专利名称：新的酶免疫测定系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的免疫检测法，其中包括的试剂和其使用，以及用于免疫检测的药盒。
更具体地说，本发明涉及一种用于结合和检测抗体的新试剂，以及掺入该试剂的药盒和方法。
酶联免疫测定(EIA)系统广泛用于许多疾病的血清学诊断，特别是那些涉及病毒因子条件的血清学诊断方法。这些检测系统不仅结合了放射免疫测定(RIA)系统的许多固有优点，而且比RIA更为简便、安全、经济。EIA可能在迄今尚未在较大程度上利用的领域内进行高质量血清学检测。理想的检测方法应是快速、经济、简单的，其应用稳定试剂并能安全地在实验室外使用，然而目前还没有一种EIA方法能满足这些要求。
EIA中已广泛使用了许多酶，包括棘根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。然而，许多近来的报导(Yolken等，J.Imm.Methods，73∶109-123，1984;Wagle等，IndianJ.Med.Res.，81∶275-280，1985)描述，可将β-内酰胺酶用作酶联免疫测定法(EIA)的另一代用标记物。该酶很容易得到，价格便宜，在常温下有高更新速率，使用安全底物而且全部没有哺乳动物组织，与昂贵、不易得到并有潜在致癌底物的其他酶系统相比，该酶更为优越。而且β-内酰胺酶的活性可以通过深兰色聚乙烯醇(PVA)/碘络合物的褪色速率而能用肉眼观测出来，这是因为β-内酰胺酶水解青霉素之最终产物青霉酸(Penicilloicacid)的碘化作用所致。
酶和可与免疫球蛋白产生特异反应之分子的结合物已得到广泛地使用。先前的报导已描述了β-内酰胺酶与多克隆抗体、单克隆抗体及抗生物素蛋白的共价键合，并在EIA系统中使用这些酶-蛋白质结合物(Yolken等，J.Imm.Methods，73∶109-123，1984;Wagle等，IndianJ.Med.Res.81∶275-280，1985)。然而，酶和葡萄球菌蛋白A或链球菌蛋白G的结合物两者均可与多种免疫球蛋白的Fc区特异结合，为检测这些抗体提供了普遍适用的工具。另外，β-内酰胺酶/蛋白A或G结合物对所有四种人IgG亚类均具有显著的亲和性。当这两种蛋白质特异地结合到免疫球蛋白的Fc区时，它们并不能损害所说的免疫球蛋白与抗原结合的能力。再者，β-内酰胺酶能够与蛋白A或蛋白G结合，以产生在很大程度上保留其酶促活性和免疫学活性的结合物。
Ambedkar等人(HindustanAntiboticsBulletin，29∶4-5，1987)和Citri(以色列专利申请80313号，申请日1986年10月15日)介绍了在酶联免疫检测系统中使用蛋白A和β-内酰胺酶的原理。
本申请涉及一种新的EIA系统，其包括使用一种联接到适当酶上的免疫球蛋白结合的蛋白质，用以检测和/或定量分析针对样品中之一个或多个特定抗原的抗体。该EIA系统包括(a)一种固相载体，其中与含抗体样品接触之所说固相载体的表面是由特异性抗原包被的，(b)使含抗体样品与结合载体的抗原反应，从而使存在于样品中的抗特异抗原之抗体结合到所说已被结合的抗原上，并且洗掉过量未结合的抗体，(c)将结合的抗体与免疫检测结合物一起保温，其中所说的结合物包含与结合抗体结合的免疫球蛋白活性受体及一种活性标记物，然后用水溶液洗去过量未结合的结合物，(d)通过与适当的底物，如一种可导致适当试剂产生可见之颜色变化的底物一起保温来测定标记酶的酶促活性，其中结合酶是结合免疫球蛋白并指示抗体存在的标记酶。
因此本发明提供了一种用于结合并检测抗体的免疫检测试剂，其包括免疫球蛋白的活性受体及一种活性酶标记物。
