一种SEC-HPLC法测定尿激酶纯度的方法与流程

本发明涉及药物分析，具体为一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法。

背景技术：

1、尿激酶是一种溶解血栓的蛋白药物，一般在人尿液中提取纯化而得，也有重组人尿激酶，随着技术的发展，蛋白类大分子生物纯度要求越来越严格，但目前最新版药典中仍未收载尿激酶纯度测定方法及限度要求，因此无法测定尿激酶的纯度，更不能全面反应产品的质量状况，存在一定缺陷。

2、现有的sec-hplc法测定尿激酶纯度存在的缺陷是：

3、1、在申请文件cn117542460a中，主要通过为每个人群提供合适的尿激酶分离设备的分离参数，来提高尿激酶分离的纯度，并没有考虑到现有的尿激酶在测定纯度时，并不能监控尿激酶的质量，产品的有效性和一致性不能得到保障；

4、2、在申请文件cn114736892a中，主要通过提高尿激酶的分离度来获取纯度较高的尿激酶，并没有考虑到现有的尿激酶在测定纯度时，并不能在收集尿激酶分子峰的过程中监测检测器的信号，尿激酶质量测定的结果精确度较差。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，包括样品准备、流动相制备、设置色谱条件、进样分析、数据采集处理、数据计算、重复性实验和结果分析比对，尿激酶纯度测定方法如下：

3、s1、首先，采用离心和透析的方法从尿激酶溶液中提取尿激酶样品，并使用滤膜对提取的尿激酶样品进行过滤操作；

4、s2、色谱柱为二醇基键合硅胶，流动相为ph6.8磷酸盐缓冲液；

5、s3、设置合适的色谱条件，色谱柱长度为300mm，流速为0.5-1.0ml/min，柱温为25-35℃，样品盘温度为5-15℃，检测波长为210-220nm，进样量为5-25ul；

6、s4、将制备好的尿激酶样品注入sec-hplc仪中，进行色谱分析，并使用检测器收集尿激酶分子峰；

7、s5、在色谱分析的过程中，通过检测器监测尿激酶的洗脱峰，并记录色谱图，收集尿激酶的多项数据；

8、s6、使用面积归一化法计算尿激酶的纯度，并根据步骤s5中收集到的多项数据评估尿激酶样品的质量；

9、s7、进行重复实验，比较多次实验结果的稳定性；

10、s8、综合考虑比对分析所有的实验结果，评估尿激酶的纯度是否符合预期要求，并根据实验结果，提出改进建议或优化措施。

11、优选的，在步骤s1中，还包括如下步骤：

12、制备供试品溶液、对照品溶液和空白溶液。

13、优选的，在步骤s2中，还包括如下步骤：

14、s21、称取磷酸氢二钠54.65g、磷酸二氢钠15.25g以及氯化钠8.5g溶于1l的水中，并使用磷酸调节ph值至6.8。

15、优选的，所述空白溶液为水，称取尿激酶样品加水溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为供试品溶液，制备一系列不同浓度的尿激酶溶液作为对照品溶液。

16、优选的，所述检测器为紫外检测器。

17、优选的，在步骤s5中，还包括如下步骤：

18、尿激酶的多项数据包括洗脱峰的位置、峰的形状和对称性、峰面积和峰高、洗脱曲线的斜率、基线噪声、尿激酶的分子量、尿激酶的稳定性中的其中一种或多种。

19、优选的，在步骤s6中，还包括如下步骤：

20、s61、纯度＝[x/(x+a+b+y)]*100％

21、其中x为高分子量尿激酶，a为杂蛋白1，b为杂蛋白2，y为低分子量尿激酶；

22、s62、通过计算resolution(usp)相邻两峰之间的分离度r、asymmetry(ep)峰形因子和plates(usp)理论搭板数n来评估尿激酶样品的质量。

23、优选的，在步骤s62中，还包括如下步骤：

24、

25、其中tr1、tr2为峰1、2的保留时间，w1、w2为峰1、2的峰宽；

26、

27、其中tr表示某一组分的保留时间，wh/2和w表示该组分的高半峰宽和峰宽。

28、优选的，在步骤s7中，还包括如下步骤：

29、采用与初次实验相同的sec-hplc方法，对同一尿激酶样品进行多次纯度测定，实验条件、样品处理、色谱柱、流动相和色谱条件参数均与初次实验参数保持一致。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

31、1、本发明选用分子排阻色谱法，并筛选出事宜的测定条件，可以准确地进行尿激酶纯度的测定，测定条件稳定，以面积归一化法进行计算，使得对尿激酶的质量的监控更加全面，保证了产品质量的有效性和一致性。

32、2、本发明通过优化实验条件来提高信号稳定性，并使用检测器收集尿激酶分子峰，且在收集尿激酶分子峰的过程中，监测检测器的信号，以防出现信号波动，以确保尿激酶分子峰的准确收集，从而为后续生物制品的研究和生产奠定基础。

33、3、本发明通过在尿激酶的纯度测定结束后收集尿激酶的多项数据，并观察尿激酶在不同条件下的稳定性，通过收集和分析这些数据，可以对尿激酶的性质和纯度进行全面评估，并为后续的实验和应用提供重要依据。

34、4、本发明在配置好供试品溶液后，按照需要改变尿激酶样品的质量和稀释倍数，得到不同浓度的尿激酶对照品溶液，这些对照品溶液将在测定过程中与供试品溶液进行比较，以评估尿激酶含量的变化，并根据对比实验的结果，评估尿激酶的纯度是否符合预期要求，确保测定结果的准确性和可靠性。

技术特征：

1.一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，包括样品准备、流动相制备、设置色谱条件、进样分析、数据采集处理、数据计算、重复性实验和结果分析比对，其特征在于，尿激酶纯度测定方法如下：

2.根据权利要求1所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，在步骤s1中，还包括如下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，在步骤s2中，还包括如下步骤：

4.根据权利要求2所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于：所述空白溶液为水，称取尿激酶样品加水溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为供试品溶液，制备一系列不同浓度的尿激酶溶液作为对照品溶液。

5.根据权利要求1所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器。

6.根据权利要求1所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，在步骤s5中，还包括如下步骤：

7.根据权利要求1所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，在步骤s6中，还包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，在步骤s62中，还包括如下步骤：

9.根据权利要求1所述的一种sec-hplc法测定尿激酶纯度的方法，其特征在于，在步骤s7中，还包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种SEC‑HPLC法测定尿激酶纯度的方法，涉及药物分析技术领域，首先采用离心和透析的方法从尿激酶溶液中提取尿激酶样品，并使用滤膜对提取的尿激酶样品进行过滤操作，设置合适的色谱条件，色谱柱长度为300mm，流速为0.5‑1.0ml/min，柱温为25‑35℃，样品盘温度为5‑15℃，检测波长为210‑220nm，进样量为5‑25ul，将制备好的尿激酶样品注入SEC‑HPLC仪中，进行色谱分析，并使用检测器收集尿激酶分子峰，通过检测器监测尿激酶的洗脱峰，并记录色谱图，收集尿激酶的多项数据，使用面积归一化法计算尿激酶的纯度，并进行重复实验，并根据实验结果，提出改进建议或优化措施。本发明选用分子排阻色谱法，并筛选出适宜的测定条件，可以准确地进行尿激酶纯度的测定，测定条件稳定。

技术研发人员：林子荣,桑晓斌,王宇凤,李妮娜,刘石峥
受保护的技术使用者：康诺生物制药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/7/23