专利名称：免疫测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫测定。
从存在于不同生物，尤其是细菌、病毒、寄生物及其它致病(感染性)生物的体内得到的体液样品和固体样品如细胞或组织物的检验是按常规进行的。检验在两个主要的范围里进行。一种是对体液样品和固体样品的检验，其目的是诊断疾病，监控疾病过程和/或监控对个体的治疗过程。这种检验通常被称作临床检验，一个典型的临床实验室对大量不同的生物进行检验。“病原体”这个词用在这里表示致病生物。
另一种主要的检验是为了筛选捐献的血液以保持血液的供给及血液制品不受致病的污染。每一个国家的常规管理机关都明确规定需要进行检验的病原体。目前在大多数国家都必须对人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎(非甲非乙型肝炎)、乙型肝炎及梅毒进行集体检诊。在有些国家还要求检查人T细胞白血病-淋巴瘤病毒(HTLV)。最近大多数国家还必须对HIV-1和HIV-2进行检查。用于输血给即将或已经接受移植的病人或者遭受免疫损伤的病人的血液一般要被检验巨细胞病毒(CMV)的存在。正因为发现新的病原体以及已知病原体的新的亚种对血液的供应造成了威胁，使得对捐献血液检验的强制需要延及这些病原体。
应用最广的血液筛分试验是免疫测定。对于大多数血液病毒病原体来说，检验血液中抗原的存在比检验抗体的存在更难获得所需的灵敏度。一般来说，对HIV、HTLV、丙型肝炎病毒(HCV)和CMV的检验是抗体检验。对乙型肝炎有两种检验对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抗原测定及对乙型肝炎核心抗原(HBc)的抗体测定。目前，大多数国家中都必须检测HBsAg，在某些国家，对乙型肝炎核心抗体的检验也是必需的，还可能被更多的国家采用。抗体和抗原的检验都能用于梅毒。
血液的筛分大规模地进行，尤其重要的是能很快取得结果，因为血液的货架寿命相对较短。为了节约时间和财力，提出了可以在一个检验样品中测出一种以上病原体的测定法。
确定同种病原体的两个亚型的抗体测定法，尤其是用于HIV-1和HIV-2(HIV-1+2)以及HTLV-I和HTLV-II(HTLV-I+II)，已经被供应出售。然而必须指出同种的亚型之间经常有很大的交叉反应性，例如，HIV-1和HIV-2之间的免疫交叉反应性的程度如此之大以致于最初市售的HIV-1检验实际上测出了很大部分含HIV-2的血液。因此，正如在欧洲专利申请EP-A-0484787中所解释的那样，对同种病毒的两种亚型提供的抗体检验法与对基本上没有免疫交叉反应性的两种完全不同的病原体所提供的抗体检测法在技术上有很大的区别。“联合检测法”一词在此是指在对样品的一次检测中，可以检出或测定两种或更多种基本上没有免疫交叉反应性的致病生物。“不同病原体”一词在此表示基本上没有免疫交叉反应性的病原体。
欧洲专利申请EP-A-0484787中提出对捐献血液中可能出现的病毒病原体(血液病毒病原体)进行的联合抗体检测法，尤其是对HIV和HCV(丙型肝炎病毒)的联合检测法。所得到的异相检测法涉及利用多肽包覆于一固体表面以捕获相关的抗体。结果产生的抗原-抗体复合物就可以被测出。
最近市售的这种联合检测法以及HIV-1+2和HTLV-I+II的联合血液检测法的主要缺点是需要在固体表面协同包覆大量抗原。抗原(肽和/或蛋白质)不仅必须均匀包覆，还必须以可使抗原决定簇能与抗体结合的方式包覆。另外，不同抗原之间不得有相互影响。为了确保抗原以令人满意的方式包覆所必须进行的质量控制试验，增加了试验本身以及排斥反应的花费。所要包覆的抗原越多，问题越麻烦花费也越大。每多检测出一种病原体就需要至少增加一种固定抗原的存在。对某些病原体来说，必需能检测出多种抗体。例如，对于HCV，目前可买到的检测包括四种不同抗原。对于HIV-1+2/HCV联合检测则至少需要六种抗原。
