一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法与流程

本发明涉及一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法。

背景技术：

1、重组人促红素(epo)是治疗肾性贫血的有效药物，聚乙二醇化重组人促红素(peg-epo)是利用聚乙二醇修饰epo后开发的一种长效促红素，在血液循环中的半衰期明显延长，大大降低了注射频次，明显改善了药物在临床中的局限性。

2、纯度作为蛋白类药物的关键质量属性(cqa)，与产品的安全性和有效性密切相关，在各国家和地区的药典中，均要求在药物工艺开发的整个生命周期中进行持续的产品纯度检测和控制。中国药典对epo和peg化重组蛋白制品建议采用体积排阻色谱(sec-hplc)、反相色谱(rp-hplc)和sds-page方法对纯度进行检测。但传统的sds-page平板电泳技术在检测大小变异体时仅能达到半定量要求，准确度欠佳。

3、毛细管电泳技术因其分离性能、准确度、精密度、线性与范围、耐用性等各指标均优于sds-page，被广泛应用在生物制品的纯度检测中。但epo的微观不均一性非常高，且peg-epo由于peg链的修饰，进一步增加了其结构复杂性，导致peg-epo和未偶联的epo虽然分子量有明显差别(60kd vs 30kd)，但却无法通过毛细管电泳实现有效分离。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明的目的是提供一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，包括以下步骤：

4、(1)使用pngase f酶将待测聚乙二醇化重组人促红素进行脱n糖处理，得到脱n糖后的peg-epo；

5、(2)加入sds对脱n糖后的peg-epo进行孵育变性；

6、(3)进行毛细管凝胶电泳，并根据不同组分的峰面积比计算待测样品的纯度。

7、作为优选方案，在步骤(1)前，还包括将待测聚乙二醇化重组人促红素进行预处理，得到预处理后的peg-epo；所述预处理是将待测聚乙二醇化重组人促红素浓缩并换液至酶切缓冲液中。

8、作为优选方案，所述浓缩为使用超滤膜进行浓缩；和/或

9、所述酶切缓冲液为ph7.5±0.1的40mm pb。

10、作为优选方案，步骤(1)中，所述脱n糖处理是将pngase f酶与待测聚乙二醇化重组人促红素混匀并离心，取上清液37±1℃孵育≥16h。

11、作为优选方案，步骤(2)中，将脱n糖后的peg-epo与样品预混溶液混合后，进行孵育变性；

12、所述样品预混溶液由以下体积份数的各组分组成：2x sample buffer 9份；250mmnem 1份；

13、所述2x sample buffer的配方为：12.56mm磷酸氢二钠，27.44mm磷酸二氢钠，2％sds，ph6.5-9.0。

14、作为优选方案，所述ph值为6.5。

15、作为优选方案，将脱n糖后的peg-epo与样品预混溶液混合后，脱n糖后的peg-epo的终浓度为1.0mg/ml。

16、作为优选方案，步骤(2)中，所述孵育变性的条件为：70-90℃，孵育5-10min。

17、作为优选方案，所述孵育变性的条件为：70℃，孵育10min。

18、作为优选方案，步骤(3)中，所述毛细管凝胶电泳的采集方法为：进样：4600v，20s；分离：5750v，30min。

19、由于epo含有多个糖基化位点(3个n糖基化位点，1个o糖基化位点，已鉴定出的糖型多达一百多种)，导致了微观不均一性非常高，进一步导致无法通过毛细管电泳实现有效分离。故本发明使用脱n糖酶降低peg-epo分子的高度微观不均一性后，加入sds进行过热变性处理破坏二三级结构，然后利用毛细管电泳技术样品按照分子大小进行分离检测，解决了传统sds-page方法定量准确度欠佳，毛细管电泳技术测定该类药物纯度时，峰数目多、峰型变形，主成分和杂质无法有效分离，进而无法定量的问题，保证了纯度测定的准确性和可靠性。本发明的方法具有专属性更高、可更精准定量、适于推广应用的特点。

技术特征：

1.一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：在步骤(1)前，还包括将待测聚乙二醇化重组人促红素进行预处理，得到预处理后的peg-epo；所述预处理是将待测聚乙二醇化重组人促红素浓缩并换液至酶切缓冲液中。

3.根据权利要求2所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：所述浓缩为使用超滤膜进行浓缩；和/或

4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述脱n糖处理是将pngase f酶与待测聚乙二醇化重组人促红素混匀并离心，取上清液37±1℃孵育≥16h。

5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：步骤(2)中，将脱n糖后的peg-epo与样品预混溶液混合后，进行孵育变性；

6.根据权利要求5所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：所述ph值为6.5。

7.根据权利要求5所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：将脱n糖后的peg-epo与样品预混溶液混合后，脱n糖后的peg-epo的终浓度为1.0mg/ml。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述孵育变性的条件为：70-90℃，孵育5-10min。

9.根据权利要求8所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：所述孵育变性的条件为：70℃，孵育10min。

10.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化重组人促红素的纯度检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述毛细管凝胶电泳的采集方法为：进样：4600v，20s；分离：5750v，30min。

技术总结
本发明提供一种聚乙二醇化重组人促红素的毛细管电泳纯度检测方法，包括以下步骤：(1)使用PNGase F酶将待测聚乙二醇化重组人促红素进行脱N糖处理，得到脱N糖后的PEG‑EPO；(2)加入SDS对脱N糖后的PEG‑EPO进行孵育变性；(3)进行毛细管凝胶电泳，并根据不同组分的峰面积比计算待测样品的纯度。本发明解决了传统SDS‑PAGE方法定量准确度欠佳，毛细管电泳技术测定该类药物纯度时，峰数目多、峰型变形，主成分和杂质无法有效分离，进而无法定量的问题，保证了纯度测定的准确性和可靠性。本发明的方法具有专属性更高、可更精准定量、适于推广应用的特点。

技术研发人员：周祥山,朱莉,刘海峰,刘铭松,盛乐,杨依林,贺新新
受保护的技术使用者：华润昂德生物药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/3/10