一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被IL-6抗体的方法与流程

本发明属于磁珠标记抗体，更具体地说，特别涉及一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法。

背景技术：

1、磁珠标记抗体技术，就是将抗体与磁珠偶联，从而让包被的抗体更好地去结合抗原。抗体本质是蛋白质，有很多官能团，比如氨基-nh2、巯基、羟基、羧基等，正是利用蛋白质的空间结构使得磁珠与抗体更好地结合，那么根据官能团的不同，磁珠类型自然非常的多样，羧基磁珠、甲丙酰胺基磁珠、链霉亲和素磁珠，其中常用的像酶促化学发光就用到的羧基磁珠比较多，而像罗氏电化学发光用的链霉亲和素磁珠更多。链霉亲和素磁珠通常是以三组分的形式，生物素标记抗体、磁珠、发光物标记抗体构成试剂盒，相比于其他类型反应更缓和。

2、羧基磁珠是生物磁珠的一种，磁珠一般具有超顺磁性、磁响应速度快、比表面积大、单分散性、胶体稳定性等特点。羧基磁珠表面修饰有丰富的羧基基团，能够在特殊化学试剂的作用下将蛋白质、核酸、多肽等偶联到磁珠表面，在蛋白纯化、免疫检测、分子检测、ngs、细胞分离等领域应用广泛。

3、在化学发光免疫分析中磁珠作为反应载体，其上包被特异性抗原或抗体，捕获待测物中的靶标分子。蛋白质可以通过吸附作用与羧基修饰颗粒结合，吸附是由蛋白质和颗粒表面之间的疏水和离子相互作用介导的，吸附作用发生非常迅速。除了被吸附外，蛋白质还可以共价连接到羧基修饰的颗粒表面。羧基可以被水溶性碳二亚胺激活，与被吸附蛋白质的自由氨基反应形成酰胺键。主要有疏水作用力和共价连接。在羧基磁珠包被过程中常用的缓冲体系是tris体系。

4、磁珠包被过程中可能会出现聚集现象。此时就要优化磁珠与抗体包被处理工艺流程。

5、目前市面上羧基磁珠应用较多的是化学发光体系，包被抗体过程中所说的磁珠聚集现象，其实都是肉眼所见的大团聚集，此时磁珠已经发生的较大的聚沉。但大部分的抗体在包被磁珠过程中基本会出现两个以上的磁珠结合的现象，此时肉眼一般无法看见。如果将包被抗体前后的磁珠在流式细胞仪上检测，就会发现明显的区别。

6、我们的单分子荧光免疫技术要求，将包被好的羧基磁珠分散成单个状态。常见的分散方法，是用涡旋振荡器充分振荡或者小的超声波清洗机处理。但经过实验发现，这两种方法效率很低，且只适用于小量的抗体包被羧基磁珠。

7、基于此，本发明旨在设计一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，提高磁珠的分散性，能满足单分子荧光免疫所需的试剂要求。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，以解决上述的问题。

2、一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，先将羧基磁珠活化，再将i l-6抗体与羧基磁珠偶联，得到il-6抗体偶联磁珠，使用封闭剂进行封闭，之后使用超声波细胞破碎仪进行处理，包括以下步骤：

3、s1：磁珠活化；

4、s2：羧基磁珠洗涤；

5、s3：偶联；

6、s4：封闭；

7、s5：磁珠分散；

8、s6：重悬保存。

9、优选的，将il-6抗体与羧基磁珠偶联得到il-6抗体偶联磁珠，其中预处理液包括十二烷基硫酸钠溶液。

10、优选的，羧基磁珠粒径为3μm。

11、优选的，羧基磁珠在与il-6抗体偶联前，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的混合液进行混合活化，其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为8～12mg/l，温度为22～28℃，时间为30min。

12、优选的，将经过活化的羧基磁珠在mest缓冲液中洗涤2～3次，其中mest缓冲液的浓度为50mm，ph为5.0，之后将il-6抗体和经过洗涤的羧基磁珠进行混合偶联，温度为22～28℃，混合偶联时间为1～5h。