除了协同包覆的实际操作上的困难外，得到所需的特异性也有困难。欧洲专利申请EP-A-0484787中指出需要具有强烈抗原性的高纯度抗原。
已经提出用于HIV和乙型肝炎表面抗原的抗体/抗原联合检测法。例如欧洲专利申请EP-A-0286264中提到将能与HIV抗体结合的肽包覆于一固相之上，以及将对HBsAg特异的抗体包覆于一固相之上。这两种固相可以不同，或者也可以将肽和抗体包覆于同一固相上。WO91/10747提到对欧洲专利申请EP-A-0286264中所描述的那种检测法的改进。改进涉及用于包覆和检测HIV抗体的肽的性质以及检测系统的性质。
然而，需要注意的是，基于欧洲专利申请EP-A-0286264中公开的原理，用于HIV和HBsAg唯一可买到的联合检测法中，与协同包覆有关的不同难题，通过在小试管的内表面包覆HIV肽并将小珠上的抗-HBsAg的抗体用于与该试管结合被巧妙地解决了。而且就目前的情况来说这种检测法不是真正的联合检验法，因为将样品与试管中小珠接触以后，小珠被移走，检测步骤分别在小珠和试管上进行。因此，任何关于检测所用的标记抗体和标记抗原之间相互作用的潜在难题，以及任何检测所形成的任何免疫复合物的过程中在检测系统(标记)之间的潜在难题是可以避免的。
根据本发明，联合抗体检测法中在固体表面协同包覆多种抗原的难题以及由之引起的难题以一种简单且完美的使用免疫球蛋白捕获方式的方法解决。
免疫球蛋白捕获方式已经被公知多年。1979年，Duermeyer W.等人在医学病毒学杂志(Journal of Medical Virology)425-32中描述了甲型肝炎的ELISA反应中特异性IgM抗体的测定。所描述的人体样品检测的原理是将抗人体的IgM包覆于固相上，如微量滴定板的小孔，在被包覆的小孔中加入样品并温育，洗涤小孔再将抗原加入小孔中并温育，最终用酶标记的抗体可识别任何被结合的抗原。该论文的作者指出这种检测法可用于任何单个IgM抗体，如抗风疹、单纯性疱疹、巨细胞病毒(CMV)、E-B病毒(EBV)、兔弓形虫以及乙型肝炎核心抗原或其它抗原。
利用免疫球蛋白捕获技术检验血液中单个病原体的检测法，如风疹和甲型肝炎的检测法已经使用几年了。
WO 88/07680中揭示了应用免疫球蛋白捕获技术测定体液而不是血液中的抗体，特别是唾液和尿液中。可买到的用于唾液和尿液的HIV-1+2检测利用的是所描述的IgG捕获技术。
可以确信对免疫球蛋白捕获技术普遍存在偏见，有事实可以证明这一点尽管该技术自1979年起就可以使用，但相对于大量可买到的利用抗原捕获抗体的检测法来说，利用这种技术的检测法只有很有限的量可买到。尤其是，可以确信普遍存在一种态度即在实际中此技术在特异性或灵敏度方面不能有效作用。
利用免疫球蛋白捕获技术将会有相当程度不需要的相互作用从而导致特异性的缺乏，例如描述了测定多种抗体的抗体捕获检测法的WO 89/12231，对有关抗原和免疫球蛋白的Fc区域之间的非免疫蛋白质-蛋白质的相互作用而导致的特异性缺乏表示了关注，并提出在免疫球蛋白捕获测定法中包覆于固体表面的抗体是抗Fc的抗体。因此免疫球蛋白特异性地在Fc区域被捕获，这使得非特异性蛋白质-蛋白质的相互作用不能获得。
利用免疫球蛋白捕获检测法时灵敏度也被认为是个潜在的难题，例如，免疫球蛋白不能被有选择性地捕获，因此没有所要研究的特异性抗体种类的富集。如果这种特异性抗体在绝对意义下以及相对于血清样品中存在的其它抗体种类来说存在的量很小，则可以预见所需研究的抗体的测定将会有困难而且不可靠，尤其是检测会缺乏灵敏度。
奇怪的是与预见相反本发明者发现利用免疫球蛋白捕获技术，所研究的样品内两种或更多种不同的病原体的抗体能以极好的灵敏度和特异性被同时检测出。
本发明提供了利用免疫球蛋白捕获技术测定单个试样中两种或更多种不同的病原体的抗体。
