专利名称：反相氨基酸专用色谱柱及其紫外吸收定量测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种液相色谱柱及利用该柱建立的分析测定方法，具体地说是提供一种氨基酸专用分析柱和相应的分析方法。
氨基酸传统分析方法大多采用离子交换柱分离，然后用茚三酮显色剂进行衍生化后再测定，设备复杂、价格昂贵，分析时间长。近十年来国外已采用邻苯二甲醛、胆酰氯、荧光胺等进行衍生化，用反相柱进行分离，用荧光法测定，但从未报导过色谱柱的制备方法，并用尚需购买价格昂贵的荧光检测器才能测定，且只能测定初级氨基酸，所生成衍生物一般只能保持一天到数天，稳定性较差。
本发明的目的是提供一种反相氨基酸专用色谱柱及色谱柱的制备方法，同时本发明又提供了一种利用这种专用分析柱对氨基酸进行分离和测定的方法。
本发明的反相氨基酸专用色谱柱，可选用普通液相色谱仪通用型柱子的结构，采用通常的填装方法，装入高键合量烷基键合柱而制成，其特征在于键合相可用下式表示
其中≡Sl-O-为硅胶;X为短链硅烷基，
，R为-CH3或-C2H5。Y为长链烷基-CnH2n+1，其中n为16～20。
本发明的反相氨基酸专用色谱柱的制备方法，其特征在于按下述步骤进行(1)长链烷基硅烷的合成利用长链烯烃与三氯氢硅进行合成反应生成长链烷基硅烷，反应可用下式表示
式中n＝16～20，上述合成反应可在高压釜中进行，反应温度控制在100-180℃。
(2)硅胶的前处理选用孔径为6-10nm的硅胶，使用前用盐酸进行酸洗处理，通常是在油浴中用稀盐酸回流处理1-4小时，然后经干燥得处理后硅胶。
(3)键合相的制备将(1)制得的烷基硅烷与一定量硅胶反应，使硅胶与烷基硅烷进行键合，制得键合相，其键合反应为
(4)将上述键合硅胶进行水解，再用硅烷基钝化，即可制得本发明作为色谱柱填料的性能稳定的键合相，其反应式如下
式中-R为短链烷基，如-CH3，-C2H5，反应产物分别用氯仿、丙硐、甲醇抽提、洗涤，再经干燥即得到分析柱填料。
(5)氨基酸分析柱的装填选用普通液相色谱仪能用型柱子，将上述步骤制备的填料，按普通的色谱柱装填方法即可制备本发明的氨基酸分析柱，填装压力以40～80MPa为最好。
具体地说本发明的制备方法，其特征在于键合反应在下述条件下进行反应在甲醇溶剂中进行，可加入吡啶作催化剂，反应物料比硅胶∶烷基硅烷＝100∶40～80(重量比)催化剂加入量为硅胶量的1～3%(重量)，反应在溶剂沸点进行回流2小时以上。
在钝化反应时氯硅烷的用量应过量，一般采用硅胶∶氯硅烷＝100∶50～90(重量比)本发明的氨基酸的紫外吸收定量测试方法，在普通高效液相色谱仪上安装上述专用色谱柱，对氨基酸进行分离和测定，其特征在于采用1-氟2，4-二硝基苯试剂，反应温度50-80℃下将氨基酸样品衍生化，再采用低浓度醋酸钠水溶液及乙腈/水为流动相，并在压力范围为8.0～12.0MPa，流量0.5～2ml/mln，采用紫外检测器，波长在360～365nm下进行操作，醋酸钠浓度为30～90mmnl/L，对氨基酸进行分离和测定。
具体地说本发明的测试方法中，其氨基酸的衍生化反应的按下述方式完成配制100-500Pmnl氨基酸溶液，取1体积置于10体积棕色容量瓶中，加入1体积0.1～0.5mnl/L弱碱溶液，如碳酸氢钠和1体积0.1～1%的1-氟-2，4-二硝基苯的乙腈溶液、混匀，在40～80℃水浴中避光反应40分钟以上，冷却后加入0.01～0.05mul/L磷酸二氢钾溶液，定容至10体积，取1体积离心5～15分钟即可取样分析。
