灵芝三萜化合物的分离、含量检测方法与流程

本发明涉及灵芝三萜化合物分离领域，尤其是涉及灵芝三萜化合物的分离、含量检测方法。

背景技术：

1、灵芝三萜化合物是一种高度氧化的羊毛甾烷衍生物，化学结构复杂，口味微苦，是灵芝中独特的化学成分，具有多种活性。目前从灵芝中分离的三萜类化合物已超过130种，通过对各种三萜类化合物的化学结构进行分析，根据碳原子数将其分为c30、c27和c24三类；对于结构相似但功能不同的三萜类化合物则通过字母对其进行命名，如灵芝a、b、c、d、e、g、i、l、ma、mb、mc、md、mg以及赤芝酸a、b、c、d、e、f、o等。

2、在ny/t 2278-2012灵芝产品中灵芝酸含量的测定中，以灵芝酸a、灵芝酸b为对照品，采用高效液相色谱法检测灵芝酸a、b含量。在国际标准iso 21315：2018(e)中医药-灵芝标准中，以灵芝酸a为对照品，采用高效液相色谱法检测灵芝酸a含量。在usp版美国药典草药汇编：质量标准-赤灵芝子实体中，以为灵芝酸a和usp赤灵芝子实体提取物粉对照，采用超高效液相色谱仪，完成灵芝酸a含量的检测，及9种灵芝酸(灵芝烯酸c、灵芝酸c2、灵芝酸g、灵芝烯酸b、灵芝酸b、灵芝酸h、灵芝烯酸d、灵芝酸d和灵芝酸f)含量的换算。cn108181396a公开了一种灵芝中17种灵芝三萜化合物含量的检测方法，采用高效液相色谱法，以灵芝酸a为内参物，通过一测多评法测定灵芝中17种灵芝三萜化合物(灵芝酸c2、灵芝酸g、灵芝烯酸b、灵芝酸b、灵芝烯酸a、灵芝酸a、赤芝酸a、灵芝烯酸d、灵芝酸d、灵芝酸f、灵芝烯酸f、灵芝酮三醇、灵芝酸dm、灵芝醇f、灵芝酸t、灵芝醇b、灵芝醛a)的含量。

3、灵芝中的灵芝三萜化合物结构相近难以分离，因此上述灵芝酸检测方法中，灵芝酸种类不多。据此需要一种理想的解决方法。

技术实现思路

1、本发明为了克服灵芝三萜化合物结构相近难分离的问题，提供灵芝三萜化合物的分离、含量检测方法，能分离出23种灵芝三萜化合物并准确测量各自的含量。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、灵芝三萜化合物的分离方法，对样品进行液相分析，流动相a磷酸水溶液、b乙腈，洗脱程序：第0-3分钟b体积比23-27％；第17-19分钟前，b体积比提升1-2％，保持不变至第29-31分钟；第34-36分钟前，b体积比提升至33-37％；第39-41分钟前，b体积比提升至58-62％；第49-51分钟前，b体积比提升至63-67％；第56-58分钟前，b体积比提升至95-97％，保持不变至至少第62分钟；分离灵芝三萜化合物灵芝酸l、灵芝酸i、灵芝烯酸c、灵芝酸c2、赤芝酸c、赤芝酸n、灵芝酸c6、灵芝酸g、灵芝烯酸b、灵芝酸b、灵芝酸a、灵芝酸h、赤芝酸b、灵芝酸c1、赤芝酸d、灵芝酸f、灵芝酸j、灵芝马酮、灵芝酸dm、灵芝酸tr、灵芝醛a、灵芝醇f、灵芝醇b中的至少一种。

4、作为进一步优选，流动相洗脱程序为：

5、

6、作为优选，所述样品为灵芝、灵芝孢子粉、灵芝提取物、灵芝孢子粉提取物中的一种或多种复合物。

7、作为优选，将样品配成样品溶液进行液相分析，样品溶液的配置方法为：将样品用乙酸乙酯超声提取，离心后取上清液除去溶剂，再用甲醇溶解，过滤得样品溶液。

8、作为优选，样品为粒径250-350μm的粉末。

9、作为优选，超声提取的功率为700-900w，时间为15-25min。

10、作为优选，磷酸水溶液的体积浓度为0.05-0.15％。

11、作为优选，液相色谱柱为c18柱，长度为7.5-15cm，填料比表面积90-110m2/g；填充硅胶为粒径2-3μm的表面多孔硅胶颗粒，封端，三键键合，碳载量6-7％。作为进一步优选，液相色谱柱选用waters cortecs c18柱。

