一种美罗培南杂质N-亚硝基美罗培南的检测方法与流程

本发明属于药物分析化学领域，具体涉及一种美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法。

背景技术：

1、美罗培南为人工合成的广谱碳青霉烯类抗生素，通过抑制细菌细胞壁的合成而产生抗菌作用，美罗培南容易穿透大多数革兰阳性和阴性细菌的细胞壁，达到其作用靶点青霉素结合蛋白(pbps)。

2、n-亚硝基美罗培南产生于美罗培南的合成步骤，主要过程如下：保护美罗培南通过催化加氢脱掉保护基生成美罗培南。当保护美罗培南吡咯烷环上的氨基的保护基脱除之后，生成仲氨结构，该仲氨结构遇到亚硝化试剂（美罗培南制备过程所使用的物料中会引入亚硝化试剂），容易生成亚硝胺，即n-亚硝基美罗培南。

3、

4、亚硝胺是强致癌物，是最重要的化学致癌物之一，是四大食品污染物之一。食物、化妆品、啤酒、香烟中都含有亚硝胺。在熏腊食品中，含有大量的亚硝胺类物质，某些消化系统肿瘤，如食管癌的发病率与膳食中摄入的亚硝胺数量相关。当熏腊食品与酒共同摄入时，亚硝胺对人体健康的危害就会成倍增加。

5、n-亚硝基美罗培南作为亚硝胺杂质的一种，同样具有强致癌性。美罗培南作为广谱碳青霉烯类抗生素，n-亚硝基美罗培南的残留控制要求非常严格。因此需要开发专属性强的方法，以对该杂质进行精确检测。

6、从fda（美国食品药品监督管理局）提出ndsri（药物成分相关杂质的亚硝胺）以来，市场上关于ndsri的研究随之火热起来，然而ndsri的特点是限度低。n-亚硝基美罗培南杂质结构与美罗培南类似，仅相差一个亚硝基，导致分离极为困难，回收率偏低。目前，现有技术中没有检测该杂质的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法。本发明方法能够有效分离n-亚硝基美罗培南杂质与美罗培南，有效检测美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南，方法专属性和适用性强，检测灵敏度高，线性关系良好，精密度和准确度高。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，采用lc-ms法，色谱条件为：

4、色谱柱：waters atlantis hilic silica 液相色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相a：体积浓度0.04%～0.06%氨水，流动相b：体积浓度0.05%～0.2%甲酸乙腈；

5、梯度洗脱条件：在0分钟，流动相a的体积占比为15-25%，流动相b的体积占比为75-85%；在4分钟，流动相a的体积占比为15-25%，流动相b的体积占比为75-85%；在4.1分钟，流动相a的体积占比为50%，流动相b的体积占比为50%；在10分钟，流动相a的体积占比为50%，流动相b的体积占比为50%；在10.1分钟，流动相a的体积占比为15-25%，流动相b的体积占比为75-85%；在15分钟，流动相a的体积占比为15-25%，流动相b的体积占比为75-85%。

6、根据本发明优选的，流动相a：体积浓度0.05%氨水，流动相b：体积浓度0.1%甲酸乙腈。其中，甲酸乙腈中，甲酸作为溶质，乙腈作为溶剂，甲酸的体积浓度为0.1%。

7、根据本发明优选的，梯度洗脱条件：在0分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%；在4分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%；在4.1分钟，流动相a的体积占比为50%，流动相b的体积占比为50%；在10分钟，流动相a的体积占比为50%，流动相b的体积占比为50%；在10.1分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%；在15分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%。

8、根据本发明优选的，色谱条件还包括：进样量：2μl；柱温：40℃；流速：0.8ml/min；分析时间：15min；电离模式：负离子电喷雾（ajs esi-），多反应离子监测（mrm）模式；全扫模式；气帘气压力（cur）：45psi；碰撞气（cad）：medium；离子化电压（is）：4500v；离子源温度（tem）：550℃；喷雾气压力（gs1）：60psi；辅助加热气压力（gs2）：60psi。