将上述步骤制得的反相氨基酸专用色谱柱安装在高效液相色谱仪中，选用紫外吸收检测器，在360～365nm进行测定，采用碳酸钠及乙腈/水为流动相，在一般操作条件下，对近20种氨基酸的衍生物可获得满意的分离。
本发明的反相氨基酸专用色谱柱室温对大多数氨基酸柱效达每米十万理论塔板数，衍生化反应后的氨基酸衍生物非常稳定，在4℃下避光保存一个月内响应值变化小于5%，用紫外检测器检测，不仅能对初级氨基酸，而且可对次级氨基酸进行检测，最小检知量可达10fmol。
图1，17种标准氨基酸在反相氨基酸专用色谱柱上的分离。
图2，猪血蛋白中各氨基酸组成的分离结果。
图3，灵芝中各种氨基酸在反相氨基酸专用色谱柱上的分离。
实施例1填料合成(1)在不锈钢高压釜内加入α-十八烯和三氯氢硅，加热至120℃进行反应，取40g产物待用;
(2)选用孔径为10nm硅胶在1.5mol/L的盐酸中于油浴中回流4小时，在120℃下烘干8小时，冷至室温。
(3)取(2)步骤硅胶100g，放入500ml三口瓶中，加入200ml甲苯，再加入(1)步产物40g，再加入5g吡啶，徐徐升温至沸，回流6小时，再分别用氯仿、丙酮抽提，洗涤、干燥。
(4)将产物水解后，按100g加入80g三甲基氯硅烷的比例加入三甲基氯硅烷，再分别用氯仿、丙酮、甲醇抽提、洗涤、干燥，即得到色谱柱填料。
实施例2填料合成(1)α-十六烯和三氯氢硅在80℃下反应，取80g产物待用;
(2)取孔径为6nm硅胶，在1.5mol/L盐酸中回流1小时，在140℃下干燥10小时，冷至室温;
(3)取(1)产物80g加入100g硅胶，放入500ml三口烧瓶中，加入200ml甲苯，1g吡啶，升温至沸，回流2小时，洗涤、干燥;
(4)将产物水解后，按100g加入80g三己基氯硅烷的比例加入三己基氯硅烷，同实施例1的(4)步骤处理，即得到色谱柱填料。
实施例3填充色谱柱将5g如实施例1或2制得的填料加入12ml四氯化碳，6ml二氧六环和1ml正庚酸，超声震荡15分钟，倒入匀浆缶中，以甲醇为冲洗剂在80MPa压力下迅速将匀浆填入L250×I.D4.6mm的色谱柱中，在45MPa压力下冲洗30mln、色谱柱即填充完毕。
实施例4氨基酸样品的衍生化及测试配制400Pmol的标准氨基酸溶液，取1ml置于10ml棕色容量瓶中，分别加入1ml0.5mol/L的碳酸氢钠溶液和1mL含1%1-氟-2，4-二硝基苯的光谱纯乙腈溶液，在50℃水浴中避光反应60分钟，冷却后加入0.01mol/L磷酸二氢钾溶液，定容至10ml，混匀，取1ml于离心过滤试管中，于4000转/分下离心10分钟，用取样器取10μL，打入装有反相氨基酸专用色谱柱的色谱仪中，谱图见图1。
其中1、天冬氨酸(ASP);2、谷氨酸(Glu);3、丝氨酸(Ser);4、副产物(DNP-OH);5、甘氨酸(Gly);6、苏氨酸(Thr);7、脯氨酸(Pro);8、丙氨酸(Ala);9、精氨酸(Arg);10、缬氨酸(Val);11、蛋氨酸(Met);12、异亮氨酸(Ile);13、亮氨酸(Leu);14、色氨酸(Trp);15、苯丙氨酸(Phe);16、组氨酸(Hls);17、赖氨酸(Lys)。
实施例5猪血蛋白氨基酸组成分配取猪血蛋白配制成300Pmol溶液，同实施例4步骤衍生化，并取样分析，即得到猪血蛋白中氨基酸的含量谱图(见图2)。
