一种基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法与流程

本发明涉及生物检测，具体而言，涉及一种基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法。

背景技术：

1、病原体和宿主生物标志物的定量对于疾病的诊断、监测和治疗至关重要。纵向生物标志物分析需要快速样品处理，能够检测样品之间的微小差异（即高分辨率）和低浓度的分析物（即低检测限），同时使用尽可能少的生物样品。需要高分辨率来确定不同时间点的不同读数是否对应于真正的生物学差异或测量噪声。然而，大多数用于细胞因子定量的市售分子检测平台都是基于elisa，其灵敏度通常较差，不适合与其他类型的生物标志物（如dna和rna）同时测量，并且需要大量样品。

2、邻位连接技术(proximity ligation assay，pla)是基于酶联机制和连接子(一种人工设计的线状寡核苷酸单链，其两端可以与特定靶序列互补。当连接子与靶序列杂交时，在空间上就会彼此靠近，探针的两个末端就可以在dna连接酶的作用下连接成链)而建立的一种高灵敏度的蛋白质体外分析技术。该方法首先利用一对邻位探针对靶分子进行双识别，产生可扩增的检测信号，再通过定量pcr实现定时定量检测，将对蛋白质的检测转化为对dna的检测，具有极高的灵敏性和特异性。pla可以分析低丰度蛋白质通过扩增抗体-抗原结合事件的信号，使其适用于开发用于同时定量蛋白质和核酸靶标的多重检测。然而，传统的pla依赖于实时荧光定量pcr（qpcr）读数，依赖于标准品和通过曲线拟合形成的标准曲线，其测量噪声高，分辨率低，精确性低、灵敏度低。

技术实现思路

1、本发明就是为了解决现有基于pla的实时荧光定量pcr检测方法灵敏度低、精确度低的技术问题，提供一种灵敏度高、精确度高的基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法。

2、本发明将反应体系平均分布于数万个液滴体系中，通过核酸扩增对其进行信号扩增，从而提高液滴中低浓度蛋白的信号检出率，可进行多重蛋白检测定量。

3、本发明提供一种基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法，包括以下步骤：

4、第一步，制备邻位探针对，邻位探针对由邻位探针i和邻位探针ii组成；邻位探针i由含有巯基基团的抗体i与5’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链i偶联而成，寡核苷酸链i的核苷酸序列如seq id no.1所示；邻位探针ii由含有巯基基团的抗体ii与3’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链ii偶联而成，寡核苷酸链ii的核苷酸序列如seq id no.2所示；抗体i和抗体ii为特异性识别细胞因子的单克隆抗体，二者具有不同的抗原决定簇；

5、第二步，用抗体稀释液分别将邻位探针i和邻位探针ii稀释，再将稀释后的邻位探针i和邻位探针ii混合均匀，制得邻位探针混合液，邻位探针混合液中邻位探针i的浓度为500ng/ml，邻位探针混合液中邻位探针ii的浓度为500ng/ml；

6、第三步，取待检测样本，邻位探针混合液与待检测样本的体积比是1:1，向待检测样本加入邻位探针混合液，进行孵育从而制得孵育液；

7、第四步，配制pcr反应体系，pcr反应体系包括2.0μl连接子、2.0μl t4 dnaligase、3.5μl forward primer、3.5μl reverse primer、1.5μl taqman probe、0.5μldntp、2.0μl atp、15.0μl buffer、0.5μl taq dna polymerase、1.0μl bsa、1.0μl tween-20、12.5μl ddh2o ；连接子如seq id no.3所示，forward primer如seq id no.4所示，reverse primer如seq id no.5所示，taqman probe如seq id no.6所示，taqman probe的5'端标记有fam荧光报告基团；

