黄药叶药材指纹图谱检测方法

本发明涉及中药指纹图谱，尤其涉及一种黄药叶药材指纹图谱检测方法。

背景技术：

1、黄药(premna cavaleriei levl.)是马鞭草科豆腐柴属植物，又称黄药豆腐柴，湖北省十堰市武当山地区的野生黄药分布广泛、品质优良，当地居民在每年4～10月有用黄药叶制作“神仙豆腐”的传统，但多以农家自制为主，缺乏系统化和标准化开发，大量黄药叶未得到充分利用，资源浪费严重。

2、目前，对黄药的研究报道较少，且仅涉及黄酮提取工艺，而相对报道较多的为黄药同属植物豆腐柴和狐臭柴。该属植物的叶中含有果胶、氨基酸、黄酮、维生素、挥发油、多糖和矿物质等多种营养成分。由于中药成分的复杂性，在有效成分不明确的情况下，仅以几个化合物的含量作为质量评价的指标是不可信的，也是不全面的。

3、中药指纹图谱是指中药材及其制剂经适当处理后，采用一定的分析方法，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，具有系统性、特征性、稳定性等特点，同时具有“整体性”和“模糊性”的基本属性，能准确的反映出中药材及其制剂真实的质量情况。但至今为止，针对黄药叶药材无相关国家质量标准，不利于控制质量，采用中药指纹图谱对黄药叶药材进行有效控制和评价对进一步开发利用黄药叶药材具有重要的意义。

4、有鉴于此，有必要设计一种黄药叶药材指纹图谱检测方法，以解决上述问题。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种黄药叶药材指纹图谱检测方法，以便对不同来源的黄药叶药材的质量进行全面客观的评价。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种黄药叶药材指纹图谱检测方法，包括如下步骤：

3、(1)将不同批次的黄药叶粉末分别与甲醇溶液混合，经超声提取、过滤后，取续滤液进行离心，将离心得到的上清液过滤后，再取续滤液作为不同批次的供试品溶液；

4、(2)将香叶木素-7-o-芸香糖苷和蒙花苷分别与甲醇混合，配制香叶木素-7-o-芸香糖苷对照品储备溶液和蒙花苷对照品储备溶液；再将两种对照品储备溶液混合，得到混合对照品溶液；

5、(3)采用超高压液相色谱仪对所述供试品溶液和所述混合对照品溶液分别进行检测，得到不同批次的供试品色谱图和混合对照品色谱图；

6、(4)对所述不同批次的供试品色谱图进行分析，确定共有峰；采用中位数计算法生成黄药叶的对照指纹图谱，并计算不同批次的供试品色谱图的相似度。

7、作为本发明的进一步改进，在步骤(4)中，还包括采用化学模式识别手段对不同批次的供试品色谱图进行差异性分析；所述化学模式识别手段包括聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘判别分析。

8、作为本发明的进一步改进，在步骤(1)中，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为30％～50％。

9、作为本发明的进一步改进，在步骤(3)中，所述检测时的液相色谱条件包括：以0.1％的甲酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b进行二元梯度洗脱，流速为0.2～0.25ml/min；检测波长为210～330nm；所述梯度洗脱时流动相b的体积分数变化为：0～25min，3％～25％b；25～31min，25％～31％b；31～36min，31％～40％b；36～37min，40％～100％b；37～38min，100％～100％b；38～39min，100％～3％b；39～42min，3％～3％b。

10、作为本发明的进一步改进，所述检测波长为330nm。

11、作为本发明的进一步改进，所述流速为0.25ml/min。

12、作为本发明的进一步改进，在步骤(4)中，所述共有峰的数量为22个，编号分别为1～22，与参考色谱图相比各共有峰的相对保留时间分别为：峰1：1.492，峰2：10.248；峰3：11.840；峰4：13.845；峰5：14.275；峰6：14.840；峰7：17.072；峰8：17.793；峰9：18.042；峰10：18.706；峰11：19.593；峰12：21.667；峰13：21.968；峰14：22.760；峰15：24.062；峰16：24.433；峰17：25.140；峰18：27.288；峰19：27.562；峰20：31.770；峰21：35.509；峰22：36.903；其中，与香叶木素-7-o-芸香糖苷对应的为峰13，与蒙花苷对应的为峰19。

13、作为本发明的进一步改进，在步骤(1)中，所述黄药叶粉末与甲醇溶液的质量体积比为1g:25～35ml；所述超声提取的功率为150w，提取时间为20～40min；所述离心的转速为10000～15000r/min。