另外，本发明的特异结合检测方法，其可通过“夹心”型免疫检测法用于检测和/或定量分析样品(为一种液态介质)中的半抗原或抗原，所说的检测法中，“俘获抗体”被固定于固相表面上，以俘获存在于样品中的半抗原或抗原。然后加入抗半抗原或抗原的“第一”抗体以形成“夹心”，可通过与酶标记的免疫球蛋白受体(如蛋白G/蛋白A)一起保温并测定酶活性(如上面步骤(c)和(d)所述)来显示该第二抗体的结合。该方法只要求酶标记的免疫球蛋白结合抗体不与俘获抗体结合。使用不与免疫球蛋白结合受体结合的俘获抗体即可满足这一要求(例如，在使用蛋白G的情况下使用IgM，而在使用蛋白A的情况下则可使用由鸡血清或卵黄中制得的IgY)。
用于检测和/或定量测定液体介质样品中半抗原或抗原的另一种方法，是向所说样品内加入对待测半抗原或抗原特异的抗体，并保温该反应混合物，其中所说的反应混合物与同一待测半抗原或抗原已固定于其表面上的固相载体相接触。结合已固定于固相表面上之抗原或半抗原的抗体量成比例地减少。通过用水溶液冲洗从固相载体上分离所说样品之后，进行上述步骤(c)和(d)，所得酶促活性与样品中半抗原或抗原的浓度成反比。经与具有已知标准半抗原或抗原浓度的参照样品相比较，可以计算出样品中半抗原或抗原的浓度。
本发明的另一个目的是提供一种呈药盒形式的配套EIA系统。药盒包括一个特别设计的注射器或毛细管系统，与结合免疫球蛋白的蛋白-酶结合物一起提供一种价格便宜、便于使用、不需专用仪器、包含最少步骤、可用肉眼读数、一次性使用、与样品或试剂接触机会最少、并能满足快速检测之全部要求的配套检测系统。
可以结合到EIA酶上的免疫球蛋白结合蛋白质包括能与所说的酶结合的任何免疫反应剂。适用的免疫反应剂包括免疫球蛋白、抗生物素蛋白、生物素及其他免疫球蛋白结合蛋白，例如对免疫球蛋白有强亲和力的大消化球菌(Peptococcusmagnus)蛋白L(LarsBjorck等，J.Imm.Methods，140(4)∶1194，1988)。可用于本发明之优选的免疫球蛋白结合蛋白为蛋白A和蛋白G，最好是蛋白G。
适用于EIA的酶是那些通过与显色试剂底物反应，以引起一种明显且清晰的可见颜色改变而提供由肉眼可见之终点检测的酶。在本发明的优选实施方案中，β-内酰胺酶是一种结合的酶，它催化青霉素水解为青霉酸，其存在是通过PVA/碘或淀粉/碘溶液的明显颜色改变而显示的。
本文所描述的EIA系统可用于检测针对任何抗原的抗体，尤其是病毒或细菌性抗原。该系统也适用于检测真菌或寄生虫病、自家免疫病、蛇毒素、血清成分、类固醇、激素或见于生物体液中之足够用于常规EIA的其他物质。生物体液包括全血、血清、血浆、唾液和脑脊髓液。因而，包被在固相载体上的抗原可包括那些由乙型肝炎病毒、风疹病毒、EB病毒、细胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)中制得的抗原。
可以使用的固相载体包括任何适用的结合抗原的载体，特别是毛细管系统和注射器，其包括可按照本发明的方法进行检测、并适于提供肉眼可见之终点检测的一次性使用的系统。
本发明之EIA系统的优点包括1.借助蛋白G-β-内酰胺酶结合物使PVA/碘的褪色反应，使之在敏感性上可与其他检测系统相比。
2.结合物的制备方法简便且成本较低。
3.β-内酰胺酶具有高更新速率，价格较低且没有哺乳动物组织。
4.报导指出，该结合物可长期(如至少一年)保持稳定(IgG/β-内酰胺酶，Wagle等，1985;蛋白A/碱性磷酸酶，Paln等，1981)，从而表明蛋白G-和蛋白A-β-内酰胺酶结合物及其他结合物均具有长的贮存寿命。
5.对另一种位点测定法的适用性来说，其检测系统是配套的、可快速检测并易于完成，只有少数几个步骤、使用非毒性的耐用试剂、且可安全处置并提供快速及可肉眼观察并易于整理的结果。
6.不管使用什么包被蛋白，均可在一个系统中进行多项检测，并使用同一对照物。
为了更清楚地了解本发明，现参照优选实施方案作更为详细的描述。下文主要是针对检测抗HIV抗体进行描述的。然而，这并不是说本发明只限于这一优选方案，而是说本发明包括了不超出所附权利要求的对本发明的各种替换、变更及等同方案。
