一种试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及到生物检测试剂，尤其涉及到一种试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纤溶酶抗纤溶酶复合物(plasmin antiplasmin complex, pic)是纤溶酶(plasmin，plm)与α2-纤溶酶抑制剂(α2-plasmin inhibition，α2-pi)以1:1结合形成的复合物，是直接反映纤溶系统激活程度的生物标志物。血栓一旦形成，立即激活纤溶系统，其浓度反应了纤溶酶的激活程度，提示纤溶活性亢进、出血风险增加，是直接反应纤溶酶生成的最有用的标志物。

2、纤溶酶原（plasminogen，plg）是纤溶酶（plasmin，plm）的前体酶原形式，纤溶酶是纤维蛋白（fibrin，fib）溶解必需的丝氨酸蛋白水解酶。α2-pi是一种单链糖蛋白，是纤溶系统的主要成分，plm的主要生理抑制剂。

3、在生理情况下，体内plg激活剂如组织型plg激活剂（tissue-plasminogenactivator，tpa）、尿激酶型plg激活剂（urokinase-plasminogen activator，upa）等将plg激为纤溶酶，迅速作用于fib使其降解称为纤溶过程，而体内的α2-pi则与游离的纤溶酶以1:1形成pic使其灭活。在激活纤溶酶原成纤溶酶和纤溶酶作用的过程中，纤溶酶抗纤溶酶复合物的形成与纤溶酶在纤维蛋白表面的结合和作用之间存在平衡。与纤维蛋白结合后，纤溶酶短时间内无法与α2-pi结合。然而，一旦纤维蛋白完全溶解，从纤维蛋白表面释放的纤溶酶立即与a2-pi结合。

4、纤溶酶与α2-pi的相互作用分为两阶段，第一阶段：α2-pi分子末端结构域赖氨酸残基与纤溶酶分子(plm)kringle1互补赖氨酸结合位点相互作用，形成非共价酶抑制剂复合物pm*α2-pi。

5、第一阶段是一个可逆的二级反应，反应在数秒完成，反应速率为3.8×107m-1·s-1。第二阶段：α2-pi分子活性中心处的arg364–met365(p1-p1’)键断裂，然后断裂的arg364残基与纤溶酶活性位点的ser741残基之间形成共价键。此阶段是较慢不可逆的一级反应，反应速率约4.0×10-3m-1·s-1。由以上两个阶段形成了一个极其稳定的共价复合物pm-α2-pi（pic）。pic分子量约为150kd。纤溶酶半衰期只有数秒，pic指标更容易被检测到，并且血浆浓度不受抗血小板和抗凝药物的影响。

6、目前市售的试剂盒多依赖进口。著名体外诊断（in vitro diagnostic，ivd）制造商日本希森美康（sysmex）率先建立化学发光法定量测定 pic。其包被抗体为抗纤溶酶原单克隆抗体，标记抗体为抗α2纤溶酶抑制剂抗体，希森美康pic试剂盒测试线性范围为0.05-40ug/ml。试剂盒在不稀释的情况下，当分析物的浓度达到一定值时，无法形成双抗体夹心复合物，即高剂量钩状效应，导致测值不准。希森美康pic试剂盒检测时需要先将样本稀释40倍后进行测试。测试步骤繁琐，增加了稀释样本的时间。

7、目前在样本不稀释的测试情况下，可以在第一步反应时通过增加大量的包被裸抗体/抗体包被的磁微粒去抓捕多余的pic抗原，但由此带来的试剂盒成本会比较高。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的一种或多种问题，本发明提供了一种试剂盒。本发明为解决上述问题采用的技术方案是：所述试剂盒用于检测纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物的含量，所述试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括：纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物抗体包被的磁微粒和磁微粒缓冲液，所述第二试剂包括：标记物标记的纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物抗体和吖啶稀释液。

