一种VDAC1通道活性调控剂的筛选方法及其应用与流程

本发明涉及生物学和药学领域，特别涉及一种vdac1通道活性调控剂的筛选方法及其应用。

背景技术：

1、电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1，vdac1)是线粒体外膜上的离子通道，是线粒体与细胞质之间的主要通道。vdac1的电导活性与线粒体呼吸链中的atp合成、电化学势调节等关键过程密切相关，因此研究其电导特性对于了解细胞能量代谢和调节至关重要。vdac1通过调节线粒体膜电位和透过性，参与了细胞凋亡的调控。研究发现，vdac1的电导特性与细胞死亡通路相关，通过调控线粒体内钙离子和细胞凋亡相关蛋白的释放，影响细胞的生存和死亡命运。vdac1与多种疾病的发生和发展密切相关，包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等。研究vdac1通道的电导特性有助于发现新的治疗靶点，并开发针对性的治疗方法，为相关疾病的治疗提供新的途径和策略。此外，许多药物和生物活性分子通过调节vdac1的电导活性来发挥其作用，如抗肿瘤药物、神经保护剂等。因此，深入了解vdac1通道的电导特性，有助于揭示药物的作用机制，并指导药物的设计和开发。

2、膜片钳技术是一种用于测量细胞膜上离子通道电流的高分辨率电生理技术。膜片钳技术能够实时、准确地测量离子通道的电流变化，具有极高的时空分辨率，能够捕捉到通道活性的动态变化，且膜片钳技术还具有高灵敏度、细胞外环境控制、直接性和多功能性等优势，是研究离子通道电生理特性的重要手段之一。但传统膜片钳技术在形成高电阻密封时稳定性低，且记录小的电流信号中容易出现噪音大的问题。

3、记录vdac1通道活动的方法是通过纯化vdca1蛋白，并将其重塑至脂质双分子层后再利用膜片钳记录其通道活动，但纯化vdac1蛋白通常失去了在线粒体内特有的环境和调节机制，容易导致记录的通道活动与真实生理条件下的活性有所偏离。纯化vdac1过程中可能导致蛋白结构的改变或损坏进而影响其功能，导致记录到的通道活性与原始状态下的活性不同。此外，纯化vdac1蛋白需要复杂的技术和设备，并且通常需要较长的时间和大量的资源来完成，记录的技术难度和成本高，不适用于vdac1通道调节剂的高通量筛选。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出一种vdac1通道活性调控剂的筛选方法及其应用。

2、本发明提供了一种vdac1通道活性调控剂的筛选方法，包括如下步骤：

3、(1)在细胞培养液中培养细胞，得到第一细胞，用待测制剂处理第一细胞，得到第二细胞；

4、(2)提取第一细胞和第二细胞中有活性的线粒体，置于低渗电极液中；

5、(3)采用膜片钳技术检测步骤(2)第一细胞的线粒体中vdac1通道电流，记录得到基线电流；

6、(4)采用膜片钳技术检测步骤(2)第一细胞的线粒体中vdac1通道的电流，记录得到电流值a；

7、(5)将步骤(4)得到的电流值a与基线电流进行比较：

8、若电流值a升高，则判定待测制剂为促进剂；若电流值a降低，则判定待测制剂为抑制剂；

9、其中，步骤(2)所述低渗电极液的渗透压为0.3～0.5osm；步骤(3)和(4)中待测的线粒体直径为3～5μm。低渗电极液是确保线粒体形态完整的关键，本发明通过优化低渗电极液的渗透压范围，确保线粒体外膜的完整性，防止线粒体在低渗溶液中被胀破。

10、在一些实施方式中，步骤(2)所述低渗电极液的ph为7.2～7.5。

11、在一些实施方式中，步骤(3)和步骤(4)所述膜片钳技术检测的方法包括：

12、使用微极管尖端接触线粒体外膜，施加正压，形成gω封接；所述微极管尖端大小为1.5～2μm。通过控制微极管开口大小，能够与线粒体外膜具有良好贴合，提高gω封接的成功率，减少背景噪声，提高电流信号的信噪比。