以下所述的实施方案及涉及有关优选方案的实施例旨在举例阐明本发明的基本原则和有关概念。
固相载体的抗原包被用10μg/ml聚(L-赖氨酸、L-苯丙氨酸无规共聚物)(PLP，批号P3150，Sigma化学品公司)的蒸馏水溶液将固相载体包被过夜，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗并用溶于PBS溶液的1%戊二醛(批号G6257，Sigma化学品公司)活化24小时。用PBS冲洗载体，然后用溶于0.1M NaHCO3溶液(pH9.6)的50-100μg/ml全病毒溶胞产物或溶于硼酸盐缓冲盐水(BBS)(pH8.4)的合成肽包被之。单用缓冲液包被对照载体。另一种包被方法是将蛋白质或肽(1mg/ml，溶于PBS，pH6.4)与PLP(1mg/ml，溶于蒸馏水)相混合，然后加入100μg新溶解的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDAC，批号E6383，Sigma化学品公司)或任何类似交联剂，于35℃下保温6小时，然后用PBS作1∶10稀释，并对其表面包被过夜。
抗原包被后，用溶于PBS的1%调咖啡白油(CoffeeWhitener，非乳制品)或1%BLOTTO(脱脂奶粉)(Johnson等，GeneAnal.Techn.，1∶3-8，1984)包被固相载体，以便在EIA期间阻断蛋白质的非特异性结合。但胎牛血清、明胶或上述蛋白质的混合物亦可作为适用的代用品。
蛋白G-β-内酰胺酶结合(Yolken等，J.Imm.Methods，73∶109-123，1984)
蛋白G得自Pharmacia公司，β-内酰胺酶(EC3.5.2.6)得自Sigma化学品公司(批号PO389)。将内酰胺酶于4℃下对三次更换的蒸馏水渗析。通过戊二醛使内酰胺酶与蛋白G以4∶1或2∶1的摩尔比结合将溶于0.5ml0.1MPBS的2.13mg内酰胺酶加到0.65mg蛋白G(2∶1)或0.33mg蛋白G(4∶1)中，再向溶液内逐滴加入0.025ml%戊二醛。于室温下保温2小时后，使溶液对3次更换的PBS(pH7.4)透析。经凝胶排阻层析法纯化结合物，其与未纯化的结合物相比，并没有增加反应敏感性(Yolken等)，这可能是由于高速率掺入结合物中之故。
终点检测试剂使用以5mg/ml浓度溶于PBS的青霉素G(苄基青霉素，PEK-K，Sigma公司)或青霉素V(苯氧基甲基青霉素酸，批号P1382，Sigma公司)。PVA/碘/青霉素底物试剂包含63mM KI/12mM I2和0.5%PVA(聚乙烯醇，BDH，批号30573)的蒸馏水溶液。使用前将青霉素以5mg/ml的浓度加到溶于PBS的1∶2PVA/碘试剂中。
药盒配置一次性使用的聚乙烯移液吸管(DPTP，M型，批号223-9563，BIO-RAD公司)这些吸管最初被用作注射器的原型。DPTP的工作容量为0.65ml，管腔体积约为0.02ml。在DPTP的管腔内完成免疫分析，而球体则用作洗涤溶液的储存器。简单地说，按上述方法用抗原包被管腔，然后用1%调咖啡白油(CoffeeWhitener)阻断可能的非特异结合。用PBS/0.05%吐温20中的1%调咖啡白油稀释试验血清，在DPTP中保温并用几倍体积的PBS/吐温洗掉未结合的抗血清。与蛋白G/β-内酰胺酶结合物保温后，用PBS/吐温洗掉未结合的结合物。根据PVA/碘/青霉素底物由兰色变为无色溶液来指示抗体的存在。各试验均包括阳性和阴性血清对照，以及检测各样品的“无抗原”DPTP。
一次性使用的注射器
