一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法

本发明涉及生物检测，具体涉及一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，简称hp)是一种生活在人胃黏膜的有多根鞭毛、呈螺旋形、s形、末段呈弯曲状的革兰氏阴性细菌。幽门螺旋杆菌微需氧，生长营养要求高，且生长缓慢，菌落细小、针尖状、半透明、不溶血。hp对胃上皮细胞有特殊的亲和性，自然条件下，大量hp主要出现在胃上皮细胞表面、细胞间隙及胃小凹中。

2、我国总体家庭幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)感染率为71.2％，个体感染率40.6％，hp感染和胃癌筛查不足是我国胃癌高发的关键因素。幽门螺杆菌在胃癌和malt淋巴瘤的发生发展中起着重要作用。1994年who将幽门螺旋杆菌列为一类致癌物。研究表明幽门螺杆菌的根除可以显著降低散发性胃癌发病率。鉴于幽门螺杆菌感染率高，医疗资源有限，自检有助于诊断和及时治疗。因此，检测消化道排泄物是否存在hp抗原对于诊断hp感染具有非常现实的临床意义。

3、目前，根据采样类型分为有创和无创两种方法诊断幽门螺杆菌感染。侵入性检查需要活检标本。然后对组织样本进行病原体分离鉴定、快速脲酶试验或药敏试验。胃活检标本是检验幽门螺杆菌感染的金标准。然而，侵入性化验使患者感到不舒适，需要特定的仪器和训练有素的专业人员。非侵入性检测包括13c和14c呼气试验、粪便抗原试验和血清抗体试验，这些被广泛用于检测。然而，13c和14c呼吸试验不能将幽门螺杆菌与其他也能产生脲酶的细菌区分开来，并且呼气试验需要专用设备，废弃物需特殊处理，存在放射线，不适合儿童和孕妇检查，不能自查。幽门螺旋杆菌igg系列抗体血清学检测以血液为标本，需在实验室完成，实验结果不能判断是现症感染或是既往感染，不适合治疗后复查，监测疗效，不适合自查。粪便抗原检测依赖于侧流免疫法(lfia)和胶体金法，具有快速(15～20分钟)、易于使用、成本低的优点，但是胶体金的检测灵敏度低，容易造成漏检。荧光免疫层析(fica)是在免疫层析技术的基础上，通过检测荧光信号强度能够定量检测待测物浓度的技术。fica具有检测快速、灵敏度高、稳定性强和成本低等特点，其局限性与免疫层析标记原料的选择密切相关。随着纳米材料的迅速发展，量子点纳米材料(quantum dots，qds)有超强的荧光信号，抗光漂白能力强，激发光谱宽，发射光谱半峰宽较窄(尺寸依赖性)，表面功能化的量子点微球非常适合荧光标记。构建新型的量子点微球荧光免疫层析法，检测抗原抗体成为可能。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法，该方法制备得到的量子点荧光微球检测试纸条兼具高灵敏性和高特异性，能够快速、准确检测新鲜粪便样本中幽门螺旋杆菌抗原；且不需任何大型设备就能检测hp，可具有操作快速简便、结果准确、居家自测等优点。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条，包括底板，所述底板表面从加样端开始依次排列有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线t和质控线c，所述结合垫上包被有量子点荧光微球标记的抗幽门螺杆菌单克隆抗体～1，检测线t包被有抗幽门螺杆菌单克隆抗体～2，质控线c上包被有羊抗鼠igg多克隆抗体。

3、所述抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体～1和抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体～2可以是相同的单克隆抗体，也可以是不同的单克隆抗体。

4、进一步的，所述检测线t靠近结合垫一侧，质控线c靠近吸水垫一侧。

5、进一步的，所述试纸条用于检测样品中的幽门螺旋杆菌抗原。

6、优选的，所述样品为人新鲜粪便；大约30mg～60mg粪便样本放入样本稀释液中混匀。

7、优选的，所述底板为pvc底板。

8、为了实现上述目的，本发明还提供了上述量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

9、s1、用量子点荧光微球标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体～1溶液喷涂经预处理的结合垫，制得包含抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体～1的结合垫，即金标垫；

