一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的方法

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的方法。

背景技术：

1、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)是近年来发展的一种新型的软电离技术，可通过检测未知微生物或生物大分子的特征性生物标志物，实现对未知微生物的快速检测、鉴定、分型、溯源以及有毒株和无毒株的区别等。其基本原理为：将微生物样品与基质溶液以一定比例混合或分别点加在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射共结晶体。基质从激光中吸收能量使样品解吸，经过飞行时间检测器，基质与样品之间发生电荷转移使不同质荷比(m/z)的离子分开，以离子质荷比(m/z)为横坐标，离子峰强度为纵坐标，形成含有标志物相对分子质量信息的质谱图，将质量图谱与已知质谱图数据库中的特征性质谱图比对，得到正确的鉴定结果。

2、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)是一种重要的条件致病菌，具有多种抗生素耐药机制，可在易感个体中引起广泛的人类感染，特别是在免疫系统较弱的患者中，如癌症、囊性纤维化、烧伤、结核病和艾滋病。典型的治疗剂包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类。近年来，从医疗保健相关感染中分离出的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物具有耐药性，对人们的健康造成了巨大威胁。

3、值得注意的是，一些来自肿瘤患者的临床分离株表现出独特的铜绿假单胞菌表型耐药模式：对碳青霉烯类耐药，但对头孢菌素(carb-r/ceph-s)敏感。目前，该类car-r/ceph-s铜绿假单胞菌最常见的耐药机制是：1)细菌外膜通透性下降，如控制oprd孔蛋白的基因突变，使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素，尤其是亚胺培南具有高水平耐药性。2)主动外排泵系统过表达，主要包括以下4个外排泵参与其耐药机制,即mexab-oprm、mexcd-oprj、mexef-oprn及mexxy-oprm。mexab-oprm是导致铜绿假单胞菌发生抗生素耐药的主要外排泵，负责将β-内酰胺类和喹诺酮类药物外排出细胞；mexcd-oprj和mexef-oprn可分别将喹诺酮类药物和β-内酰胺抗生素泵出细胞；mexxy-oprm则可将氨基糖苷类抗生素排出细胞质。有研究显示，临床上某些铜绿假单胞菌菌株可同时表达多个外排泵，导致细菌对多类抗生素耐药。因此，检测主要外排泵系统的基因mexa，mexc，mexe和mexx，能反应铜绿假单胞菌是否存在主动外排泵系统过表达。检测外膜蛋白oprd基因和外排系统基因(mexa、mexc、mexe、mexx)表达的方法有很多种，包括反转录定量pcr以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等。然而，现在并没有研究证明carb-r/ceph-s铜绿假单胞菌的耐药基因表型与maldi-tof-ms质谱峰变化之间存在相关性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种检铜绿假单胞菌耐药基因分型的方法。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、第一个方面，本发明提供一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的方法，包括以下步骤：

4、1)将待测菌体样本加至点样靶，覆盖饱和α-氰基-羟基肉桂酸，干燥后作为备检样品；

5、2)选用线性正离子模式进行maldi-tof ms质谱检测得到图谱，对比铜绿假单胞菌标准菌株的图谱；

6、3)结果判定如下：3602～3617m/z、9090±1.0m/z出现峰变形为mexx基因过表达分型；8877～8938m/z出现峰变形、11437±1.0m/z出现新峰为mexa过表达分型；7204～7235m/z出现峰变形为mexs类基因过表达和opr-d基因下调分型。

7、在一些实例中，所述mexs类基因为mexa、mexc、mexe、mexx基因。

8、在一些实例中，所述铜绿假单胞菌选自对碳青霉烯类耐药，但对头孢菌素类敏感的铜绿假单胞菌。

9、在一些实例中，所述maldi-tof-ms的检测质量范围为2000-20000m/z。

10、在一些实例中，所述备检样本的制备方法为：将待测菌体复苏后转入哥伦比亚血琼脂平板，35℃co2温箱孵育过夜，然后加至点样靶上。

11、第二个方面，本发明提供一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的系统，通过第一个方面所述的方法对铜绿假单胞菌耐药基因进行基因分型。

12、本发明的有益效果是：

13、本发明利用malditof ms分析carb-r/ceph-s铜绿假单胞菌的峰变化可以快速鉴定常见耐药基因，有望成为未来短时间、高灵敏度、高特异性的鉴定方法。

技术特征：

1.一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mexs类基因为mexa、mexc、mexe、mexx基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌选自对碳青霉烯类耐药，但对头孢菌素类敏感的铜绿假单胞菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述maldi-tof-ms的检测质量范围为2000-20000m/z。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述备检样本的制备方法为：将待测菌体复苏后转入哥伦比亚血琼脂平板，35±1.0℃co2温箱孵育过夜，然后加至点样靶上。

6.一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的系统，其特征在于，通过权利要求1所述的方法对铜绿假单胞菌耐药基因进行基因分型。

技术总结
本发明公开了一种检测铜绿假单胞菌耐药基因分型的方法，包括以下步骤：将备检样品选用线性正离子模式进行MALDI‑TOF MS质谱检测得到图谱，对比铜绿假单胞菌标准菌株的图谱，其中，3602～3617m/z、9090±1.0m/z出现峰变形为mexX基因过表达分型；8877～8938m/z出现峰变形、11437±1.0m/z出现新峰为mexA过表达分型；7204～7235m/z出现峰变形为MEXs类基因过表达和Opr‑D基因下调分型。本发明利用MALDITOF MS分析Carb‑R/Ceph‑S铜绿假单胞菌的峰变化可以快速鉴定常见耐药基因，有望成为未来短时间、高灵敏度、高特异性的鉴定方法。

技术研发人员：李小辉,郑炘
受保护的技术使用者：中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
技术研发日：
技术公布日：2025/1/6