

5、s3，透膜：向含固定后胚胎的微穴中加入30-40μl透膜液，盖上皿盖放入免疫组化湿盒室温处理30min后清洗1次，得到透膜后胚胎；

6、s4，封闭：向含透膜后胚胎的微穴中加入封闭液，将培养皿盖好后转入免疫组化湿盒中室温静置2h，吸除封闭液后清洗1次，得到封闭后胚胎；

7、s5，一抗孵育：将0.1μl一号一抗、0.lμl二号一抗和30μl抗体稀释液混匀，得到一抗溶液，捡卵针吸取所述一抗溶液加入含封闭后胚胎的微穴中，再将微穴转入免疫组化湿盒，并置于4℃的冰箱中过夜后清洗3次，得到处理后胚胎；

8、s6，二抗孵育：将0.1μl一号二抗、0.1μl二号二抗和50μl抗体稀释液混匀，获得二抗溶液，捡卵针吸取所述二抗溶液加入含处理后胚胎的微穴中，室温避光静置1h后清洗3次，得到胚胎样本；

9、s7，制片。

10、优选地，上述技术方案中，所述洗液由500ml 1×pbs、500μl triton x-100和0.5g的pvp组成。

11、优选地，上述技术方案中，所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，所述打孔装置包括微穴打孔器或加热的圆头小玻璃棒，所述操作装置包括培养板或培养皿。

12、优选地，上述技术方案中，在步骤s2、s3、s4、s5、s6中，所述清洗指向所述微穴中加入30-40μl洗液混匀静置5min后，再用捡卵针轻轻吹打胚胎，吸除洗液。

13、优选地，上述技术方案中，所述洗液由500ml 1×pbs、500μl triton x-100和0.5g的pvp组成。

14、优选地，上述技术方案中，在步骤s2中的所述透膜液由50ml 1×pbs、500μl的triton x-100组成。

15、优选地，上述技术方案中，在所述步骤s2中，所述保存液由50ml 1×pbs和0.25g的bsa。

16、优选地，上述技术方案中，在步骤s4中，所述封闭液的制备方法为：用50ml 1×pbs、50μl的tritonx-100、0.5g的bsa和0.374g的甘氨酸混合获得混合溶液，再将混合溶液与胎牛血清按体积比为3:1混合均匀，得到封闭液。

17、优选地，上述技术方案中，所述抗体稀释液由50ml 1×pbs、500ul的tritonx-100和0.5g的bsa组成。

18、优选地，上述技术方案中，在步骤s7中所述制片的具体步骤如下：

19、(1)在每张载玻片上用水性笔画一个圆圈或者方形，在所述图形中间滴入6μl含dapi的抗荧光淬灭剂；

20、(2)捡卵针吸取少量洗液，再吸取胚胎样本转至所述抗荧光淬灭剂中静置5min使胚胎样本染色；

21、(3)在盖玻片的四个角都沾上羊毛脂，盖上盖玻片后，用移液管的尖端轻轻地压在盖玻片上，直到胚胎压片完成。

22、优选地，上述技术方案中，所述胚胎为水牛的胚胎。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、(1)本发明方法使用抗体原料更少，节约抗体资源，减少成本；

25、(2)使用本发明方法获得的样本染色效果好，且没有胚胎丢失；

26、(3)使用本发明方法进行胚胎染色制片时，胚胎聚集且清晰，更易于观察。

技术特征：

1.一种简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，所述打孔装置包括微穴打孔器或加热的圆头小玻璃棒，所述操作装置包括培养板或培养皿。

3.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，在步骤s2、s3、s4、s5、s6中，所述清洗指向所述微穴中加入30-40μl洗液混匀静置5min后，再用捡卵针轻轻吹打胚胎，吸除洗液。

4.根据权利要求1所述简单便捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，所述洗液由500ml 1×pbs、500μl triton x-100和0.5g的pvp组成。

5.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，在步骤s3中的所述透膜液由50ml 1×pbs、500μl的tritonx-100组成。

6.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，在所述步骤s2中，所述保存液由50ml 1×pbs和0.25g的bsa。

7.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，在步骤s4中，所述封闭液的制备方法为：用50ml 1×pbs、50μl的triton x-100、0.5g的bsa和0.374g的甘氨酸混合获得混合溶液，再将混合液与胎牛血清按体积比为3:1混合均匀，得到封闭液。

8.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，所述抗体稀释液由50ml 1×pbs、500ul的triton x-100和0.5g的bsa组成。

9.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，在步骤s7中所述制片的具体步骤如下：

10.根据权利要求1所述简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，其特征在于，所述胚胎为水牛胚胎。

技术总结
本发明公开了一种简单快捷的胚胎免疫荧光双染法，包括用打孔装置在操作装置底部制作凹槽，制得微穴，固定试验胚胎后透膜，将胚胎转入微穴中进行封闭、一抗孵育、二抗孵育获得胚胎染色样本，对胚胎样品进行制片。本发明方法通过制备微穴并在微穴中对胚胎进行免疫荧光双染，缩短胚胎染色时间和减少实验耗材，降低试验成本的同时降低胚胎的丢失率。

技术研发人员：杨春艳,尚江华,郑海英,李盼,周金陈
受保护的技术使用者：广西壮族自治区水牛研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8