基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法及探针与流程

本申请涉及生物检测，具体为基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法及探针。

背景技术：

1、糖蛋白是最常见的蛋白质类型，在生物体中具有多种作用和功能，还具有重要的临床诊断价值，目前用于疾病诊断的蛋白质疾病标志物大多为糖蛋白。

2、高灵敏电化学适体检测可以直接分析复杂样品中的相关生物标志物，从而实现快速的诊断、治疗和监测。为实现对糖蛋白的高灵敏电化学适体检测，现有方法一般是借助于酶或纳米材料的信号放大作用，然而二者都存在成本高昂、稳定性差、过程复杂等不足。目前已出现对探针进行改进，构建反应系统，以提高检测效果的研究，但效果各异，因此，对此领域相关技术仍需进一步开发。

技术实现思路

1、本申请提供了基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法及探针，该方法可以有效地触发以催化发卡环组装(cha)和级联杂交反应(chr)为基本反应单元的包含正反馈机制的dna电路，显著增强信号，尤其是以骨桥蛋白(opn)和骨钙素(oc)等骨健康相关糖蛋白标志物的检测为目标。

2、本申请的一个目的在于提供基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，包括引发探针t和六条发卡环探针h1、h2、h3、h4、h5、h6，所述引发探针t包括核心片段和polyt片段，所述核心片段包括如seq id no：7所示序列，

3、所述探针h1与所述引发探针t的核心片段部分互补，所述探针h1与所述引发探针t杂交形成t-h1双链，

4、所述探针h2与所述探针h1部分互补，所述探针h2杂交形成h1-h2双链，暴露出单链片段i，

5、所述探针h3与所述单链片段i部分互补，所述探针h4与所述单链片段i部分互补，所述探针h5与所述探针h4部分互补，所述探针h5标记有荧光基团和淬灭基团，所述探针h6与所述探针h5部分互补，h3、h4、h5和h6在所述单链片段i存在的条件下，依次杂交形成长链i-(h3-h4-h5-h6)n，所述长链i-(h3-h4-h5-h6)n暴露出所述引发探针t的序列。

6、优选地，所述荧光基团包括fam、joe、cy3或tamra，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2或dabcyl。

7、优选地，所述荧光基团和所述淬灭基团分别修饰在探针两端。

8、优选地，所述polyt片段为6～8个连续胸腺嘧啶。

9、优选地，所述探针h1包括5'-tctctatcattagtcggcttcatcttcatctccgactaatgataagaaca ctc-3'(seq id no：1)序列，所述探针h2包括5'-tcggcttcatcttcatctccgacactctctctatcattagtcggagatg aagatgaagccgactaatg-3'(seq id no：2)序列，所述探针h3包括5'-gagtgtcggagatgaagatgaagccatcgtgcttcatcttcatctccg-3'(seq id no：3)序列，所述探针h4包括5'-gagtgttgcttcatcttcatctccggttttgcggagatgaagatgaag cacgatg-3'(seqid no：4)序列，所述探针h5为在seq id no：5序列5'-caaaaccggagatgaagatgaagcttgcctgcttcatcttcatctccg-3'(seq id no：5)基础上，在第12位和第13位间标记fam荧光基团，以及在第42位和第43位间标记bhq1淬灭基团，具体序列为5'-caaaaccggaga/fam/tgaagatgaagcttgcctgcttcatcttca/bhq1/tctccg-3'，所述探针h6包括5'-gcttcatcttcatctccgacactccggagatgaagatgaagcaggcaa ctctatcattagtcg-3'(seq id no：6)序列。

10、本申请还包括任一上述的探针在基于硼酸识别作用的糖蛋白检测中的应用。

11、本申请还包括任一所述的探针在制备基于硼酸识别作用的糖蛋白检测产品中的应用。

12、本申请另一个目的在于提供一种基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法，使用如任一上述的探针进行检测，包括以下步骤：

13、(1)取活化磁珠溶液进行磁性分离，洗涤后，将磁珠表面的羧基基团与目标蛋白核酸适体末端的氨基基团进行偶联，得到适体功能化磁珠(apt@mbs)，

14、(2)所述引发探针t活化后，所述引发探针t末端的羧基基团与同时具有氨基和苯硼酸基团的化合物a的氨基基团进行偶联，得到修饰后的所述引发探针t(pba-t)，

15、(3)将apt@mbs和待测样品进行反应，洗涤，将得到的磁珠重悬，向重悬液中加入pba-t反应，洗涤，将得到的磁珠重悬，向重悬液中依次加入所述探针h1、h2、h3、h4、h5、h6反应，

