一种评价体外扩增CD8+T细胞的杀伤能力的方法与流程

本发明属于免疫治疗，具体涉及一种评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力的方法。

背景技术：

1、细胞毒性t淋巴细胞(ctl细胞)，通常称为cd8+t细胞，是一种抗原特异性t细胞，是适应性免疫系统的关键组成部分，监视机体并清除感染，尤其是在消除细胞内感染和恶性细胞中发挥关键作用，同时可提供长期保护性免疫(cd8+t cell metabolismin infectionand cancer.nat rev immunol.2021nov；21(11):718-738.)。cd8+t细胞在人外周血单核细胞的t细胞中的占比仅为5～30％，经过体外扩增的cd8+t细胞在体外扩增的t细胞中的占比远高于在人外周血单核细胞中的，同时静息的cd8+t细胞通过体外扩增能够成为细胞毒性效应细胞，体外扩增的cd8+t细胞还可生成多种有助于宿主防御的细胞因子(包括ifnγ和tnfα)。因此评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力具有重要意义。

2、体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力可通过检测cd107a分子表达反映，但目前的研究表明cd107a分子表达不稳定。脱颗粒是穿孔素和颗粒酶依赖性靶细胞杀伤途径的关键过程，也是抗原特异性cd8+t细胞介导的细胞杀伤功能的最主要途径。脱颗粒过程中，cd8+t细胞的溶细胞颗粒膜与活化的质膜融合，同时cd107a膜蛋白被合并到活化cd8+t细胞的质膜中，导致cd107a分子暴露于cd8+t细胞表面。因此cd107a分子是cd8+t细胞脱颗粒的一种敏感标志，与细胞毒活性直接相关，可反映细胞毒性t细胞的杀伤能力。但是cd107a在脱颗粒结束后会从细胞表面内吞，进入酸性内体或溶酶体室，cd107a在cd8+t细胞表面的表达会减少甚至消失的，因此cd107a的表达是动态、不稳定的，所以针对体外扩增cd8+t细胞的cd107a表达的检测更具有挑战性。

3、目前的研究主要利用流式细胞术检测体外扩增cd8+t细胞的cd107a的膜表达，但是这些流式细胞术检测方法中存在诸多问题：如对样本的处理操作繁琐、费时致真实性不足、成本高、检测结果分析有一定主观性、无法准确定量、指标判断单一、敏感度低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力的方法，简单特异、成本低、真实和稳定性好，敏感性高。

2、本发明提供了一种评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力的方法，包括以下步骤：(1)将体外培养的cd8+t细胞分为实验组和同型对照组，其中利用cd8和cd107a抗体对所述实验组避光染色，利用同型抗体对所述同型对照组避光染色；

3、(2)依次利用流式细胞仪检测实验组和同型对照组的cd107a的阳性率和平均荧光强度，当cd8+t细胞表面的cd107a的阳性率>8％，且实验组与同型对照组的cd107a平均荧光强度的比值>2，说明所述cd8+t细胞有活化杀伤能力。

4、优选的，步骤(1)中将体外培养的cd8+t细胞分为实验组和同型对照组前，还包括对细胞悬液进行计数。

5、优选的，步骤(1)体外培养的cd8+t细胞的细胞悬液的培养天数为12～21天。

6、优选的，所述cd8+t细胞来源于人体或动物。

7、优选的，步骤(1)所述同型抗体包括与实验组的一抗完全相同种属来源、相同亚型及荧光标记的抗体。

8、优选的，在步骤(1)所述避光染色结束后，还包括利用洗液洗涤并离心，离心结束后，用洗液重悬洗涤后的细胞，而后进行流式细胞仪检测；所述洗液包括生理盐水或pbs。

9、优选的，所述避光染色的时间为50～70min。

10、优选的，所述避光染色的温度为34～38℃。

11、优选的，所述离心的离心力为150～500g。

12、优选的，所述离心的时间为4～10min。

13、优选的，步骤(2)所述流式细胞仪检测，包括：根据前向散射光、侧向散射光调整电压大小和增益参数，使目标细胞团位置处于视野范围内，并且能与细胞碎片分开；选取目标细胞并设门；通过同型对照组设阴性置信区；完成样品数据的获取。

