一种味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法

本发明属于食品风味，具体涉及一种味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法。

背景技术：

1、味觉是人们重要的感知方式，基本的味觉反应包括甜、酸、苦、咸、鲜5种。人们对味觉的感知依赖于味觉受体，食品风味成分和味觉受体相互作用，向机体发出信号，从而产生对食品的味觉响应。近年来，随着分子生物学、细胞生物学等技术手段突飞猛进的发展，人们对味觉受体的认知快速增长，呈味物质和受体的相互作用机制研究愈发深入，味觉受体领域正逐渐成为研究热点。

2、对味觉受体的探索已经进入分子生物学和神经生物学水平，目前主要采用计算机模拟和分子生物实验结合等手段对受体进行探索。如今在食品风味成分和味觉受体相互作用研究中，干实验计算机模拟分析已经得出很好的研究结果，但缺乏一定的湿实验客观验证，因此需要寻找一种可以对呈味成分和味觉受体相互作用研究进行客观证实的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提出一种味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，该方法运用微量热泳动技术分析味觉受体蛋白和呈味配体的相互作用，灵敏度高，操作简便，检测快速高效，样品消耗少量，弥补了现有技术中味觉受体蛋白与呈味配体相互作用方法研究空缺的问题。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，包括如下步骤：

4、1)配制检测溶液：

5、①味觉受体蛋白受试液的制备：将经荧光染料标记过的味觉受体蛋白用缓冲溶液溶解；

6、②呈味配体受试储备液的制备：取呈味配体标准品用所述缓冲溶液溶解定容，作为初始浓度的呈味配体受试储备液；

7、③微量热泳动仪测试样品的制备：使用所述味觉受体蛋白受试液以及所述呈味配体受试储备液配制梯度浓度的呈味配体与恒定浓度的味觉受体蛋白测试样品；

8、2)微量热泳动仪参数设置：使用微量热泳动仪对①中的所述味觉受体蛋白受试液进行预测试，根据预测试结果设定测量参数；

9、3)味觉受体蛋白与呈味配体亲和力的测定：根据2)的测试参数，按照所述呈味配体的实际浓度设置配体初始浓度，设定测试温度，吸取步骤2)③中测试样品，将所述测试样品放置于微量热泳动仪内测试呈味配体与味觉受体蛋白的相互作用；

10、4)亲和力数据处理与分析：通过微量热泳动仪的内置数据处理软件mo.control和mo.affinityanalysis计算得到解离常数kd值进行数据结果处理分析，得到味觉受体蛋白与呈味配体的结合能力及热动力学参数。

11、一些实施例中，所述味觉受体蛋白包括但不限于t1r2味觉受体和t1r3味觉受体。

12、一些实施例中，步骤1)中所述味觉受体蛋白受试液的浓度为2～20μm。

13、一些实施例中，步骤1)中所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液和brij缓冲溶液；较佳地，所述缓冲溶液的浓度范围为1-10mm；

14、一些实施例中，所述缓冲溶液为1x pbs，0.05％brij缓冲溶液；优选的，所述1xpbs的ph值为7.4。

15、一些实施例中，所述缓冲溶液的配置方法包括：取10x pbs缓冲溶液及固体brij，用去离子水稀释配制1x pbs，0.05％brij缓冲溶液。

16、一些实施例中，步骤(1)②中所述呈味配体受试储备液的浓度范围为10-100mm。

17、一些实施例中，步骤(1)③中所述味觉受体蛋白受试液的浓度为20nm。

18、一些实施例中，步骤2)中的所述味觉受体蛋白受试储备液中所述受体蛋白浓度采用超微量分光光度计测量。

19、本发明中，步骤2)取两根毛细管重复吸取一定浓度的蛋白受体分子，放置微量热泳动仪中进行预测试。需确定产生足够荧光强度的蛋白受体浓度，检查待测蛋白是否与毛细管吸附，检测待测蛋白是否产生聚集。当产生足够荧光强度，无吸附，无聚集再进行正式测定。

20、一些实施例中，步骤3)所述测定的温度范围为15℃-45℃。

21、步骤3)将味觉受体溶液与呈味配体溶液分别混合，制得一系列浓度梯度样品混合物，取毛细管吸取样品混合物，放置微量热泳动仪中进行测定。具体的，样品制备需使用小体积离心管进行梯度稀释，优选地，使用低吸附pcr管；需精准移液，并需要移液器吹打20次；不要触碰毛细管中心区域。

22、步骤4)分别测量味觉受体蛋白与呈味配体的样品混合物的荧光，并且将得到的归一化荧光相对于时间作图，拟合mst轨迹线，确定解离常数kd值，通过微量热泳动仪的内置数据处理软件mo.control和mo.affinity analysis计算得到解离常数kd值进行数据结果处理分析，得到味觉受体蛋白与呈味配体的结合能力及热动力学参数。

23、本发明的积极进步效果在于：

24、与现有检测方式相比，本发明的一种研究味觉受体蛋白与呈味配体间相互作用的方法，弥补了味觉受体蛋白与呈味配体间相互作用研究技术的不足，该方法简单快捷，结果直观可靠，且适用性广泛，帮助人们更好地理解味觉受体蛋白与呈味配体之间的相互作用，为探究味觉受体蛋白与呈味配体间相互作用提供了客观验证的方法支持。

技术特征：

1.一种味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述味觉受体蛋白受试液的浓度为2～20μm。

3.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液和brij缓冲溶液；较佳地，所述缓冲溶液的浓度范围为1-10mm。

4.根据权利要求3所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为1x pbs，0.05％brij缓冲溶液；优选的，所述1x pbs的ph值为7.4。

5.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，步骤(1)②中所述呈味配体受试储备液的浓度范围为10-100mm。

6.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，步骤(1)③中所述味觉受体蛋白受试液的浓度为20nm。

7.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，步骤3)所述测定的温度范围为15℃-45℃。

8.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，步骤2)中的所述味觉受体蛋白受试储备液中所述受体蛋白浓度采用超微量分光光度计测量。

9.根据权利要求1所述的味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，其特征在于，所述味觉受体蛋白包括但不限于t1r2味觉受体和t1r3味觉受体。

技术总结
本发明公开了一种味觉受体蛋白与呈味配体相互作用的分析方法，包括如下步骤：对味觉受体蛋白与呈味配体进行实验前处理；利用微量热泳动技术仪对味觉受体蛋白与呈味配体的分子互作实验进行预测试；测试通过，进而进行二者之间亲和力检测；最后对亲和力结果进行分析，以此研究味觉受体蛋白与呈味配体之间分子相互作用的效果。本发明是一种全新的研究味觉受体蛋白与呈味配体之间分子互作的方法，弥补了味觉受体蛋白与呈味配体间相互作用研究的不足，该方法简单快速，结果直观可靠，适用性广泛。

技术研发人员：肖作兵,王厚旺,朱建才,张静,牛云蔚,周如隽,王恒
受保护的技术使用者：上海应用技术大学
技术研发日：
技术公布日：2024/11/21