一种利用AB品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法及应用与流程

本发明属于检测方法，涉及一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法及应用。

背景技术：

1、皮肤是人体最大的器官,完整的皮肤是机体抵御外界物理、化学损伤，生物等抗原物质的侵入、适应外界温度变化影响、防止水分过度丢失的机械屏障，皮肤作为人体三道防线的外层，能够阻挡住大多数病原体的入侵，皮肤的屏障包括物理屏障、色素屏障、神经屏障以及免疫屏障。

2、引发皮肤屏障受损的的原因众多，例如遗传、药物使用不当以及恶劣的环境。遗传原因导致皮肤原生条件太差，加上后天的药物以及化妆品使用不当和较为恶劣的环境影响，导致皮肤屏障受损愈加严重。皮肤屏障受损具体的表现有：皮肤缩水能力变差，导致皮肤干燥、瘙痒甚至脱屑；外界刺激容易进入皮肤引起免疫反应，如泛红、刺痛以及灼热感；较为严重的则会表现为湿疹和皮炎。

3、目前关于屏障修护功效的评价方法有：经皮水分散失(tewl)、三维重组皮肤模型替代法和动物实验法。而现有的皮肤屏障修护评价方法至少存在如下之一的技术缺陷：试验周期长、成本高、无法高效快速的进行大批量的高通量筛选；上述的评价方法中的评价指标如面积、瘙痒感、刺痛感等具有明显的主观性；同时动物实验法不符合3r(减少、替代、优化)原则，不符合动物保护和福利的要求。三维重组实验模型中被认可的3d皮肤模型大多为国外生产的，价格昂贵，其培养和运输成本过高。专利cn116297360a公开了一种利用斑马鱼评价化妆品对皮肤屏障修护功效的方法，但其造模方式为化学性损伤，采用的是先将斑马鱼胚胎放置于含有待测受试物的孔板中，后添加化学诱导剂和荧光染色剂对已经接触过受试物的斑马鱼幼鱼进行屏障损伤诱导与染色。其方法未能很好的针对损伤后如何修护皮肤屏障的这一需求，且其屏障损伤诱导剂与染色剂同时添加，可能会导致两者相互反应，产生假阳性的现象。该方法针对的是屏障受损前，待测样品对未受损皮肤的强韧屏障功效。而大多数人群，由于日常防护不当、化学品的滥用和其他原因已经产生了皮肤屏障损伤。基于此，如何创建新型评价方法，针对皮肤屏障损伤后样品对受损皮肤屏障的修护功效，是目前研究中急需解决的问题。本发明采用物理性损伤模型，能够造成均匀、可控且不使用任何化学物质对斑马鱼胚胎造成一定损伤，能够避免待测物与屏障损伤诱导剂与染色剂间相互反应造成的影响，扩大了待测物的检测范围。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法及应用，采用创新性的斑马鱼皮肤屏障受损造模方式，使用石英砂和涡旋震荡器对斑马鱼进行物理性损伤，构建了斑马鱼皮肤屏障受损模型；将待测样品作用于皮肤屏障受损的斑马鱼模型中，利用荧光染料对斑马鱼表皮的损伤细胞进行染色，观测斑马鱼表皮损伤皮肤的修护面积，从而对待测样品进行屏障修护功效评价。

2、实现上述目的一种技术方案是：一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，包括以下步骤：

3、s1，斑马鱼选取：选取ab品系斑马鱼；

4、s2，空白对照组：将斑马鱼分为空白对照组和实验组，空白对照组不做处理，用损伤细胞荧光染液对空白对照组染色后，将斑马鱼置于体式荧光显微镜下观察，统计斑马鱼全身的损伤细胞面积；

5、s3，实验组造模：将实验组斑马鱼放置于5ml离心管中，加入0.02g石英砂，3ml标准稀释水，涡旋造模；将造模后的受试鱼分为实验对照组和实验样品组，实验对照组造模用标准稀释水处理1h，实验样品组采用受试物溶液处理；用损伤细胞荧光染液对实验对照组和实验样品组分别染色后，将斑马鱼置于体式荧光显微镜下观察，统计斑马鱼全身的损伤细胞面积；

6、s4，数据分析：若空白对照组、实验组存在显著差异，且实验对照组和实验测试组斑马鱼全身的损伤细胞数量存在显著差异，则说明该受试物有一定的斑马鱼屏障修护功效。

7、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其中，所述方法模拟物理损伤进行修复功效检测。

8、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，步骤s3中，所述斑马鱼采用受精后2-5天的ab品系斑马鱼；例如3天、4天、5天等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

9、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，步骤s3中，所述标准稀释水包括氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾和水；涡旋造模的时间为1-10min，例如1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述；实验组造模所用石英砂粒径大小为1-2mm。

10、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，步骤s3中，所述实验样品组采用受试物溶液处理的时间为1-15h，例如1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

11、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，步骤s2和步骤s3中，用损伤细胞荧光染液继进行染色处理的时间为10-60min，例如10min、20min、30min、40min、50min、60min等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

12、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，步骤s2和步骤s3中，所述损伤细胞荧光染液采用hoechst、dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、annexin v(膜联蛋白v)或pi(碘化丙啶染色液)。

13、上述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，步骤s3中，所述实验样品组采用受试物溶液处理在25-30℃下进行，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

14、优选地，染色剂对受试鱼损伤细胞染色处理在25-30℃下进行，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

15、本发明还提供了上述的利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法在检测化妆品原料或成品修护功效中的应用。

16、本发明还提供了上述的利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法在检测功能性食品原料或成品修护功效中的应用。

17、采用本发明的利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法及应用的技术方案，应用活体斑马鱼模型进行皮肤损伤修护功效评，其原理和操作流程简单、经济、高效，且能达到高通量与结果的可视化。利用本发明可直接明了的反映出化妆品及其原料的受损后对皮肤的屏障修护功效，为相关企业提供了较为便捷与科学的检测方式和数据支撑。

技术特征：

1.一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，所述方法模拟物理损伤进行修复功效检测。

3.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，步骤s3中，所述斑马鱼采用受精后2-5天的ab品系斑马鱼。

4.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，步骤s3中，所述标准稀释水包括氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钾和水；涡旋造模的时间为1-10min；实验组造模所用石英砂粒径大小为1-2mm。

5.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，步骤s3中，所述实验样品组采用受试物溶液处理的时间为1-15h。

6.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，步骤s2和步骤s3中，用损伤细胞荧光染液继进行染色处理的时间为10-60min。

7.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，步骤s2和步骤s3中，所述损伤细胞荧光染液采用hoechst、dapi、annexin v或pi。

8.如权利要求1所述的一种利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，其特征在于，步骤s3中，所述实验样品组采用受试物溶液处理在25-30℃下进行。

9.如权利要求1至9任意一项所述的利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法在检测化妆品原料或成品修护功效中的应用。

10.如权利要求1至9任意一项所述的利用ab品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法在检测功能性食品原料或成品修护功效中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用AB品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法，包括选择AB品系斑马鱼、受试鱼造模处理、受试鱼给药处理、受试鱼染色处理、计算斑马鱼全身损伤细胞面积。应用活体斑马鱼进行屏障修护功效评价具有简单、快速、经济、高效、高通量、可视化等优点。本发明还公开了一种利用AB品系斑马鱼检测屏障修护功效的方法的应用，对功效性化妆品领域、功能性食品领域产品的安全性评价有重要意义。

技术研发人员：马文静,胡静,范栋杰,安晓虹,张超,王飞飞,马骁,郭振宇
受保护的技术使用者：云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31