一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸的方法

本发明涉及分析检测，具体涉及一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸的方法。

背景技术：

1、核酸在生物体的生命活动中具有极其关键的地位，对遗传、变异、蛋白质合成、基因表达调控等方面都有着至关重要的意义。然而当外源性核酸进入到生物体内，体内广泛存在核酸酶将会对其进行降解，因此难以发挥其生物学效应(k.paunovska,d.loughreyand j.e.dahlman,nat.rev.genet.,2022,23,265–280.)。除此之外，核酸分子亲水而疏油，并且表面带强烈的负电荷，这些特点使其难以跨过具有双层磷脂膜结构的细胞膜。

2、因此核酸需要载体对其进行保护，并将其输送至细胞中发挥作用。在早期基因治疗研究中，常用腺病毒、慢病毒、疱疹病毒等病毒作为载体，对核酸进行递送。这类载体虽然具有较高的转染效率，但存在潜在致癌性、载体容量有限、制备工艺复杂及成本昂贵等问题，限制了其临床应用。在此之后，纳米材料逐步成为核酸递送的主要研究载体。例如脂质纳米颗粒主要成分包括阳离子脂质、中性辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质，具有良好的生物相容性(l.juncheng,n.elena atochina-vasserman,s.devendra,j.am.chem.soc.2023,145,18760-18766)。在现阶段，树枝状分子、聚合物、铁蛋白等多种材料都已被实验证明在核酸递送方面具有高效、安全、靶向和多功能化等特点。虽然越来越多的核酸载体被不断发现与制备，但目前暂无明确方法可以检测被载体包裹的核酸。

技术实现思路

1、基于上述情况，本发明的目的在于提供一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸的方法，通过对比实验组目标峰与对照组目标的峰出峰位置、峰形、峰高和峰面积等变化，可用于鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸，分析载体与核酸的结合情况。此方法可以简单、快速和准确地检测出被载体包裹的核酸，并实现无损检测，回收后的实验样品可继续使用。在此基础上，对核酸与被载体包裹的核酸的出峰面积进行积分，通过二者峰面积之比可对核酸的包封率与释放率进行预测。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

4、(1)分别将待鉴别的游离核酸与载体包裹的核酸溶解于不含磷元素的溶剂中，得到待检测液，并对所述两种检测液进行核磁共振磷谱检测；

5、(2)通过对比步骤(1)得到的2种待鉴别物质的核磁磷谱图，可根据磷的峰高、峰面积、出峰位置，对二者进行鉴别，对载体与核酸的结合情况进行分析：在核磁磷谱图中，峰高更低、峰面积更小、出峰位置偏移更大的样品为被载体包裹的核酸。

6、所述(1)中，两种检测液进行核磁共振磷谱检测时，采样参数如下：采用zgig脉冲序列，测试温度为284k，脉冲宽度为9.9μs，d1为1s，谱宽为503.2ppm，射频中心频率为161.993176hz，lb＝100hz，采集点数为65536，采样累加次数为8192次，空扫次数为0次，增益为2050；

7、所述溶剂为水、无水乙醇或柠檬酸盐缓冲液。

8、更进一步的，所述溶剂为柠檬酸盐缓冲液的浓度为0.05m，ph＝3。

9、进一步的，所述核酸是dna、mrna、sirna或mirna；

10、进一步的，所述核磁共振磷谱检测时，采用的核磁共振仪的频率为400-600mhz，优选为400mhz。

11、一种基于上述方法对载体包裹的核酸中核酸的包封率进行预测的方法，得到游离核酸和载体包裹的核酸核磁磷谱图后，对各自的出峰面积进行积分，得到二者的峰面积比，用于预测核酸的包封率。也可对被载体包裹的核酸与载体释放后的核酸峰面积进行积分，得到二者的峰面积比，用于预测核酸的释放率。

12、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

13、通过本发明的方法可以做到对核酸与对载体结合的核酸进行无损检测，无需酶切、解离、沉淀等不可逆的方法进行处理，并且结果直观，无需对实验谱图进行复杂处理，也不需要对数据进行大量计算，可通过直接对比二者出峰情况分析样品中载体与核酸的结合情况。

技术特征：

1.一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与载体包裹的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸是dna、mrna、sirna或mirna。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核磁共振磷谱检测时，采用的核磁共振仪的频率为400-600mhz。

4.一种基于权利要求1-3任意一项所述方法对载体包裹的核酸中核酸的包封率进行预测的方法，基于权利要求1-3任意一项所述方法得到的游离核酸和载体包裹的核酸核磁磷谱图后，对各自的出峰面积进行积分，得到二者的峰面积比，用于预测核酸的包封率。

技术总结
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：（1）以游离核酸为对照，进行核磁共振磷谱检测，得到其核磁磷谱图；（2）以与载体结合的核酸作为实验组，进行相同条件下的核磁共振磷谱检测，获得实验组的磷谱图；（3）通过对比实验组与对照组的峰位、峰形、峰高和峰面积等特征变化，鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸。该方法具有良好的准确性、重复性、稳定性，能够进行无损检测，适合对敏感样品进行分析。可用于检测核酸类药物中载体与核酸的结合情况，预测核酸药物的包封率和释放率，为核酸药物的开放、生产和质量控制提供重要的分析工具。

技术研发人员：周欣,陈代钦,傅雨,蒋卫平,解铠铷
受保护的技术使用者：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
技术研发日：
技术公布日：2025/4/6