14、优选的，所述同型对照组设阴性置信区，包括：设定cd8/cd107a散点图中十字门的左下方为阴性置信区，使得阴性置信区细胞百分比≥99％。

15、有益效果：本发明提供了一种评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力的方法，利用cd107a评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力的流式细胞术检测方法，使用抗体标记cd8+t细胞表面膜蛋白cd107a，并采用流式细胞仪检测细胞cd107a的阳性率和平均荧光强度，通过cd8+t细胞表面cd107a的表达水平评价该cd8+t细胞的杀伤能力。本发明以体外扩增的cd8+t细胞的cd107a的表达作为评价标准，直接用培养的细胞悬液作为样本，减少了实验步骤和降低了实验成本，同时能够真实的反映出体外扩增cd8+t细胞的cd107a膜表达量。本发明在评价时，设置了同型对照组，对同型对照界定阴性置信区的细胞数量百分比进行了限定，解决了不能准确定量和具有一定主观性的问题。本发明利用cd107a的阳性率和平均荧光强度两个指标评价体外扩增cd8+t细胞的cd107a的表达能力，相对于现有技术更敏感。本发明在检测的过程中无需染色前洗涤和加入肽库的刺激，未来对开发和改造cd8+t细胞的培养工艺起到一定的促进作用。

技术特征：

1.一种评价体外扩增cd8+t细胞的杀伤能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将体外培养的cd8+t细胞分为实验组和同型对照组，其中利用荧光标记cd8和cd107a抗体对所述实验组避光染色，利用同型抗体对所述同型对照组避光染色；

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中将体外培养的cd8+t细胞分为实验组和同型对照组前，还包括对细胞悬液进行计数。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤(1)体外培养的cd8+t细胞的细胞悬液的培养天数为12～21天。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述cd8+t细胞来源于人体或动物。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述同型抗体包括与实验组的一抗完全相同种属来源、相同亚型及荧光标记的抗体。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(1)所述避光染色结束后，还包括利用洗液洗涤并离心，离心结束后，用洗液重悬洗涤后的细胞，而后进行流式细胞仪检测；所述洗液包括生理盐水或pbs。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述避光染色的时间为50～70min，避光染色温度为34～38℃。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述离心的离心力为150～500g，离心的时间为4～10min。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述流式细胞仪检测，包括：根据前向散射光、侧向散射光调整电压大小和增益参数，使目标细胞团位置处于视野范围内，并且能与细胞碎片分开；选取目标细胞并设门；通过同型对照组设阴性置信区；完成样品数据的获取。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述同型对照组设阴性置信区，包括：设定cd8/cd107a散点图中十字门的左下方为阴性置信区，使得阴性置信区细胞百分比≥99％。

技术总结
本发明公开了一种评价体外扩增CD8+T细胞的杀伤能力的方法，属于免疫治疗技术领域。本发明提供的一种评价体外扩增CD8+T细胞的杀伤能力的方法，使用抗体标记CD8+T细胞表面的膜蛋白CD107a，并采用流式细胞仪检测细胞CD107a的阳性率和平均荧光强度，通过CD8+T细胞表面CD107a的表达水平来评价该CD8+T细胞的杀伤能力。本发明所述方法简单特异、成本低、真实和稳定性好，敏感性高，能够更好的监视体外扩增的CD8+T细胞的杀伤能力，未来对开发和改造CD8+T细胞的培养工艺起到一定的作用。

技术研发人员：张菊,王静雪,吴修泉,洪辅安,孙乙天
受保护的技术使用者：深圳锦时生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/8/26