因此，本发明还提供了用于测定液体试样中两种或更多种不同病原体的特异性抗体的方法。该方法包括(i)将样品与固相接触，该固相上已固定了一类或更多类免疫球蛋白的抗体，这样，样品中存在的各类或多类免疫球蛋白可以在固相上被捕获。
(ii)将两种或更多种不同的抗原同时或依次与固相接触，该固相上来自样品的免疫球蛋白已经被捕获。每一种抗原能选择性地与所研究的某一种病原体的特异性抗体结合，每一种抗原以能够直接或间接地提供可检出信号的方式被提供。和(iii)测定固相上最终形成的任何免疫球蛋白-抗原复合物。
固定的抗体可以是直接抗IgG、IgM或IgA的，或者是抗可能用到的不同类免疫球蛋白的抗体混合物。尤其优选抗-IgG和抗-IgM的抗体混合物。
本发明的检测法“联合检测法”具有无限的多用性，因为使用了通用的固相来捕获抗体。使用者通过使用用于检测的适宜抗原试剂就能简单地选择何种抗体以及所研究的样品中何种病原体因而就能被测出。这与通常的检测法是完全不同的，该通常的检测法利用抗原捕获抗体且所研究的抗体的每一次结合需要一种不同的抗原包覆固相。
使用通用固相的多用性对于制造商和多种病原体检测尤其是血液筛分试验和临床检测的使用者来说都是一个主要的优点。如上所述，通用的抗体包覆固相如被包覆的小珠或被包覆的微量滴定板小孔均可以被用作任何和所有的病原体组合抗体检验，因为任何特殊抗体检验的选择性是由检测中所用的抗原反应剂的组合所决定的。
该多用性对于检测法的制造商有利，因为通用的抗体包覆固相可以被所有联合抗体的检测使用，不管是血液筛分或是临床检验。目前国家和国家之间对于捐献血液的抗体检验的强制要求是不同的，因此对不同的地区所需的抗原包覆固相是不同的。为所有地区提供一种通用的抗体包覆的固相可以很大程度地降低制造成本。对临床检验来说，每一种不同的联合抗体检测需要不同的抗原包覆固相。提供一种通用的抗体包覆固相可再次很大程度地降低制造成本。
对制造商而言更进一步的好处在于包覆于固相的成分数目减少了从而使制造成本降低。利用抗原捕获抗体的检测法，对少到仅有两种病原体的联合抗体检测需要多种抗原，例如对HCV/HIV-1+2的联合检测至少需要六种不同的抗原。所要测定的病原体越多，包覆于固相上的抗原也越多。然而根据本发明，为了测定更多的病原体无需在固相上固定更多的抗体，仅有抗IgG的抗体存在就能测定多种病原体。另外，用于包覆的抗体比为了成功包覆尤其是多种抗原包覆所需的高纯度抗原通常要便宜。
本发明的联合检测法的多种性对使用者也很有利，因为例如检测任何特殊的病原体组合可以仅通过利用适当的抗原试剂的组合。这在临床实验室内尤其有用，因为只需购买并贮存一个通用的抗体包覆固相就能检测任何所需的病原体组合。
为了筛分的目的就没必要知道污染的有机体的性质。在血液筛分中，如果一个血样对任何一种被禁止的病原体的抗体都呈阳性反应，则该血液不适于用作输血或用于血液制品的生产，例如，血浆或因子VIII，并且该血液应被丢弃。
能够对捐献血液的一个样品在一次检测中测定任何特殊的国家规章中所规定的所有血液病毒抗体是一个重大的进步，它提供了能大大节省时间和财力的血液库。节省时间很重要，不仅节约了技术员的时间从而进一步节省了成本，而且从全血的货架寿命相对较短的方面看也很重要。
本发明的免疫球蛋白捕获检测法有极好的特异性和灵敏度。我们已经获得含有感兴趣的抗体混合物的样品的结果，这基本上是相应的血清或血浆样品中所得结果的总和，这两种样品每一种只含有一种抗体。在本发明的联合检测中不可能预见到针对不同有机体的大量抗体中的每一种反应起来就好象仅存在一种抗体一样。观察到关于所测出的抗体种类的数目的附加影响是没有预料到的，但却有重要的实用优点。也没预料到本发明的能利用常规测定方式例如微量滴定板而测定法竟如此灵敏。
本发明的测定可以是IgG测定、IgM测定、或为特殊目的IgA测定。可选择的是，不同种类免疫球蛋白的抗体的混合物可以被用于包覆固相。特别优选使用抗-IgG和抗-IgM的抗体混合物。