13、优选的，将经过偶联的磁珠放入含有0.1％甘氨酸和0.1％bsa的mes缓冲液中封闭处理，其中密封时间为5～8h，密封温度为22～28℃。

14、优选的，经过封闭后的羧基磁珠置于超声细胞破碎仪中超声2min，保持低温冰浴状态，工作系数为工作1s，间歇2s。经过超声处理的羧基磁珠用tris缓冲液进行洗涤2～3次，后用tris缓冲液中，并于2～8℃下重悬保存，即可制得il-6抗体偶联磁珠。

15、优选的，il-6抗体包被羧基磁珠的抗体和磁珠的质量比为1：50～1：200。

16、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

17、本发明中，能够有效活化羧基磁珠并实现il-6抗体与磁珠的高效偶联，提高了包被效率和准确性。

18、本发明中，通过特定的预处理液、反应条件和活化方式，保证了磁珠包被的稳定性和可靠性，有利于后续检测的重复性和一致性。

19、本发明中，采用特定粒径的羧基磁珠，优化了反应过程，进一步提升了包被效果。

20、本发明中，利用超声细胞破碎仪进行处理，有助于提高磁珠的分散性和均匀性，从而提升检测的灵敏度和特异性。

21、本发明中，该方法工艺简单、易于操作，且能够获得性能优良的il-6抗体偶联磁珠，为单分子荧光免疫检测提供了有力支持，在疾病诊断、医学研究等领域具有广泛的应用前景和重要的实际意义。

技术特征：

1.一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，先将羧基磁珠活化，再将il-6抗体与羧基磁珠偶联，得到il-6抗体偶联磁珠，使用封闭剂进行封闭，之后使用超声波细胞破碎仪进行处理，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，将il-6抗体与羧基磁珠偶联得到il-6抗体偶联磁珠，其中预处理液包括十二烷基硫酸钠溶液。

3.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，羧基磁珠粒径为3μm。

4.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，羧基磁珠在与il-6抗体偶联前，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的混合液进行混合活化，其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为8～12mg/l，温度为22～28℃，时间为30min。

5.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，将经过活化的羧基磁珠在mest缓冲液中洗涤2～3次，其中mest缓冲液的浓度为50mm，ph为5.0，之后将il-6抗体和经过洗涤的羧基磁珠进行混合偶联，温度为22～28℃，混合偶联时间为1～5h。

6.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，将经过偶联的磁珠放入含有0.1％甘氨酸和0.1％bsa的mes缓冲液中封闭处理，其中密封时间为5～8h，密封温度为22～28℃。

7.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，经过封闭后的羧基磁珠置于超声细胞破碎仪中超声2min，保持低温冰浴状态，工作系数为工作1s，间歇2s。经过超声处理的羧基磁珠用tris缓冲液进行洗涤2～3次，后用tris缓冲液中，并于2～8℃下重悬保存，即可制得il-6抗体偶联磁珠。

8.如权利要求1所述一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被il-6抗体的方法，其特征在于，il-6抗体包被羧基磁珠的抗体和磁珠的质量比为1：50～1：200。

技术总结
本发明提供一种适用于单分子荧光免疫用磁珠包被I L‑6抗体的方法，涉及磁珠标记抗体技术领域，能够有效活化羧基磁珠并实现I L‑6抗体与磁珠的高效偶联，提高了包被效率和准确性，通过特定的预处理液、反应条件和活化方式，保证了磁珠包被的稳定性和可靠性，有利于后续检测的重复性和一致性，采用特定粒径的羧基磁珠，优化了反应过程，进一步提升了包被效果，利用超声细胞破碎仪进行处理，有助于提高磁珠的分散性和均匀性，从而提升检测的灵敏度和特异性，该方法工艺简单、易于操作，且能够获得性能优良的I L‑6抗体偶联磁珠，为单分子荧光免疫检测提供了有力支持，在疾病诊断、医学研究等领域具有广泛的应用前景和重要的实际意义。

技术研发人员：颜菁,毛玉梅,李凤娟
受保护的技术使用者：上海邦先医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/10