2、在一些实施例中，所述磁微粒缓冲液和所述吖啶稀释液中包含有缓冲体系、稳定剂和防腐剂。

3、在一些实施例中，所述磁微粒缓冲液含有纤溶酶抑制剂。

4、进一步地，所述纤溶酶抑制剂为赖氨酸或赖氨酸类似物，其中，所述赖氨酸类似物包括：6-氨基己酸、氨甲环酸、氨甲苯酸。

5、在一些实施例中，所述纤溶酶抑制剂的浓度为1-50mm，其中，优选是所述纤溶酶抑制剂的浓度为10mm。

6、以及上述试剂盒的制备方法，纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物抗体简称为抗体；第一试剂制备，所述抗体与与甲苯磺酰基磁珠进行偶联，偶联结束后去除多余未偶联的所述抗体，然后再使用封闭夜封闭未偶联的甲苯磺酰基磁珠，封闭结束后使用磁珠保存液进行清洗并复溶为母液，所述母液使用磁微粒缓冲液进行稀释并得到所述第一试剂；

7、第二试剂制备，对所述抗体进行标记、孵育和纯化，得到标记好的抗体溶液，使用吖啶稀释液对所述抗体溶液进行稀释并得到所述第二试剂。

8、进一步地，还包括：磁微粒缓冲液的制备，往磁珠保存液中添加纤溶酶抑制剂，然后使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的ph到7.3-7.5。

9、以及上述试剂盒的应用，在样本中加入第一试剂并进行第一次孵育，在第一次孵育结束后进行磁分离清洗，然后加入第二试剂并进行第二次孵育，在第二次孵育结束后进行磁分离清洗，然后添加预激发液、激发液并读取发光信号值，根据发光强度对照标准曲线并计算纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物的浓度。

10、本发明取得的技术效果是：上述试剂盒在测试样本时无需再进行稀释，其与市售的希森美康pic试剂盒进行相关性比较，具有显著相关性。上述试剂盒的制备方法能够减少抗体用量和简化测试程序，具有操作简单、成本低和出结果时间短的优点。

技术特征：

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物的含量，所述试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括：纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物抗体包被的磁微粒和磁微粒缓冲液，所述第二试剂包括：标记物标记的纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物抗体和吖啶稀释液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒缓冲液和所述吖啶稀释液中包含有缓冲体系、稳定剂和防腐剂。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒缓冲液含有纤溶酶抑制剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述纤溶酶抑制剂为赖氨酸或赖氨酸类似物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述赖氨酸类似物包括：6-氨基己酸、氨甲环酸、氨甲苯酸。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述纤溶酶抑制剂的浓度为1-50mm。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述纤溶酶抑制剂的浓度为10mm。

8.一种制备方法，所述方法用于制备如权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物抗体简称为抗体；第一试剂制备，所述抗体与与甲苯磺酰基磁珠进行偶联，偶联结束后去除多余未偶联的所述抗体，然后再使用封闭夜封闭未偶联的甲苯磺酰基磁珠，封闭结束后使用磁珠保存液进行清洗并复溶为母液，所述母液使用磁微粒缓冲液进行稀释并得到所述第一试剂；

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括：磁微粒缓冲液的制备，往磁珠保存液中添加纤溶酶抑制剂，然后使用盐酸或氢氧化钠调节溶液的ph到7.3-7.5。

10.一种试剂盒的应用，使用如权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，在样本中加入第一试剂并进行第一次孵育，在第一次孵育结束后进行磁分离清洗，然后加入第二试剂并进行第二次孵育，在第二次孵育结束后进行磁分离清洗，然后添加预激发液、激发液并读取发光信号值，根据发光强度对照标准曲线并计算纤溶酶-α2纤溶酶抑制物复合物的浓度。

技术总结
本发明公开了一种试剂盒及其制备方法和应用，其中，所述试剂盒用于检测纤溶酶‑α2纤溶酶抑制物复合物的含量，所述试剂盒包括：第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括：纤溶酶‑α2纤溶酶抑制物复合物抗体包被的磁微粒和磁微粒缓冲液，所述第二试剂包括：标记物标记的纤溶酶‑α2纤溶酶抑制物复合物抗体和吖啶稀释液。试剂盒在测试样本时无需再进行稀释，其与市售的希森美康PIC试剂盒进行相关性比较，具有显著相关性；制备方法能够减少抗体用量和简化测试程序，具有操作简单、成本低和出结果时间短的优点。

技术研发人员：黄晓东,廖珍凤,冯晓玉,刘少锋
受保护的技术使用者：深圳市雅为泓源生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/3/16