一种胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法与流程

本发明属于抗体检测，具体涉及一种胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法。

背景技术：

1、自身免疫疾病的特征是对自身抗原产生病理反应，患者表现出神经症状和自身免疫反应，即出现与自身抗原结合的自身抗体，例如对神经传递具有重要功能的多肽。自身抗体与抗原结合可影响神经系统的任何区域，包括中枢神经系统、外周神经系统和自主神经系统，进一步加剧患者临床症状。因此，自身抗体的检测是诊断和治疗自身免疫疾病的重要手段。

2、现有的自身抗体检测主要包括免疫印迹、免疫斑点、酶联免疫法或基于细胞底物的免疫荧光法(cell based assay,cba)。cba法是将外源目的基因转染入细胞，使细胞表达自身抗原，以此为底物通过细胞免疫荧光方法检测自身抗体，由于不涉及抗原的提取和纯合，能保存较好的蛋白拓扑构象，具有较高的检测灵敏度和特异性，其应用范围显著广于酶联免疫法和免疫斑点等方法。但cba法涉及对细胞的固化处理，常用的化学试剂包括甲醇、甲醛和丙酮等，固化处理可使氨基酸发生交联，改变蛋白的拓扑构象，从而降低检测的灵敏度，并产生非特异检测结果。

3、作为cba检测的一种演变的检测方法-活细胞检测，其是在细胞固化之前，用自身抗体与细胞的自身抗原结合，由于保持了天然蛋白构象，最大程度地提高了检测灵敏度和特异性。例如，文献报道显示髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)活细胞灵敏度达到99.8％，显著高于传统的固化检出率。但由于未经细胞固化和透膜处理，活细胞检测仅适用于抗原表露在细胞外的膜蛋白检测，无法检测神经元胞内抗体，如胶质纤维酸性蛋白(glialfibrilary acidic protein,gfap)和谷氨酸脱羧酶(glutomic acid decarboxylase65kda,gad65)等定位于细胞内的蛋白，使其应用范围大大受限。

技术实现思路

1、本发明就是开发了一种适用于胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，该方法利用基因编辑技术将胞内蛋白改造成融合膜蛋白，使其抗原表位暴露于细胞外，然后通过活细胞检测，提高自身抗体胞内蛋白检测的灵敏度和特异性。

2、为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

3、本发明提供一种胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其包括先使用膜蛋白的信号肽序列和跨膜区序列整合至胞内蛋白，将整合后的胞内蛋白转染至真核细胞进行表达，再进行自身抗体活细胞检测。

4、具体地，本发明中将胞内蛋白通过基因改造成膜蛋白，通过基因转染的方法使其在真核细胞中表达，并使胞内蛋白自身抗原表位暴露于细胞膜外，然后进行活细胞检测；该方法无需对细胞进行固化和透膜处理，将培养的活细胞直接与样本(血清和脑脊液)孵化结合，之后用携带荧光的二抗与自身抗体结合，通过荧光显微镜显色观察。

5、优选地，上述膜蛋白的信号肽序列可以为由seq id no:1所示序列编码序列，具体地，如seq id no:1所示序列为：

6、atggcaagcttatcaagaccctctctgcccagctgcctctgctccttcctcctcctcctcctcctccaagtgtcttccagctatgca。

7、需要说明的是，膜蛋白的信号肽可以为本领域所有的膜蛋白的信号肽，本发明中优选序列如seq id no:1编码的膜蛋白的信号肽，该序列的信号肽可以使得胞内蛋白很好的进行穿膜，由胞内到胞外，优于其他信号肽。

8、优选地，上述膜蛋白的跨膜区序列可以为由seq id no:1所示序列编码序列，具体地，如seq id no:1所示序列为：

9、ggagtgctggttctcctcgcggtgctgcctgtgctcctcctgcagatcactgttggcctc

10、atcttcctctgcctgcagtacagactgagaggaaaacttcgagcagagatagagaatct

11、ccaccggacttttgatccccactttctgagggtgccctgctggaagataaccctgtttgt

12、aattgtgccggttcttggacccttggttgccttgatcatctgctacaactggctacatcgaagactagcagggcaattccttgaagagctacgaaatcccttc。

13、需要说明的是，膜蛋白的跨膜区序列可以为本领域所有的膜蛋白的跨膜区序列，本发明中优选如seq id no:2编码的序列，优于其他跨膜区序列。

14、优选地，上述胞内蛋白可以为胶质纤维酸性蛋白或谷氨酸脱羧酶。

15、优选地，上述真核细胞可以选自hek-293细胞、cho细胞或hela细胞。

16、优选地，上述转染可以使用pei和lipo3000进行转染。

17、本发明有益效果至少包括：本发明中将胞内蛋白通过基因改造成膜蛋白，使其自身抗原天然构象暴露于细胞膜外，通过活细胞检测方法，能与自身抗体的充分结合，提高检测的灵敏度；同时，由于检测过程中无需使用化学试剂的固化和透膜处理，避免了自身抗原的交联及构象改变，提高了检测的特异性。

技术特征：

1.一种胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，包括先使用膜蛋白的信号肽序列和跨膜区序列整合至胞内蛋白，将整合后的胞内蛋白转染至真核细胞进行表达，再进行自身抗体活细胞检测。

2.根据权利要求1所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，膜蛋白的信号肽序列为由seq id no:1所示序列编码序列。

3.根据权利要求1或2所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，膜蛋白的跨膜区序列由seq id no:2所示序列编码序列。

4.根据权利要求1或2所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，胞内蛋白为胶质纤维酸性蛋白或谷氨酸脱羧酶。

5.根据权利要求3所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，胞内蛋白为胶质纤维酸性蛋白或谷氨酸脱羧酶。

6.根据权利要求1、2或5所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，真核细胞选自hek-293细胞、cho细胞或hela细胞。

7.根据权利要求1、2或5所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，转染使用pei和lipo3000进行转染。

8.根据权利要求6所述的胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法，其特征在于，转染使用pei和lipo3000进行转染。

技术总结
本发明属于抗体检测技术领域，具体涉及一种胞内蛋白的自身抗体活细胞检测方法。该检测方法包括先使用膜蛋白的信号肽序列和跨膜区序列整合至胞内蛋白，将整合后的胞内蛋白转染至真核细胞进行表达，再进行自身抗体活细胞检测。该方法是将胞内蛋白通过基因改造成膜蛋白，使其自身抗原天然构象暴露于细胞膜外，通过活细胞检测方法，能与自身抗体的充分结合，提高检测的灵敏度；同时，由于检测过程中无需使用化学试剂的固化和透膜处理，避免了自身抗原的交联及构象改变，提高了检测的特异性。

技术研发人员：金立方,傅国权,陈萍
受保护的技术使用者：绍兴金易生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23