一种微生物荧光探针的制备方法及所得产品与流程

本发明涉及一种微生物荧光探针的制备方法及所得产品，该微生物荧光探针具有碱性几丁质酶特异性，表面负载的ag与碱性几丁质酶特异性链接后可以标记不同的阴道微生物，可用于各种阴道疾病的早期诊断，属于发光材料及应用。

背景技术：

1、荧光碳点是一种新型荧光纳米材料，其尺寸通常小于100 nm，通常由碳水化合物热处理得到，目前不同发光颜色的碳点已具备一定的市场，可直接购买。碳点具备较高的抗光漂白稳定性、无毒、生物相容性、容易制备等特点，安全环保，有望取代镉基量子点及含铅的钙钛矿量子点，在药物递载、生物标记、离子检测、发光二极管照明上均有较高的应用前景。

2、碳点在生物传感器、医学成像设备和发光二极管的领域中有重要的应用。通常，发光碳点的发光峰比较宽，且发光效率不高，特异性不足，表面官能团的非特异性键合影响检测敏感性，因此限制了其应用，所以，在保证碳点发光亮度的前提下，对表面进行改性，提高特异性结合效率成为焦点。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种微生物荧光探针的制备方法及所得产品，该方法以s掺杂的碳点作为荧光指示剂，通过硫与ag离子的反应完成ag负载，该方法制备过程可控，可重复性好，便于工业化生产，所得探针发光亮度高，颜色可调，稳定性好，表面经过ag改性，与碱性几丁质酶可实现特异性结合，可用于标记不同的阴道微生物，适用于各种微生物感染引起的阴道疾病的早期诊断。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种微生物荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

4、（1）将硫掺杂碳点进行冷冻干燥，得到碳点粉末；

5、（2）将步骤（1）得到的碳点粉末与可溶性银盐研磨混合均匀，然后将所得混合物放入乙醇中进行溶剂热预处理；

6、（3）将溶剂热预处理后的混合物在惰性气氛下进行煅烧；

7、（4）将煅烧后的样品与碱性几丁质酶在水中进行反应，得到微生物荧光探针。

8、进一步的，本发明所用的发光碳点为硫掺杂碳点，其颜色在可见光范围，可以选择各种颜色，碳点可以是直接购买的商业产品，也可以根据文献资料自行合成（例如参考文献报道的方法：carbon 203 (2023) 1–10，carbon 203 (2023) 1–10，carbon 190 (2022)22-31）。该硫掺杂碳点的尺寸在100 nm以内，硫的掺杂量为0.5-1wt%，例如0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%。选择硫掺杂碳点的目的是为了能将银离子成功的引入到碳点中。

9、进一步的，步骤（1）中，硫掺杂碳点先进行冷冻干燥，然后再与可溶性银盐进行研磨混合。冷冻干燥的目的是防止碳点团聚，具有更好的分散性，保持碳点亮的发光。冷冻干燥的操作可以为：将样品放入冷冻干燥机中，在-15℃～-20℃处理10-11小时。

10、进一步的，步骤（2）中，所述可溶性银盐为硝酸银或氯化银。

11、进一步的，步骤（2）中，冷冻干燥得到的碳点粉末与可溶性银盐的质量比为1:0.1-0.8，例如1：0.1、1：0.2、1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8。

12、进一步的，步骤（2）中，研磨在研钵中进行即可。研磨的目的是使碳点粉末和可溶性银盐充分的混合均匀，为后续银的负载提供有利的保证。研磨时间为3-8小时，例如3h、4h、5h、6h、7h、8h。

13、进一步的，步骤（2）中，溶剂热预处理为低温溶剂热预处理，先将碳点粉末和银盐的混合物进行预处理，可以使银离子与碳点中的硫进行预反应，防止银盐在高温下分解长成大颗粒。溶剂热预处理在密封下进行，溶剂热预处理的温度为70-90℃，例如70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，时间为0.5-3小时，例如0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h。

14、进一步的，步骤（2）中，溶剂热预处理时，混合物在乙醇中的浓度为30-50wt%，例如30%、35%、40%、45%、50%。

15、进一步的，步骤（3）中，煅烧的目的是在高温下完成ag的原位还原。惰性气氛由惰性气体提供，所述惰性气体可以为氮气、氩气等。

16、进一步的，步骤（3）中，煅烧温度为300-400℃，例如300℃、310℃、320℃、330℃、340℃、350℃、360℃、370℃、380℃、390℃、400℃。煅烧时间一般为20-60分钟，例如20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟。