8、第五步，将pcr反应体系与孵育液在孔板中混合，孵育液与pcr反应体系的体积比是1:9，混合后在pcr扩增模块中运行连接反应，制得pcr预混液；

9、第六步，将pcr预混液分为众多微液滴，微液滴的直径为50um；

10、第七步，对众多微液滴进行pcr扩增反应；

11、第八步，通过激光共聚焦显微镜采集扩增反应后的众多微液滴的图像；

12、第九步，对图像进行计算处理，计算出待测定分子的数量。

13、优选地，第六步是通过微流控芯片将pcr预混液分为众多微液滴；

14、微流控芯片设有样品通道、油相通道、样品进样口、油相进样口、出口、收集腔，油相通道整体呈矩形，样品通道整体呈直线形，样品通道与油相通道的一侧十字交叉，油相进样口通过通道与油相通道的另一侧连通，样品进样口与样品通道的一端连通，样品通道的另一端与收集腔连通，出口与通过通道与收集腔连通，收集腔设有微坝阵列；

15、通过一个微量注射泵将pcr预混液从微流控芯片的样品进样口注入，通过另一个微量注射泵将油相从油相进样口注入，pcr预混液被分为众多微液滴并分布在收集腔中，油相流经收集腔后从出口排出；用pdms材质的盖板将样品进样口、油相进样口和和出口封闭。

16、优选地，第九步，将图像中的微液滴区分为阳性液滴和阴性液滴，然后根据阳性液滴和阴性液滴的数目计算出待测定分子的数量。

17、优选地，第七步中，pcr扩增反应的条件是：95℃扩增酶热激活10min，热激活后，进行35个pcr循环；

18、第五步中，连接反应过程中：ligation过程的温度是37℃、时长是30min，灭活过程的温度是65℃、时长是10min。

19、本发明的有效效果是，本发明将反应试剂平均划分为众多微小的微滴，进行单分子模板pcr扩增，根据阳性反应单元数目计算样品中的蛋白质和mrna拷贝数，无需要依赖标准曲线和标准品，对比传统实时荧光定量pcr判读更为简洁，灵敏度和精确性更高。能够直接量化测量蛋白质和mrna拷贝数，能够量化这些分子浓度的非常小的变化，能够实现蛋白质靶标的亚飞摩尔级分辨率。

20、将反应体系平均分布于数万个液滴体系中，通过核酸扩增技术对其进行信号扩增，提高了液滴中低浓度蛋白的信号检出率。

21、本发明可进行多重蛋白与核酸定量检测，该流程不涉及清洗步骤，无需额外提供微球等手段提高落孔率，简化了操作步骤，提高了检测灵敏度。

22、本发明不涉及清洗步骤，有利于提高检测灵敏度。

23、本发明能够同时定量蛋白质和核酸靶标的多重检测。

技术特征：

1.一种基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法，其特征是，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法，其特征在于，所述第六步是通过微流控芯片将pcr预混液分为众多微液滴；

3.根据权利要求2所述的基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法，其特征在于，所述第九步，将图像中的微液滴区分为阳性液滴和阴性液滴，然后根据阳性液滴和阴性液滴的数目计算出待测定分子的数量。

4.根据权利要求1或2所述的基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法，其特征在于，所述第七步中，pcr扩增反应的条件是：95℃扩增酶热激活10min，热激活后，进行35个pcr循环；

技术总结
本发明提供一种基于邻位连接的用于检测低丰度生物标志物蛋白定量的单分子检测分析方法，解决了现有基于PLA的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度低、精确度低的技术问题。本发明将反应体系平均分为众多微液滴体系，在微液滴内部完成QPCR或者PCR循环扩增反应，实现信号放大，从而精确定量蛋白浓度。本发明将反应体系平均分布于众多液滴体系中，通过核酸扩增技术对其进行信号扩增，从而提高液滴中低浓度蛋白的信号检出率，可进行多重蛋白检测定量。

技术研发人员：梁宇,潘伦,邹灵龙,张贺峰
受保护的技术使用者：国科温州研究院（温州生物材料与工程研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/8/13