13、在一些实施方式中，所述正压大小为2～10mv。

14、在一些实施方式中，步骤(2)中低渗电极液的组分包括0.3～0.5m蔗糖、10～20mm氯化钾和5～10mm hepes缓冲液。

15、在一些实施方式中，步骤(3)中基线电流及步骤(4)电流值的记录采用了膜片钳放大器系统。

16、在一些实施方式中，所述膜片钳放大器系统为epc10 usb双膜片钳放大器系统。

17、在一些实施方式中，步骤(2)中有活性的线粒体为动物、植物和微生物的细胞中所提取的有活性的线粒体。

18、本发明还提供一种vdac1通道活性调控剂的筛选装置，包括：

19、活性线粒体单元，包括置于低渗电极液中未经处理的细胞中提取的活性线粒体及待测制剂处理后的细胞中提取的活性线粒体；

20、vdac1通道电流检测单元，检测vdac1通道的基线电流以及加入待测制剂处理后的细胞中提取的活性线粒体的vdac1通道电流；

21、数据比较单元，将vdac1通道的基线电流以及加入待测制剂处理后的细胞中提取的活性线粒体的vdac1通道电流的结果进行比较和判定。

22、在一些实施方式中，所述数据比较单元的判定指标为以下任意一项：

23、(i)待测制剂处理后的细胞的线粒体中，vdac1通道电流的升高，优选升高大于100％，则待测制剂为促进剂；

24、(ii)待测制剂处理后的细胞的线粒体中，vdac1通道电流的降低，优选降低大于50％，则待测制剂为抑制剂。

25、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

26、1、本发明利用活性线粒体记录vdac1通道电流变化，维持线粒体内特有的环境和调节机制，避免vdac1本身的三维结构受到破坏，同时保证vdac1在线粒体环境中与周围物质之间的相互作用，保持记录到的通道活性与原始状态下的活性相同，更好的进行生物学活动验证。

27、2、本发明配制的低渗电极液是确保线粒体形态完整的关键，低渗电极液的渗透压范围可以确保线粒体外膜的完整性，拉制的玻璃微管开口范围适应于线粒体大小，可以与线粒体外膜具有良好贴合，提高gω封接的成功率，稳定性高、减少了背景噪声，提高电流信号的信噪比。

28、3、本发明的方法降低了技术复杂度和实验成本，操作方法简便易行、经济高效、结果易于判断，应用本方法可快速、灵敏以及高通量筛选vdac1通道抑制剂。

技术特征：

1.一种vdac1通道活性调控剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述低渗电极液的ph为7.2～7.5。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)所述膜片钳技术检测的方法包括：

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述正压大小为2～10mv。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中低渗电极液的组分包括0.3～0.5m蔗糖、10～20mm氯化钾和5～10mm hepes缓冲液。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中基线电流及步骤(4)电流值的记录采用了膜片钳放大器系统。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述膜片钳放大器系统为epc10 usb双膜片钳放大器系统。

8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中有活性的线粒体为动物、植物和微生物的细胞中所提取的有活性的线粒体。

9.一种vdac1通道活性调控剂的筛选装置，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9所述的筛选装置，其特征在于，所述数据比较单元的判定指标为以下任意一项：

技术总结
本发明公开了一种VDAC1通道活性调控剂的筛选方法及其应用。所述方法包括如下步骤：(1)在细胞培养液中培养细胞，得到第一细胞，用待测制剂处理第一细胞，得到第二细胞；(2)提取细胞中有活性的线粒体，置于低渗电极液中；(3)采用膜片钳技术检测步骤(2)线粒体中VDAC1通道电流，记录得到基线电流；(4)采用膜片钳技术检测步骤(2)线粒体中VDAC1通道的电流，记录得到电流值A；(5)将步骤(3)得到的电流值与基线电流进行比较。本发明在线粒体上记录VDAC1通道电导，可以避免VDAC1本身的三维结构受到破坏，同时保证VDAC1在线粒体环境中与周围物质之间的相互作用，能更好的进行生物学活动验证。

技术研发人员：陈继红,张金鑫,张鹏飞,陈晓
受保护的技术使用者：深圳市宝安区人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/17