图1中图解显示了本发明的一次性使用的注射器，其中聚丙烯注射器(5)的前端有一入口(3)和聚碳酸酯衬垫(2)，通过衬垫(2)模制了三个(可能更多个)毛细管(1)。注射器和衬垫的透明或半透明性质可易于看清毛细管内的任何颜色变化。拉出柱塞(4)时，血清、结合物、洗涤溶液和指示剂/底物可相继地通过入口(3)和衬垫(2)之抗原包被的毛细管(1)吸入，并集中和包含在衬垫后面的注射器管腔(6)内。为了足以容纳所有试剂。须使用容积为10ml的注射器。该系统除了配套并易于处理外，还可将阳性对照物、阴性对照物和试验血清装入同一注射器内，其中阳性对照可包括免疫球蛋白包被的毛细管，而阴性对照则是没有抗原的。也可以使用多试验系统的注射器，其中有许多包被了不同抗原(如HIV和乙型肝炎表面抗原)的毛细管，其可加有阳性和阴性对照物。
与需要吸入和排出试验血清、洗涤溶液和结合物的DPTP系统不同，注射器系统是基于只在一个方向上吸入上述试剂，即进入注射器的管腔，然后可在试验终了时安全地弃去。可设计一个棘轮样系统以输入固定的体积，但这样要增加成本而且并不是必要的。但能较容易地将注射器改成柱塞只朝一个方向移动的，从而消除回流问题。
为了满足快速检测的要求，可以使用最小保温时间和洗涤体积。这包括选用最适血清和结合物稀释度并在不损害检测敏感性及特异性的情况下达到饱和包被条件。要严格控制结合物的制备，以确保各批之间的均一性。
以下实施例旨在举例说明上述步骤和装置。下述程序适用于所有实施例，并包括阴性对照(无抗原)和阳性对照(用标准的ELISA技术测定已知抗体活性)1.于25℃下与在1%调咖啡白油(溶于PBS/吐温)中作不同倍数稀释的血清保温5分钟。
2.用PBS/吐温洗涤。
3.于25℃下与在1%调咖啡白油(溶于PBS/吐温)中作不同倍数稀释的蛋白G-β-内酰胺酶结合物保温5分钟。
4.用PBS/吐温洗涤。
5.与PVS/碘/青霉素底物保温。
6.测定颜色由深兰变为澄清(指示阳性反应)的时间。
实施例1DPTP系统-用溶于PBS/吐温的1%调咖啡白油1∶1稀释有高抗破伤风类毒素(T/T)滴度的供体血清，并使用在溶于PBS/吐温之1%调咖啡白油中作1∶1，000倍稀释的内酰胺酶结合物。于25℃下用在PBS(pH7.2)中作1∶100稀释的储备破伤风类毒素(100Lf/ml，CommonwealthSerumLaboratories(CSL))过夜包被塑料表面。72小时后阴性对照组仍为深兰色，而试验样品在4分钟内变为澄清。
实施例2DTTP系统-经用溶于PBS/吐温的1%调咖啡白油1∶1稀释来检测HIV抗体的阳性和阴性血清;以50μg/ml包被CSL病毒分离物;所用的内酰胺酶结合物为1∶1000稀释液。阳性对照组在5分钟内澄清，而阴性对照组在60分钟后澄清。
实施例3DPTP系统-经用溶于PBS/吐温的1%调咖啡白油1∶1稀释来检测HIV抗体的阳性和阴性血清;按上述方法包被肽2(HIV1毒株特异的)和肽5(HIV2毒株特异的)。16小时后阴性对照组仍呈深兰色，HIV2包被的DPTP也是深色的，此表明这些抗原决定基之间没有交叉反应性;HIV1包被的DPTP系统在3分钟内澄清。
实施例4注射器系统-经用溶于PBS/吐温的1%调咖啡白油1∶1稀释来检测HIV抗体的阳性和阴性血清;肽2(HIV1特异的)包被在衬垫的毛细管上。根据个别对照组的抗体滴度不同，阳性对照组在3-6分钟内澄清。阴性对照组在30分钟后澄清。
权利要求
1.一种用于检测和/或定量分析样品中之一种或多种抗体的酶联免疫检测系统，其包括(a)一固相载体，其中将与含抗体样品接触的所说固相载体的表面是用人特异性抗原包被的，(b)使含抗体的样品与载体结合的抗原反应，从而存在于样品中之对已结合的抗原特异的抗体结合到所说结合的抗原上，并洗掉过量未结合的抗体，(c)使结合的抗体与免疫检测结合物一起保温，其中所说的结合物包含一种与已结合之抗体结合的免疫球蛋白的活性受体及一种活性标记酶，并用水溶液洗掉过量未结合的结合物，(d)经与适当底物一起保温来检测标记酶的酶促活性。
2.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，其中固相载体由毛细管或注射器构成。
3.根据权利要求1的免疫检测结合物，其中所说的免疫球蛋白之活性受体是蛋白A。