14、作为本发明的进一步改进，在步骤(1)中，所述黄药叶粉末由新鲜黄药叶经洗净、烘干、粉碎、过60目筛后得到。

15、作为本发明的进一步改进，在步骤(2)中，所述香叶木素-7-o-芸香糖苷对照品储备溶液的浓度为0.675mg/ml，所述蒙花苷对照品储备溶液的浓度为0.200mg/ml。

16、本发明的有益效果是：

17、1、本发明提供的黄药叶药材指纹图谱检测方法，通过对黄药叶提取过程中的提取溶剂进行优化，同时在高效液相色谱检测过程中对液相色谱系统、检测波长、流速、流动相组成、洗脱梯度方式等进行优化，从而使最终分离得到的色谱峰峰形较好、数目较多、分离度较高，能够有效用于黄药叶药材指纹图谱的建立。

18、2、本发明提供的黄药叶药材指纹图谱检测方法，能够获得黄药叶药材的标准指纹图谱，且具有精密度高、重复性好、稳定性好等优点。在此基础上，通过比较指纹图谱中共有峰的缺失，能有效地鉴别黄药叶药材的真伪及产地，用于反映黄药叶质量的优劣；通过指纹图谱主要特征峰的相对稳定性还能有效控制中药的质量，确保产品的相对稳定。并且，本发明在获得黄药叶药材指纹图谱的基础上，进一步结合相似度评价、聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，综合分析不同产地黄药叶药材的差异，完善了黄药叶药材的质量评价体系，为黄药叶药材质量的系统、有效控制提供了理论和实践基础。

技术特征：

1.一种黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(4)中，还包括采用化学模式识别手段对不同批次的供试品色谱图进行差异性分析；所述化学模式识别手段包括聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘判别分析。

3.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述甲醇溶液中甲醇的体积分数为30％～50％。

4.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述检测时的液相色谱条件包括：以0.1％的甲酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b进行二元梯度洗脱，流速为0.2～0.25ml/min；检测波长为210～330nm；所述梯度洗脱时流动相b的体积分数变化为：0～25min，3％～25％b；25～31min，25％～31％b；31～36min，31％～40％b；36～37min，40％～100％b；37～38min，100％～100％b；38～39min，100％～3％b；39～42min，3％～3％b。

5.根据权利要求4所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：所述检测波长为330nm。

6.根据权利要求4所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：所述流速为0.25ml/min。

7.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述共有峰的数量为22个，编号分别为1～22，与参考色谱图相比各共有峰的相对保留时间分别为：峰1：1.492，峰2：10.248；峰3：11.840；峰4：13.845；峰5：14.275；峰6：14.840；峰7：17.072；峰8：17.793；峰9：18.042；峰10：18.706；峰11：19.593；峰12：21.667；峰13：21.968；峰14：22.760；峰15：24.062；峰16：24.433；峰17：25.140；峰18：27.288；峰19：27.562；峰20：31.770；峰21：35.509；峰22：36.903；其中，与香叶木素-7-o-芸香糖苷对应的为峰13，与蒙花苷对应的为峰19。

8.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述黄药叶粉末与甲醇溶液的质量体积比为1g:25～35ml；所述超声提取的功率为150w，提取时间为20～40min；所述离心的转速为10000～15000r/min。

9.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述黄药叶粉末由新鲜黄药叶经洗净、烘干、粉碎、过60目筛后得到。

10.根据权利要求1所述的黄药叶药材指纹图谱检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述香叶木素-7-o-芸香糖苷对照品储备溶液的浓度为0.675mg/ml，所述蒙花苷对照品储备溶液的浓度为0.200mg/ml。

技术总结
本发明提供了一种黄药叶药材指纹图谱检测方法，通过将不同批次的黄药叶粉末分别与甲醇溶液混合，制备供试品溶液，并制备混合对照品溶液，再采用超高压液相色谱仪进行检测，得到不同批次的供试品色谱图和混合对照品色谱图；然后对不同批次的供试品色谱图进行分析，确定共有峰，采用中位数计算法即可生成黄药叶的对照指纹图谱。通过上述方式，本发明分离得到的色谱峰峰形较好、数目较多、分离度较高，能够获得黄药叶药材的标准指纹图谱，且精密度高、重复性好、稳定性好，能有效鉴别黄药叶药材的真伪及产地，用于反映黄药叶质量的优劣，完善了黄药叶药材的质量评价体系，为黄药叶药材质量的系统、有效控制提供了理论和实践基础。

技术研发人员：李飞,桂利利,吴正坤,余惠凡,刘曼琳,刘丰博,罗寒,何雪莱
受保护的技术使用者：湖北医药学院
技术研发日：
技术公布日：2024/7/9