12、作为优选，液相色谱的检测波长为248-258nm。

13、作为优选，液相色谱的柱温为30-35℃。

14、作为优选，液相色谱的进样量为5-20μl，流速为1.0-2.0ml/min。

15、本发明还提供灵芝三萜化合物的含量检测方法，在上述分离方法的基础上，分别以灵芝三萜化合物各自的对照品为外标物，通过外标定量法计算灵芝三萜化合物的含量。

16、本发明还提供另一种灵芝三萜化合物的含量检测方法，在上述分离方法的基础上，以灵芝酸a为内参物，通过一测多评法测定灵芝中1-23种灵芝三萜化合物的含量。

17、因此，本发明的有益效果为：(1)调整液相色谱的参数，63min内即可分离出灵芝中23种相近结构的灵芝三萜化合物并准确测量各自的含量，高效便捷。(2)采用一测多评法，利用灵芝有效成分内在函数关系和比例关系，只测定一个成分(灵芝酸a)，即可实现多个成分(23种灵芝三萜化合物)的同步测定。

技术特征：

1.灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，对样品液相分析，流动相a磷酸水溶液、b乙腈，洗脱程序：第0-3分钟b体积比23-27%；第17-19分钟前，b体积比提升1-2%，保持不变至第29-31分钟；第34-36分钟前，b体积比提升至33-37%；第39-41分钟前，b体积比提升至58-62%；第49-51分钟前，b体积比提升至63-67%；第56-58分钟前，b体积比提升至95-97%，保持不变至至少第62分钟；分离23种灵芝三萜化合物灵芝酸l、i、c1、c2、c6、g、b、a、h、f、j、dm、tr，灵芝烯酸b、c、赤芝酸c、n、b、d，灵芝马酮，灵芝醛a，灵芝醇f、b中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，所述样品为灵芝、灵芝孢子粉、灵芝提取物、灵芝孢子粉提取物中的一种或多种复合物。

3.根据权利要求1所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，将样品配成样品溶液进行液相分析，样品溶液的配置方法为：将样品用乙酸乙酯超声提取，离心后取上清液除去溶剂，再用甲醇溶解，过滤得样品溶液。

4.根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，样品为粒径为250-350 μm的粉末。

5.根据权利要求1所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，超声提取的功率为700-900 w。

6.根据权利要求1或5所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，磷酸水溶液的体积浓度为0.05-0.15%。

7.根据权利要求1所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，液相色谱的检测波长为248-258 nm；柱温为30-35 ℃。

8.根据权利要求1或6或7所述的灵芝三萜化合物的分离方法，其特征在于，液相色谱的进样量为5-20 μl，流速为1.0-2.0 ml/min。

9.灵芝三萜化合物的含量检测方法，其特征在于，在权利要求1-8任一灵芝三萜化合物的分离方法基础上，分别以灵芝三萜化合物各自的对照品为外标物，通过外标定量法计算各灵芝三萜化合物的含量。

10.灵芝三萜化合物的含量检测方法，其特征在于，在权利要求1-8任一灵芝三萜化合物的分离方法基础上，以灵芝酸a为内参物，通过一测多评法测定各灵芝三萜化合物的含量。

技术总结
本发明涉及灵芝三萜化合物分离领域，针对灵芝三萜化合物难分离问题，提供灵芝三萜化合物的分离、含量检测方法，分离方法为：对样品进行液相色谱分析，流动相A为磷酸水溶液、B为乙腈，洗脱程序：第0‑3分钟B体积比23‑27%；第17‑19分钟前，B体积比提升1‑2%，保持不变至第29‑31分钟；第34‑36分钟前，B体积比提升至33‑37%；第39‑41分钟前，B体积比提升至58‑62%；第49‑51分钟前，B体积比提升至63‑67%；第56‑58分钟前，B体积比提升至95‑97%，保持不变至至少第62分钟；分离23种灵芝三萜化合物中的至少1种。本发明还提供检测各三萜含量的方法。

技术研发人员：李振皓,李明焱,胡凌娟,陈美红,徐靖,王亚峰,王晓彤
受保护的技术使用者：浙江寿仙谷医药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/24