17、进一步的，步骤（4）中，将煅烧完得到的样品水洗干燥，然后与碱性几丁质酶在水中进行反应，得到表面修饰碱性几丁质酶的发光碳点，即为微生物荧光探针。

18、进一步的，步骤（4）中，碱性几丁质酶的负载量按照常规临床检测要求确认，例如煅烧后的样品与碱性几丁质酶的质量比可以为1：0.01-0.1，例如1:0.01、1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.06、1:0.07、1:0.08、1:0.09、1:0.10。

19、进一步的，步骤（4）中，水的用量无特殊要求，仅为反应提供介质环境。

20、进一步的，步骤（4）中，煅烧后的样品与碱性几丁质酶的反应时间约为5-10小时，例如5h、6h、7h、8h、9h、10h。

21、本发明以硫掺杂碳点为原料，硫存在在碳点的网络里，硫成分先与银结合，将银负载到碳点上，然后再将碱性几丁质酶与银结合形成微生物的特异性结合位点。本发明微生物荧光探针发光亮度高，发光峰窄，与碱性几丁质酶能够特异性结合，特异性强，可以用于阴道微生物检测，也在本发明保护范围之内。

22、进一步的，本发明微生物荧光探针能够用于检测各种阴道微生物，所述阴道微生物是指引起阴道炎的各种致病微生物，如滴虫、真菌等。

23、本发明具有以下有益效果：

24、1、本发明采用特殊的方法制备了微生物荧光探针，前期的研磨及溶剂热预处理确保了ag离子的均匀分布，惰性条件下的煅烧处理使ag与s元素结合形成碱性几丁质酶特异性结合位点，特异性强，且发光亮度高，克服了目前的发光碳点发光峰宽、光效率不高、特异性不足、检测敏感性低的不足。

25、2、本发明制备方法简单、易于实施，过程可控，可重复性好，便于工业化生产，所得微生物荧光探针粒度均匀，发光性能优异，颜色可调，稳定性好，表面经过ag改性，与碱性几丁质酶可实现特异性结合，可用于标记不同的阴道微生物，适用于各种微生物感染引起的阴道疾病的早期诊断。此外，由于表面修饰了ag，也可链接其它特异性识别分子用于不同的检测领域，在生物探针、荧光示踪、发光等领域也具有很好的应用前景。

技术特征：

1.一种微生物荧光探针的制备方法，其特征是包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，硫掺杂碳点中硫的掺杂量为0.5-1wt%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，冷冻干燥在-15℃～-20℃下进行，处理时间为10-11小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，所述可溶性银盐为硝酸银或氯化银。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，碳点粉末与可溶性银盐的质量比为1:0.1-0.8。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，研磨时间为3-8小时。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，溶剂热处理的温度为70-90℃，时间为0.5-3小时；优选的，混合物在乙醇中的浓度为30-50wt%。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（3）中，煅烧温度为300-400℃；优选的，煅烧时间为20-60分钟。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤（4）中，煅烧后的样品与碱性几丁质酶的质量比为1：0.01-0.1。

10.按照权利要求1-9中任一项所述的制备方法制得的微生物荧光探针。

技术总结
本发明公开了一种微生物荧光探针的制备方法及所得产品，将硫掺杂碳点进行冷冻干燥，得到碳点粉末；将碳点粉末与可溶性银盐研磨混合均匀，然后将所得混合物放入乙醇中进行溶剂热预处理；将溶剂热预处理后的混合物在惰性气氛下进行煅烧；将煅烧后的样品与碱性几丁质酶在水中进行反应，得到微生物荧光探针。本发明制备方法简单、易于实施，碳点改性后仍然保持高的发光亮度、单色性好，发光性能稳定。表面负载的Ag与碱性几丁质酶特异性链接后可用于标记不同的阴道微生物，可用于各种阴道疾病的早期诊断，也可链接其它特异性识别分子用于不同的检测领域，具有很好的应用前景。

技术研发人员：亓德胜,张晓,杨萍,蒋三平,亓涵,李忠春,武建伟,孙燕燕,梁玉,宋建辉
受保护的技术使用者：济南德亨医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/10/10