16、(4)测定步骤(3)最后所得到的上清液的荧光信号。

17、优选地，步骤(1)使用的活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或nhs，步骤(2)使用的活化试剂为nhs和n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基盐酸碳二亚胺。

18、优选地，步骤(2)所述化合物a为3-氨基苯硼酸(3-apba)。

19、优选地，任一上述的基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法在对opn或oc检测中的应用。

20、本申请技术方案实现的有益效果：

21、一是本申请的探针可以介导具有正反馈机制的dna电路，dna电路由cha和chr两个阶段组成。具体地，一方面，cha和chr均天然具有一定的信号放大能力，例如，借助cha，一个引发探针t可以介导多个循环的h1和h2的组装杂交，形成n个h1-h2双链产物，产生1：n的信号放大效果；借助chr，一个触发单链片段i可以介导多组h3、h4、h5和h6的依次杂交，形成长链i-(h3-h4-h5-h6)n，同样产生1：n的信号放大效果。另一方面，在本申请中，cha和chr两个反应之间存在正反馈机制，即cha反应的产物可以启动chr反应，而chr反应的产物也可以作为cha反应的启动分子，两个反应可以以正反馈的方式连续进行，进一步增强了信号放大的效果。

22、二是本申请的检测方法灵敏度高，可以实现cha和chr以正反馈的方式连续进行，实现引发探针t、h1、h2、h3、h4、h5、h6等探针的互补杂交，使得标记于探针h5两端的荧光基团和淬灭基团在空间上彼此远离，产生显著放大的荧光信号，实现信号扩增。

23、三是本申请的检测方法方便，具有通用性，硼酸亲和识别的激活dna电路适用于任何糖蛋白，仅需更换所用核酸适体，即可用于其他糖蛋白或含糖物质。

24、四是本申请的探针和检测方法，经大量验证，尤其适合以opn和oc等骨健康相关糖蛋白标志物的检测为目标。

技术特征：

1.基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，其特征在于，包括引发探针t和六条发卡环探针h1、h2、h3、h4、h5、h6，所述引发探针t包括核心片段和polyt片段，所述核心片段包括如seq id no：7所示序列，

2.根据权利要求1所述的基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，其特征在于，所述荧光基团包括fam、joe、cy3或tamra，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2或dabcyl。

3.根据权利要求1所述的基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，其特征在于，所述荧光基团和所述淬灭基团分别修饰在探针两端。

4.根据权利要求1所述的基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，其特征在于，所述polyt片段为6～8个连续胸腺嘧啶。

5.根据权利要求1或2所述的基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，其特征在于，所述探针h1包括如seq id no：1所示序列，所述探针h2包括如seq id no：2所示序列，所述探针h3包括如seq id no：3所示序列，所述探针h4包括如seq id no：4所示序列，所述探针h5为在seq id no：5序列基础上，在第12位和第13位间标记fam荧光基团，以及在第42位和第43位间标记bhq1淬灭基团，所述探针h6包括如seq id no：6所示序列。

6.权利要求1～5任一所述的探针在制备基于硼酸识别作用的糖蛋白检测产品中的应用。

7.一种基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法，其特征在于，使用如权利要求1～5任一所述的探针进行检测，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的一种基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法，其特征在于，步骤(1)使用的活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺或nhs，步骤(2)使用的活化试剂为nhs和n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基盐酸碳二亚胺。

9.根据权利要求7所述的一种基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法，其特征在于步骤(2)所述化合物a为3-氨基苯硼酸。

10.权利要求7～9任一所述的一种基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法在对骨桥蛋白或骨钙素检测中的应用。

技术总结
本申请提供基于硼酸识别作用的糖蛋白检测方法及探针。基于硼酸识别作用的糖蛋白检测用探针，包括引发探针T和六条发卡环探针H1、H2、H3、H4、H5、H6，所述引发探针T包括核心片段和polyT片段，所述核心片段包括如SEQ ID NO：7所示序列。本申请的探针可以介导具有正反馈机制的DNA电路，DNA电路由CHA和CHR两个阶段组成。具体地，一方面，CHA和CHR均天然具有一定的信号放大能力。另一方面，在本申请中，CHA和CHR两个反应之间存在正反馈机制，两个反应可以以正反馈的方式连续进行，进一步增强了信号放大的效果。

技术研发人员：潘文明,张文举
受保护的技术使用者：常熟市第二人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/11/11