基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法与流程

本发明涉及一种草甘膦的比色快速检测方法，特别是基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法。

背景技术：

1、草甘膦是一种常见有机磷农药，因其导电性强、杀灭作用强，在农业生产中得到广泛应用。随着抗草甘膦转基因作物的大规模种植，其应用范围不断扩大。在过去二十年中，全世界农民使用的草甘膦的量增加了10倍以上。由于长期的过度喷洒，在土壤甚至地下水中都发现了草甘膦残留物。草甘膦在环境中的平均半衰期从几天到100天不等，大量的农药残留会使环境受到污染，进而污染农作物。而草甘膦具有一定的生殖毒性、致畸性和致突变性，可以通过呼吸和接触进入人体，对人体健康遭成不可逆的损伤。因此，迫切需要建立快速检测食品中草甘膦的方法。目前针对草甘膦的快检方法主要是利用贵金属纳米粒子作为比色探针，或是基于纳米材料的过氧化物酶活性。但贵金属纳米粒子的稳定性易受到高盐粒子和阳离子聚合物的影响，而过氧化物酶活性需要易分解的过氧化氢参与，从而影响检测结果的准确性。由于目前针对草甘膦的快速比色检测方法仍存在挑战，因此，迫切需要寻找一种新的传感信号来构建草甘膦的比色快检方法。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其具有肉眼可辨、操作简便、检测快速、成本低廉、选择性好、安全绿色等优势，可广泛应用于实际食品中草甘膦的快速检测。

2、本发明的技术方案是：基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，包含以下步骤：(1)制备标准溶液：立方体ag2o纳米颗粒和6.9-60μg·l-1的草甘膦标准液，充分混匀后加入底物2,4-dp溶液和hepes缓冲液溶液，最后加入4-aap溶液即可制备得到标准溶液；(2)绘制靶标草甘膦浓度与吸光度值变化量标准曲线：测定不同浓度的草甘膦标准溶液与空白样品的吸光度值差值δa作为纵坐标，草甘膦浓度作为横坐标绘制标准曲线；根据标准曲线建立有关靶标草甘膦浓度与吸光度变化之间相互关系的回归方程；(3)检测待测样品：计算待测样品与空白样品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得待测样品中靶标草甘膦的浓度。

3、所述立方体ag2o纳米颗粒的制备方法：将氨水缓慢滴入agno3溶液中，搅拌，边搅拌边向混合物中滴加naoh，伴随着大量棕色沉淀的形成；然后将沉淀物避光静置，后离心收集沉淀物并用乙醇和水洗涤至ph为中性；最后干燥得到的立方体ag2o。

4、所述的吸光度值的检测条件：标准溶液和空白对照液用酶标仪进行扫描测定510nm处吸收峰，全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。

5、所述的回归方程为：当草甘膦浓度为6.9μg·l-1≤c≤60μg·l-1时，其浓度与吸光度值变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0084c+0.074。

6、所述的空白样品：如步骤(1)方法制备的检测溶液，加入超纯水替代草甘膦标准液，处理后作为空白对照体系溶液。

7、所述的草甘膦的线性范围是6.9-60μg·l-1，最低检测限为2.089μg·l-1。

8、本发明的有益效果：本发明人首次发现草甘膦可以增强立方体ag2o纳米颗粒的模拟漆酶活性，使反应溶液从浅红色变成深红色。

9、本发明的基本原理是：立方体ag2o纳米颗粒在ph 7.5的hepes缓冲液下催化底物2,4-dp氧化生成无色的醌类化合物，无色的醌类化合物进一步与4-aap结合生成少量红色产物，使传感溶液呈现出浅红色，并在510nm处有一个特征峰。加入目标草甘膦后，立方体ag2o纳米颗粒与底物2,4-dp之间的电子转移加速，体系内自由基的产量增加，纳米颗粒的模拟漆酶活性被增强，加快氧化底物产生无色的醌类化合物，进而与4-aap结合产生大量的红色产物，且510nm处吸光值变化幅度与目标草甘膦的浓度成正比，因而该方法可以用于草甘膦检测。

10、与现有技术相比，本方法的检测原理为：本文利用具有模拟漆酶活性的立方体ag2o纳米颗粒作为比色探针，并首次发现草甘膦可以增强纳米颗粒的漆酶活性，因而研制了基于增强立方体ag2o纳米颗粒模拟漆酶活性的草甘膦比色快检方法。立方体ag2o纳米颗粒可以催化氧化酚类底物2,4-dp产生无色的醌类化合物，后者与4-aap反应生成少量红色产物。当草甘膦加入后，其吸附在纳米颗粒表面产生低电荷密度的农药-纳米材料复合物，进而吸引大量带相反电荷的底物靠近立方体ag2o纳米颗粒表面，促进立方体ag2o纳米颗粒与2,4-dp之间的电子转移，从而加快了纳米颗粒催化反应体系中自由基的产生，使得纳米颗粒的漆酶活性被增强，反应溶液的颜色呈现深红色。并且所构建的比色传感器的溶液颜色变化程度与草甘膦浓度正相关，因而该方法可以用于实际样本中草甘膦的快速检测。所研制的比色检测方法平均回收率在89.78-96.40％以内，相对标准差(rsd)范围为3.47-5.13％，其检测性能与高效液相色谱法(hplc)分析结果相似。该方法在百草枯、水胺硫磷、毒死蜱、氧乐果、多菌灵、甲基对硫磷、乐果、啶虫脒、毒死蜱、草甘膦、敌敌畏、氟虫腈等干扰性可以特异性地检测草甘膦。所提出的快速检测方法具有检测灵敏度高，特异性强，且操作简单快速，肉眼可辨，可以广泛应用于实际食品样本中草甘膦的快速检测。