10、s2、在硝酸纤维素膜的检测线t和质控线c上分别用金标仪进行划线，包埋抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体～2及羊抗鼠igg多克隆抗体，制得包被后的硝酸纤维素膜；

11、s3、将预处理后的样品垫、步骤s1制备的金标垫、步骤s2制备的包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，切裁制得免疫层析试纸条。

12、进一步的，步骤s1中，所述结合垫采用缓冲液预处理，所述缓冲液选自pb缓冲液、tris～hcl缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10～50mm。

13、进一步的，所述预处理的具体步骤为：将结合垫在缓冲液中浸泡0.5～1h，取出放于37℃～56℃烘干。

14、进一步的，步骤s3中，所述样品垫采用缓冲液预处理，所述缓冲液选自pb缓冲液、tris～hcl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸～磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10～100mm。

15、所述预处理缓冲液的溶剂为纯水；所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的ph调节剂进行ph值的调节。

16、进一步的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液中还包括吐温20和nacl，所述吐温20在缓冲液中的浓度为0.1～5.0mg/ml,nacl在缓冲液中的浓度为0.1～10mg/ml。

17、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

18、本发明基于量子点荧光微球，构建以抗幽门螺杆菌单克隆抗体的双抗夹心法的幽门螺杆菌抗原检测试剂条，该量子点荧光微球检测试纸条兼具高灵敏性和高特异性，能够快速、准确检测新鲜粪便样本中幽门螺旋杆菌抗原；该检测方法不需要任何大型设备就能检测hp，具有操作快速简便、结果准确、便于床旁即时快速检验，没有放射性污染、适合孕妇儿童等不适宜进行呼气试验人群、方便预后疗效监测、标记物保存时间长等优点，另外，还有利于幽门螺杆菌居家自测，有助于早筛早诊hp，对粪便中幽门螺旋杆菌抗原检测具有重要的应用前景，对胃幽门螺旋杆菌导致的胃炎和胃癌的防治具有重大的临床意义。

技术特征：

1.一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条，包括底板(7)，所述底板(7)表面从加样端开始依次排列有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(3)，所述硝酸纤维素膜(6)上设有检测线t(4)和质控线c(5)，

2.根据权利要求1所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线t(4)靠近结合垫(2)一侧，质控线c(5)靠近吸水垫(3)一侧。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条用于检测样品中的幽门螺旋杆菌抗原。

4.根据权利要求3所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品为人新鲜粪便。

5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板(7)为pvc底板。

6.根据权利要求1～5任一权利要求所述的量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤s1中，结合垫(2)采用缓冲液预处理，所述缓冲液选自pb缓冲液、tris～hcl缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10～50mm。

8.根据权利要求7所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述预处理的具体步骤为：将结合垫(2)在缓冲液中浸泡0.5～1h，取出放于37℃～56℃烘干。

9.根据权利要求6所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤s3中，样品垫(1)采用缓冲液预处理，所述缓冲液选自pb缓冲液、tris～hcl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸～磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10～100mm。

10.根据权利要求7或9所述的一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌的量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述缓冲液中还包括吐温20和nacl，所述吐温20在缓冲液中的浓度为0.1～5.0mg/ml，nacl在缓冲液中的浓度为0.1～10mg/ml。

技术总结
一种用于检测粪便中幽门螺旋杆菌抗原的量子点荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条包括底板，所述底板表面从加样端开始依次排列有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被量子点荧光微球标记的幽门螺杆菌单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述检测线上包被有抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。本发明提供的试纸条适合单个标本测定，检测快速，灵敏度高，特异性强，准确度高，便于床旁即时快速检验，没有放射性污染、适合孕妇儿童等不适宜进行呼气试验人群、方便预后疗效监测、标记物保存时间长等优点，对粪便中幽门螺旋杆菌抗原检测具有重要的应用前景。

技术研发人员：李世宝,李全双,郝良文,黄庆利,刘庭君,谢以伟
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/11/11