图中编号同实施例4实施例6灵芝中氨基酸的测定将灵芝提取液配制成200Pmol溶液，同实施例4步骤衍生化后，取样分析，即得到灵芝中氨基酸的含量谱图。见图3，图中编号同实施例4。
实施例7将实施例4中经离心分离后的产物即氨基酸衍生物在4℃下避光保存，分别在第10天、20天、30天测定，氨基酸衍生物的响应因子其变异系数分别为1.82%、1.78%、2.13%，说明氨基酸衍生物很稳定，其变化在误差范围之内。
权利要求
1.一种反相氨基酸专用色谱柱，可选用普通液相色谱仪通用型柱子的结构，采用通常的填装方法，装入高键合量烷基键合相而制成，其特征在于键合相可用下式表示
其中≡Si-O-为硅胶；X为短链硅烷基；R为-CH3或-C2H5；Y为长链烷基-CnH2n+1，n为16～20。
2.一种按照权利要求1所述的反相氨基酸专用色谱柱的制备方法，其特征在于按下述步骤进行(1)长链烷基硅烷的合成利用长链烯烃与三氯氢硅进行合成反应生成长链烷基硅烷，反应温度控制在100-180℃;(2)硅胶的前处理选用孔径为6-10nm的硅胶，使用前用盐酸进行酸洗处理，通常是在油浴中用盐酸回流处理1-4小时，然后经干燥得处理后硅胶;(3)键合相的制备将(1)制得的烷基硅烷与一定量硅胶反应，使硅胶与烷基硅烷进行键合，制得键合相;(4)、将上述键合硅胶进行水解，再用硅烷基钝化，即可得到本发明作业色谱柱填料的性能稳定的键合相，反应产物分别用氯仿、丙酮、甲醇抽提，洗涤，再经干燥得到分析柱填料;(5)氨基酸分析柱的装填选用普通液相色谱仪通用型柱子，将上述步骤制备的填料，按普通的色谱柱装填方法，即可制备本发明的氨基酸分析柱，填装压力以40-80MPa为最好。
3.一种如权利要求2所述制备方法，其特征在于键合反应在下述条件下进行反应在甲醇溶剂中进行，可加入吡啶作催化剂。反应物料重量比硅胶∶烷基硅烷＝100∶40～80，催化剂加入量为硅胶量的1～5%(重量)，反应在溶剂沸点进行，回流2小时以上。
4.一种如权利要求2所述制备方法，其特征在于钝化反应时氯硅烷的用量应过量，一般采用重量比硅胶∶氯硅烷＝100∶50～90。
5.一种利用普通高效液相色谱仪采用按照权利要求1所述的专用色谱柱对氨基酸进行测定分离的紫外吸收定量测试方法，其特征在于采用1-氟-2，4-二硝基苯试剂，反应温度50-80℃下将氨基酸样品衍生化，再采用低浓度醋酸钠水溶液及乙腈/水为流动相，并在压力范围为8.0～12.0MPa，流量0.5～2ml/mln，采用紫外检测器，波长在360～365nm下进行操作，醋酸钠浓度为30-90mmol/L，对氨基酸进行分离和测定。
6.一种如权利要求5所述测试方法，其特征在于氨基酸的衍生化反应按下述方式完成配制100-500Pmol氨基酸溶液，加入0.1-0.5mol/L，弱碱溶液如碳酸钠和0.1-1%的1-氟-2，4-二硝基苯的乙腈溶液，混匀，在40-80℃水浴中避光反应40分钟以上，冷却后加入0.01-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液，离心5-15分钟即可取样分析。
全文摘要
一种反相氨基酸专用色谱柱及紫外吸收定量测定法，采用如下结构的填料填充色谱柱。
文档编号G01N30/60GK1087173SQ9211187
公开日1994年5月25日 申请日期1992年11月17日 优先权日1992年11月17日
发明者商振华, 于亿年, 周良模 申请人:中国科学院大连化学物理研究所