11、漆酶是一种绿色催化剂，与过氧化物酶、过氧化氢酶等有着不同的催化机理。漆酶能够催化底物2,4-dp氧化，其氧化产物与4-aap结合产生红色的产物。目前报道的草甘膦比色检测方法都是基于抑制酶活性的，而通过增强漆酶活性的检测方法可以避免检测结果的假阳性。由于漆酶物质鲜少在食品样本中出现，可以避免复杂样品对检测结果的干扰。同时，漆酶的催化过程不需要h2o2的参与，避免了在催化反应中的发生自分解和高毒性等问题。综上所述，本发明人研制了一种基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法。该快检方法具有操作简便、检测快速、成本低廉、选择性好、安全绿色等优势，并且可通过肉眼进行检测结果判断。

技术特征：

1.基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)制备标准溶液：立方体ag2o纳米颗粒和6.9-60μg·l-1的草甘膦标准液，充分混匀后加入底物2,4-dp溶液和hepes缓冲液溶液，最后加入4-aap溶液即可制备得到标准溶液；(2)绘制靶标草甘膦浓度与吸光度值变化量标准曲线：测定不同浓度的草甘膦标准溶液与空白样品的吸光度值差值δa作为纵坐标，草甘膦浓度作为横坐标绘制标准曲线；根据标准曲线建立有关靶标草甘膦浓度与吸光度变化之间相互关系的回归方程；(3)检测待测样品：计算待测样品与空白样品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得待测样品中靶标草甘膦的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：所述立方体ag2o纳米颗粒的制备方法：将氨水缓慢滴入agno3溶液中，搅拌，边搅拌边向混合物中滴加naoh，伴随着大量棕色沉淀的形成；然后将沉淀物避光静置，后离心收集沉淀物并用乙醇和水洗涤至ph为中性；最后干燥得到的立方体ag2o。

3.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：步骤(1)中ag2o纳米颗粒溶液的浓度为2mg·ml-1；2,4-dp溶液的浓度为5mg·ml-1；hepes缓冲液溶液为15mm，ph；4-aap溶液的浓度为1mg·ml-1。

4.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：所述的标准溶液、空白样品或待测样品制备过程中，各试剂的用量比为：ag2o纳米颗粒溶液5μl、2,4-dp 10μl、草甘膦标准液20μl、超纯水20μl、实际样液用量均为20μl，hepes缓冲液溶液用量为415μl；

5.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：所述的吸光度值的检测条件：标准溶液和空白对照液用酶标仪进行扫描测定510nm处吸收峰，全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱。

6.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：所述的回归方程为：当草甘膦浓度为6.9μg·l-1≤c≤60μg·l-1时，其浓度与吸光度值变化量之间相互关系的回归方程为：y＝0.0084c+0.074。

7.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：所述的空白样品：如步骤(1)方法制备的检测溶液，加入超纯水替代草甘膦标准液，处理后作为空白对照体系溶液。

8.根据权利要求1所述的基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：草甘膦的线性范围是6.9-60μg·l-1，最低检测限为2.089μg·l-1。

技术总结
本发明公开了基于增强立方体氧化银漆酶活性的草甘膦比色快检方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)制备标准溶液：立方体Ag<subgt;2</subgt;O纳米颗粒和6.9‑60μg·L<supgt;‑1</supgt;的草甘膦标准液，充分混匀后加入底物2,4‑DP溶液和HEPES缓冲液溶液，最后加入4‑AAP溶液即可制备得到标准溶液；(2)绘制靶标草甘膦浓度与吸光度值变化量标准曲线；根据标准曲线建立有关靶标草甘膦浓度与吸光度变化之间相互关系的回归方程；(3)检测待测样品：计算待测样品与空白样品的吸光度差值，将该吸光度差值代入线性回归方程中，即可获得待测样品中靶标草甘膦的浓度。

技术研发人员：黄小焕,周程寅,吴远根,戴唯,王缅,王兴宁,黄玲慧
受保护的技术使用者：贵阳海关综合技术中心（贵州国际旅行卫生保健中心、贵阳海关口岸门诊部）
技术研发日：
技术公布日：2024/10/21