4.根据权利要求1的免疫检测结合物，其中所说的免疫球蛋白活性受体是蛋白G。
5.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，其中活性标记酶是β-内酰胺酶。
6.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，其中抗体是根据酶促活性测定的，而酶促活性又是由底物/指示剂的明显颜色变化显示的。
7.根据权利要求1或6的酶联免疫检测系统，其中底物/指示剂溶液含有反应物碘和聚乙烯醇，或碘和淀粉。
8.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，其进一步包含一固相载体，该载体表面上固定有俘获抗体或对待检抗体特异的半抗原或抗原。
9.包含根据权利要求7或8之酶联免疫检测系统的试验药盒。
10.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，当其用于检测或定量分析样品中的半抗原或抗原时，其中所说的固相载体表面上固定了对待测抗原或半抗原特异的抗体，且其中含待测抗原或半抗原的样品与固相载体接触一起保温，并在从固相载体上洗掉所有微量未结合的半抗原或抗原后，使对所说的半抗原或抗原特异但不与俘获抗体结合的第二抗体与固相载体接触并保温，并洗掉过量未结合的第二抗体，这样用于同结合物结合的第二抗体的量便直接与样品中的抗原或半抗原浓度成正比。
11.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，当用于检测和/或定量分析样品中的半抗原或抗原时，其中所说的固相载体表面上固定了同样的待测半抗原或抗原，且在步骤(a)中向试验样品中加入对所说半抗原或抗原特异的抗体，由于结合所说样品中的所说半抗原或抗原，结果可用于结合固定于固相表面上之半抗原或抗原的抗体量成比例地减少。
12.根据权利要求11的酶联免疫检测系统，其另外还含有对待测半抗原或抗原特异之抗体的标准化溶液。
13.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，其中待检抗体是对病毒性、细菌性、真菌性、寄生虫性或自家免疫性抗原特异的。
14.根据权利要求1或12的酶联免疫检测系统，其中包被在固相载体上的抗原或肽包括得自乙型肝炎病毒、风疹病毒、EB病毒、细胞巨化病毒、人免疫缺陷病病毒的抗原或肽。
15.用于根据权利要求1检测和/或定量分析抗体的药盒，其包含用特异性抗原或俘获抗体包被的固相载体，一种阴性对照及阴性对照，以及一种免疫检测结合物。
16.根据权利要求15的药盒，其包含于一封闭的系统内。
17.根据权利要求16的药盒，其中封闭的系统是一透明或半透明的注射器。
18.根据权利要求16或17的药盒，其中封闭的检测系统是一次性使用的。
19.根据权利要求15的药盒，其可用于同时检测许多特异性抗原和/或抗体。
20.根据权利要求17的药盒，其中注射器包括一注射器前部的衬垫，通过该衬垫模制了一个或多个固相载体。
21.根据权利要求20的药盒，其中用于检测分析的溶液，包括样品，通过模制到衬垫内的抗原包被或抗体包被的固相载体吸入被收集和包含在注射器管腔内衬垫的后面。
22.根据权利要求20或21的药盒，其中固相载体是毛细管。
23.根据权利要求1的酶联免疫检测系统，其基本上是如本文及有关实施例中所描述的。
24.根据权利要求16的药盒，其基本上是如本文及附图1中所描述的。
全文摘要
本发明涉及一种新的免疫检测法，其中所涉及的试剂及其用途，以及该免疫检测法所涉及的药盒。
文档编号G01NGK1038699SQ8910434
公开日1990年1月10日 申请日期1989年5月11日 优先权日1988年5月11日
发明者托马斯·洛多瓦瑞亚, 卡莱恩·安斯帕克斯, 皮特·威箫·法兰兹, 约翰·佐德斯 申请人:澳大利亚慈善机关修女财产托管人