一种通过改变微球活化后添加原料时间来控制批间差和提高特异性的方法与流程

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种通过改变微球活化后添加原料时间来控制批间差和提高特异性的方法。

背景技术：

1、在生物医学研究和临床诊断中，羧基修饰微球作为医学与分子生物学研究中重要的载体工具，其表面的羧基功能团能够在特殊化学试剂的作用下将多肽、蛋白、抗体、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面，从而可以快速地将目标物从样品中分类和富集，可应用于化学发光技术、流式荧光技术、层析技术等领域。

2、目前，羧基修饰微球的活化主要依赖于edc（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和nhs（n-羟基琥珀酰亚胺）等偶联剂，它们能有效地将微球表面的羧基基团转化为高反应活性的中间体，从而与生物分子上的氨基等基团发生偶联反应。但是现有羧基修饰微球标记过程中，通常在活化反应结束后立即加入生物分子进行偶联，但由于活化反应受多种因素的影响，不同批次活化后的微球反应活性可能存在较大差异，导致后续标记过程中生物分子的偶联效率不一致，进而产生批间差异；且活化后的中间体如果不稳定，容易与体系中的非特异性生物分子发生反应，形成非特异性结合，导致假阳性现象的发生。

3、为了提高免疫分析的准确性和重复性，本领域技术人员一直在探索新的方法来控制磁性微球的活化和偶联过程，如优化缓冲体系、使用更纯化的原料和改进偶联技术等，但这些方法往往无法根本解决批间差和假阳性的问题。可见，现有的磁性微球活化和偶联技术在批间一致性和特异性结合方面仍存在挑战。因此，有必要提供一种能够解决羧基修饰微球标记过程中存在批间差异大和假阳性高问题的方法，提高标记的特异性和准确性，减少非特异性结合的发生，为生物医学研究和临床诊断提供更加可靠和稳定的工具。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种通过改变微球活化后添加原料时间来控制批间差和提高特异性的方法，解决微球活化和偶联过程中存在批间差异大和假阳性高的技术问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种通过改变微球活化后添加原料时间来控制批间差和提高特异性的方法，在微球活化完成一定时间后添加生物活性物质进行偶联。

4、优选的，所述微球包括羧基修饰微球。

5、优选的，在微球活化完成18~30 min后添加生物活性物质进行偶联。

6、优选的，所述活化时使用的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。

7、优选的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的纯度≥98%；所述n-羟基琥珀酰亚胺的纯度≥98%。

8、优选的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2~3：4~6。

9、优选的，所述微球活化的方法为：将微球溶液与活化剂混合，在ph为5.5~6.5、温度为20~30℃、速率为500~1500rrpm条件下活化10~60 min。

10、优选的，所述微球溶液的浓度为0.4~0.6mg/ml；与活化剂混合后的溶液中所述活化剂的浓度为2~5mg/ml。

11、优选的，所述生物活性物质包括抗体、抗原、寡聚核苷酸、细胞因子、多肽、蛋白质复合物和生物标志物中的一种。

12、优选的，所述偶联时的温度为20~30℃，速率为15~20rpm，时间为1.5~4h。

13、发明人发现：活化剂与微球表面羧基的反应动力学和稳定性对偶联效果有重要影响，活化后中间体的稳定性以及其与生物分子的偶联反应速率是影响标记效果的关键因素。基于上述发现，发明人通过调整生物活性物质的加入时间，有效减少了批间差和假阳性结果，提高了免疫分析的特异性和批间一致性。

14、本发明在微球活化反应完成后并不立即加入生物活性物质进行偶联，而是设置一个适当的延迟时间，在这段时间内，允许不稳定的中间体水解或与其他分子反应，减少其与偶联对象非特异性结合的机会，改善微球表面的反应环境，减少非特异性吸附，同时，活化后的中间体的稳定性增强，可以保证活化后的中间体在最佳状态下参与反应，避免了过早或过晚加入导致的副反应和杂质生成，从而保证了产品的高纯度和高收率。当延迟时间结束后，再加入生物分子进行偶联反应，此时中间体的反应活性更加稳定，与生物分子的偶联反应也更加可控，从而有利于减少批间差异和非特异性结合导致的假阳性现象的发生。

15、本发明无需引入额外的试剂或步骤，仅通过优化偶联对象加入时间即可实现批间差的减少和假阳性的减少，操作简单、易于控制，有利于减少非特异性结合导致的假阳性结果，使生物偶联反应更加敏感和可靠，进而能够提高检测灵敏度、特异性和准确性，对于需要大批量生产且对产品质量要求高的领域来说，具有极高的实用价值。本发明方法能够为生物医学研究和临床诊断提供更加可靠和稳定的工具，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种通过改变微球活化后添加原料时间来控制批间差和提高特异性的方法，其特征在于，在微球活化完成一定时间后添加生物活性物质进行偶联。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微球包括羧基修饰微球。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在微球活化完成18~30 min后添加生物活性物质进行偶联。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活化时使用的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的纯度≥98%；所述n-羟基琥珀酰亚胺的纯度≥98%。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2~3：4~6。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微球活化的方法为：将微球溶液与活化剂混合，在ph为5.5~6.5、温度为20~30℃、速率为500~1500rpm条件下活化10~60 min。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微球溶液的浓度为0.4~0.6mg/ml；与活化剂混合后的溶液中所述活化剂的浓度为2~5mg/ml。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物活性物质包括抗体、抗原、寡聚核苷酸、细胞因子、多肽、蛋白质复合物和生物标志物中的一种。

10.如权利要求1~9任一项所述的方法，其特征在于，所述偶联时的温度为20~30℃，速率为15~20rpm，时间为1.5~4 h。

技术总结
本发明提供了一种通过改变微球活化后添加原料时间来控制批间差和提高特异性的方法，属于生物医学技术领域。本发明在微球活化完成一定时间后添加生物活性物质进行偶联。本发明无需引入额外的试剂或步骤，仅通过优化偶联对象加入时间即可实现批间差的减少和假阳性的减少，操作简单、易于控制，有利于减少非特异性结合导致的假阳性结果，使生物偶联反应更加敏感和可靠，进而能够提高检测灵敏度、特异性和准确性，对于需要大批量生产且对产品质量要求高的领域来说，具有极高的实用价值。本发明方法能够为生物医学研究和临床诊断提供更加可靠和稳定的工具，具有良好的应用前景。

技术研发人员：吴善东,刘奕,吴周杰,黄颖雯,尹德领,陈姗姗,吴善红,王溢飞,王美杰,姜雨琦,范红玉,伏宏亮
受保护的技术使用者：杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/1/13