一种快速鉴定柱型苹果的切片分析方法

本发明涉及苹果育种，特别是涉及一种快速鉴定柱型苹果的切片分析方法。

背景技术：

1、树型结构是影响整形修剪，果园管理，果品产量的重要农艺性状，矮化密植栽培是中国苹果现代化生产的发展趋势，推广适于轻简化和机械化管理的树型将满足未来苹果产业发展需求。柱型苹果(colmnar apple)来源于普通型苹果的一个突变体，具有树体紧凑，节间短，腋芽萌发形成大量短枝，且光合效率高的特点，这种树型无需拉枝，修剪量极轻，适于机械化规范管理，是苹果轻简化栽培品种选育的重要种质资源(tobutt，1985；zhang&dai，2011；petersen&krost，2013；刘伟等，2016；梁美霞等，2017)。柱型苹果品种的推广应用将会极大节约劳动力等生产成本，助力苹果省力化栽培。所以，如何准确地鉴别、筛选柱型苹果品种，是目前研究的重点。

2、苹果柱型性状是由显性单基因co控制的质量性状(赵玉军等，1998；高华等，2004；tobutt，1994)。mdcol是调控苹果柱型性状形成的关键候选基因(wolters et al.，2013；okada et al.，2016；petersen et al.，2015；okada et al.，2020)。目前已有根据苹果co基因开发的鉴定柱型苹果的分子标记，但是分子标记鉴定法所需仪器和试剂较繁琐，耗时较长，且操作者需具有一定分子生物学基础，不适用于田间快速地鉴别柱型苹果材料。因此，亟需基于柱型苹果的形态特点，开发一种快速鉴别柱型苹果材料的简易方法，助力柱型苹果材料的选育与推广种植。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速鉴定柱型苹果的切片分析方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的切片分析方法通过计算苹果茎部组织的木质部维管细胞距表皮距离和横切半径的比值，可以快速高效，低成本且准确地鉴定柱型苹果。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供了一种鉴定柱型苹果的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、于待测苹果的茎部组织取样，切片，得组织薄片；

5、将所述组织薄片染色，得染色切片；

6、观察所述染色切片，确定组织中心，测量木质部维管细胞距表皮的距离，记为l，测量横切半径，记为r，计算l和r的比值；

7、在同一所述染色切片上，测量不同位置的木质部维管细胞的l和r，计算所述l和r的比值的平均值，记为l/r，鉴定所述待测苹果是否为柱型苹果。

8、优选的是，若所述苹果染色切片的l/r大于0.40，则鉴定所述待测苹果为柱型苹果；

9、若所述苹果染色切片的l/r不大于0.40，则鉴定所述待测苹果为非柱型苹果。

10、优选的是，所述取样包括：从上往下数，以所述待测苹果正常生长的枝条第一片长度大于0.5cm的叶片记为第1片叶，取位于第5和第6片叶中间的茎部组织。

11、优选的是，所述切片为横切，选择厚度为1mm的薄片，即得所述组织薄片。

12、优选的是，所述染色为间苯三酚染色，包括：

13、于所述组织薄片上滴加间苯三酚溶液至完全覆盖所述组织薄片，染色2min，吸干所述组织薄片上的液体，于所述组织薄片中心滴加一滴浓盐酸，反应1min。

14、优选的是，每10ml所述间苯三酚溶液包括0.1g间苯三酚、8ml 95％无水乙醇和2ml浓盐酸。

15、优选的是，所述确定组织中心包括：通过所述染色切片的两条直径，确定所述染色切片的组织中心。

16、优选的是，所述测量木质部维管细胞距表皮的距离包括：选取染色明显的木质部维管细胞，使用线段将所述木质部维管细胞与所述组织中心连接，并延长至表皮，测量线段自所述木质部维管细胞到所述表皮的部分的长度。

17、优选的是，所述测量横切半径包括：选取染色明显的木质部维管细胞，使用线段将所述木质部维管细胞与所述组织中心连接，并延长至表皮，测量线段自所述组织中心到所述表皮的部分的长度。

18、优选的是，所述不同位置为3-4处。

19、本发明公开了以下技术效果：

20、本发明提供了利用柱型苹果茎部结构特征，通过徒手切片配合间苯三酚染色，分析木质部维管细胞位置和进而快速鉴定柱型苹果的新方法。本发明首次提出利用苹果茎部组织切片的木质部维管细胞距表皮的距离l与横切半径r的比值(l/r)的大小鉴定柱型苹果，并以取自20份苹果种质的89份材料为试材实验上述切片染色分析l/r的方法，并通过分子标记鉴定法验证了该方法的准确性。实验结果表明，本发明提供的切片染色分析l/r方法的鉴定准确度为98.17％，为田间快速鉴别柱型苹果材料和柱型苹果选育、推广提供了可行、有效的工具，鉴定方法成本低，快速高效，且错误率低，将大大提高生产效率。

技术特征：

1.一种鉴定柱型苹果的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，若所述苹果染色切片的l/r大于0.40，则鉴定所述待测苹果为柱型苹果；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述取样包括：从上往下数，以所述待测苹果正常生长的枝条第一片长度大于0.5cm的叶片记为第1片叶，取位于第5和第6片叶中间的茎部组织。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切片为横切，选择厚度为1mm的薄片，即得所述组织薄片。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色为间苯三酚染色，包括：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，每10ml所述间苯三酚溶液包括0.1g间苯三酚、8ml 95％无水乙醇和2ml浓盐酸。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定组织中心包括：通过所述染色切片的两条直径，确定所述染色切片的组织中心。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测量木质部维管细胞距表皮的距离包括：选取染色明显的木质部维管细胞，使用线段将所述木质部维管细胞与所述组织中心连接，并延长至表皮，测量线段自所述木质部维管细胞到所述表皮的部分的长度。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测量横切半径包括：选取染色明显的木质部维管细胞，使用线段将所述木质部维管细胞与所述组织中心连接，并延长至表皮，测量线段自所述组织中心到所述表皮的部分的长度。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同位置为3-4处。

技术总结
本发明公开了一种快速鉴定柱型苹果的切片分析方法，属于苹果育种技术领域。本发明首次提出利用苹果茎部组织间苯三酚染色切片的木质部维管细胞距表皮的距离L与横切半径R的比值(L/R)的大小，快速鉴定柱型苹果，并以取自20份苹果种质的89份材料为试材实验上述切片染色分析L/R的方法，并通过分子标记鉴定法验证了该方法的准确性。实验结果表明，本发明提供的切片染色分析L/R方法的鉴定准确度为98.17％，为田间快速鉴别柱型苹果材料和柱型苹果选育、推广提供了可行、有效的工具，鉴定方法成本低，快速高效，且错误率低，将大大提高生产效率。

技术研发人员：张玉刚,韩婷婷,李志,华俊凯,刘培培,吴海英,郭绍霞,姜生辉,侯鸿敏,徐晓召,贾东杰,屈海泳
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2025/2/27