Fmoc-Cys(Trt)-OH中残留游离氨基酸定量检测方法与流程

本发明涉及游离氨基酸定量检测方法，特别涉及fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸定量检测方法。

背景技术：

1、残留在fmoc-cys(trt)-oh-中游离氨基酸主要为h-cys(trt)-oh），如果h-cys(trt)-oh在fmoc-cys(trt)-oh中残留量达到0.3%（w/w），fmoc-cys(trt)-oh作为主要原料在进行后续延伸反应中很容易与其它基团发生副反应，生产相关杂质，后处理也很难除掉；所以，在fmoc-cys(trt)-oh中精准控制游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）有很高的要求。

技术实现思路

1、本发明提供了一种fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）定量检测方法，主要解决现有液相色谱方法存在的精准定量困难，以及fmoc-cys(trt)-oh与游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）二个目标峰分离度等技术问题。

2、本发明采用了以下技术方案：fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸定量检测方法，它包括以下步骤：

3、步骤一，准备测量的试剂：乙腈-色谱纯，超纯水，:化学纯三氟乙酸。

4、步骤二：样品溶液的配制：称取试样置于容器中，加入乙腈，室温条件下采用超声波溶解，再用水定容，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行hplc分析。

5、标准溶液的配制：准确称取游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）的标准品0.010 g（精确至0.00001 g），用60ml乙腈溶解，并用水稀释至100 ml容量瓶中并定容，摇匀，配制成100mg/l的标准储备溶液，于25℃密封保存。

6、 步骤三，进行高效液相色谱测定;色谱条件为样品室温度为40℃，自动进样器进样体积为10 µl，色谱柱采用agilent poroshell 120 ec-c18，柱温：40 ℃，流速：1.0 ml/min，流动相为摩尔浓度为0.1%tfa水溶液（a）和100%乙腈（b），采用梯度洗脱程序。所述的梯度洗脱程序为：0～12min，v(b)为30%到40%， 12～20 min，v(b)从40% 到95%，20～25 min，v(b),保持在95% ，25.0～25.1 min，v(b)从95% 到30% 的初始比例，25.1～30 min，v(b)从30% 平衡系统。

7、所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为安捷伦 1260色谱仪，该色谱仪采用dad二极管列阵检测器。

8、本发明具有以下有益效果：本发明测定带fmoc-cys(trt)-oh-中残留游离氨基酸定量检测方法，该方法操作简便、快速、方法稳定性好，游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）主峰峰型对称，与相邻未知杂质分离度好等；更主要是能精准定量检测出游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）在fmoc-cys(trt)-oh中的重量浓度；本发明采用了高效液相色谱仪的自动进样器的精准定量，利用dad二极管列阵检测器的灵敏度可以对游离氨基酸（h-cys(trt)-oh）有很好的响应值，解决了峰拖尾以及相邻杂质峰分离度现象。达到了低浓度，高响应、基线级分离的技术效果。

技术特征：

1.fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸定量检测方法；其特征是：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸定量检测方法，其特征是：所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为agilent 1260 液相色谱仪，该仪器采用dad二极管阵列检测器。

3. 根据权利要求1所述的fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸定量检测方法，其特征是：所述色谱柱尺寸为4.6mm ×150mm, 4.0μm。

4.根据权利要求1所述的fmoc-cys(trt)-oh中残留游离氨基酸定量检测方法，其特征是：所述的梯度洗脱程序为：0～12min，流动相b体积比例为30%到40%；12～20 min，流动相b体积比例从40% 到95%；20～25 min，流动相b体积比例保持在95% ；25.0～25.1 min，流动相b体积比例从95% 到30% 的初始比例；25.1～30 min，流动相b体积比例在30% 平衡系统。

技术总结
本发明公开了Fmoc‑Cys(Trt)‑OH中残留游离氨基酸定量检测方法，主要解决现有液相色谱方法存在的精准定量困难，以及Fmoc‑Cys(Trt)‑OH‑与游离氨基酸（H‑Cys(Trt)‑OH）二个目标峰分离度等技术问题。本发明测定方法包括以下步骤：一，准备测量的试剂，二，样品的前处理；三，进行高效液相色谱测定，色谱仪为安捷伦1260色谱仪，采用DAD紫外检测器，色谱柱采用Agilent poroshell 120 EC‑C18，流动相为摩尔浓度为0.1%TFA水溶液（A）和100%乙腈（B），通过本发明为Fmoc‑Cys(Trt)‑OH‑中残留游离氨基酸定量检测方法提供了可靠便捷的检测手段。

技术研发人员：徐红岩,李省,夏伟冬,陈炜,虞伟
受保护的技术使用者：上海吉奉生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/16