9、根据本发明优选的，质谱检测参数：母离子：411m/z；子离子：198m/z；解簇电压（dp）：-30v；入口电压（ep）：-12v；解离能量（ce）：-16.4ev；出口电压（cxp）：-17.9v。

10、根据本发明优选的，采用乙腈和水作为溶剂配制供试品溶液，其中乙腈和水的体积比为4:1。

11、本发明的技术特点及有益效果如下：

12、1、杂质n-亚硝基美罗培南与美罗培南结构相似，仅相差一个亚硝基，分离度差，美罗培南极性大，保留时间弱；使用耐水性c18色谱柱，未能实现分离，且杂质峰形差，最终选择本发明hilic色谱柱达到分离效果。

13、2、为了得到更好的峰形和响应值，对流动相和洗脱梯度条件进行了优化。分别用甲酸水，氨水，为流动相a，甲酸乙腈，乙腈为流动相b；其中测试过程中，酸性条件下，影响n-亚硝基美罗培南的电离，使得n-亚硝基美罗培南的响应低，采用碱性的氨水时，n-亚硝基美罗培南的响应较高。最后研究发现当使用本发明特定浓度、特定种类的流动相a、流动相b时，n-亚硝基美罗培南响应值为最高。

14、3、本发明方法专属性和适用性强，检测灵敏度高，线性关系良好，精密度和准确度高。本发明方法能够有效分离n-亚硝基美罗培南杂质与美罗培南，有效检测美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南。

15、4、质谱条件的确定，优化正负模式发现，常用的正模式情况下，杂质峰响应极小，按限度配制杂质基本无响应，最终采取esi源负模式的情况下开发检测方法，满足检测要求；同时采用全扫的模式，最终优化质谱条件：dp电压-30v，ep电压-12v，ce电压-16.4ev，cxp电压：-17.9v。

技术特征：

1.一种美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，其特征在于，采用lc-ms法，色谱条件为：

2.根据权利要求1所述美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，其特征在于，流动相a：体积浓度0.05%氨水，流动相b：体积浓度0.1%甲酸乙腈。

3.根据权利要求1所述美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，其特征在于，梯度洗脱条件：在0分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%；在4分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%；在4.1分钟，流动相a的体积占比为50%，流动相b的体积占比为50%；在10分钟，流动相a的体积占比为50%，流动相b的体积占比为50%；在10.1分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%；在15分钟，流动相a的体积占比为20%，流动相b的体积占比为80%。

4.根据权利要求1所述美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，其特征在于，色谱条件还包括：进样量：2μl；柱温：40℃；流速：0.8ml/min；分析时间：15min；全扫模式；气帘气压力（cur）：45psi；碰撞气（cad）：medium；离子化电压（is）：4500v；离子源温度（tem）：550℃；喷雾气压力（gs1）：60psi；辅助加热气压力（gs2）：60psi。

5.根据权利要求1所述美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，其特征在于，质谱检测参数：母离子：411m/z；子离子：198m/z；解簇电压（dp）：-30v；入口电压（ep）：-12v；解离能量（ce）：-16.4ev；出口电压（cxp）：-17.9v。

6.根据权利要求1所述美罗培南杂质n-亚硝基美罗培南的检测方法，其特征在于，采用乙腈和水作为溶剂配制供试品溶液，其中乙腈和水的体积比为4:1。

技术总结
本发明提供一种美罗培南杂质N‑亚硝基美罗培南的检测方法，属于药物分析化学领域。本发明检测方法采用LC‑MS法，色谱条件为：色谱柱：Waters Atlantis HILIC Silica液相色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相A：体积浓度0.04%～0.06%氨水，流动相B：体积浓度0.05%～0.2%甲酸乙腈；梯度洗脱。本发明方法能够有效分离N‑亚硝基美罗培南杂质与美罗培南，有效检测美罗培南杂质N‑亚硝基美罗培南，方法专属性和适用性强，检测灵敏度高，线性关系良好，精密度和准确度高。

技术研发人员：石少志,汤沸,高梅雪,惠希强,张占明
受保护的技术使用者：山东安弘制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/1/20