本发明测定法与利用包覆的抗原捕获抗体的测定法相比另一重要的优点是通过使用固定的抗-IgM，早期的感染可以被可靠地测出。这对于血液筛分和临床研究都很重要。
IgM是应答感染时产生的第一种免疫球蛋白，感染后最初几个星期内特定的IgM抗体上升，稍过些时候，特定的IgG产生了，IgG抗体应答反应是持续不断的，可以持续多年，甚至终生。理论上IgM可以用常规检验测出，即所感兴趣的抗体被捕获到抗原包覆的表面，然后利用如标记的抗-人类-IgM抗体测出被捕获的抗体的存在。然而实际操作中，这种IgM检验通常缺乏特异性，因为IgM是“粘性的”，这就是说，IgM趋向于非特异性地结合于捕获抗原上。用于测出抗原-IgM复合物的经标记的抗-IgM抗体不能区分特定的抗原-IgM复合物和非特异性结合的IgM。由于这个原因，利用固定抗原的常规检验通常用抗-IgG抗体来测定，即这种检验只能对IgG有效。
本发明的测定中，抗-IgM抗体可以包覆于固相。然后，那些抗体从样品中特异性地捕获IgM免疫球蛋白，被捕获的IgM通过标记的抗原的方式被特异地检出。奇怪的是我们发现该系统不是“粘性”的，而且用常规抗原捕获检测法测定IgM抗体所存在的特异性问题也不再存在。如上所述，特别优选使用抗-IgG抗体与抗-IgM抗体的混合物包覆固相，固相上抗-IgM抗体的存在会确保样品中存在的任何早期抗体被测出，同时，抗-IgG抗体的存在可确保持久的抗体被测出。
固相上固定的抗体可以是多克隆抗体如多克隆抗人类抗体，该抗体含有所有种免疫球蛋白的抗体。可选择的是，也可以使用直接抗某种特定种类免疫球蛋白的多克隆抗体，如多克隆抗-IgG和多克隆抗-IgM抗体。多克隆抗体可被纯化，例如通过亲和层析。如果需要，也可使用单克隆抗体。抗免疫球蛋白可分别对IgG、IgM和IgA的免疫球蛋白ν、μ或α链是特异的。
用于包覆固相的多克隆和单克隆抗体可以按已知方法制备。可买到的不同抗免疫球蛋白，如兔、绵羊和山羊的多克隆抗-IgG和抗-IgM免疫球蛋白以及鼠的单克隆抗-IgG和抗-IgM免疫球蛋白。如果包覆所用的是不同抗体的混合物，那么混合物中不同抗体所占比例也可按需要变化。本发明不局限于对来自于人类的样品的研究，也适用于兽医的应用。因此，包覆所用的抗体应该直接抗从所研究样品中得到的那种免疫球蛋白，例如对于人类的样品，包覆抗体应该是抗人类的抗体。
如上所述，本发明的测定法的一个尤其有利的特征是不管所研究的病原体的数目或性质如何，都可使用一种通用的抗体包覆固相的方法。用作包覆抗体的抗体直接抗一种或更多种免疫球蛋白，尤其是抗IgG和IgM，而且它能从样品中捕获到各种免疫球蛋白的具有代表性的部分。通过选择特异抗原的任何特殊组合，该测定法的使用者可以检测病原体的任何组合。抗原试剂可以混合好再提供，或者使用者也可以是在任何所需的组合中分别使用抗原试剂。如果是单独使用，抗原试剂可以同时或依次以任何次序与携有被捕获的免疫球蛋白的固体表面接触。通常在一步中加入所需试剂的混合物更方便。
本发明的检测法中所用的抗原可以是任何可与所研究的抗体选择性地发生相互作用的抗原实体。例如，抗原可以是肽或多肽，可以是合成的或重组的抗原，或者从细胞培养物例如从病毒裂解物中纯化的抗原。在某些场合用含有某种特殊有机体和一种以上抗原区域的重组融合多肽特别有用，如HCV。
抗原自身可以被标记，用的是能直接或间接提供可识别标志以使任何免疫球蛋白-抗原复合物可以被测出的方法。被标记的抗原被称作“抗原结合物”。
可识别的标志可以是光学上的、放射性的或者物理化学上的，可以通过标记抗原直接提供，例如用染料、彩色颗粒、放射性标记、电活性类、磁共振类或者荧光团，或者用酶标记抗原来间接提供，该酶自身可以引起各种可测量出的变化。可选择的是，标志可以从与抗原结合物有关的凝集作用、衍射作用或双折射作用产生。
更具体地说，可以间接提供可识别标志的方法包括一个与抗原结合的抗体。这种抗体(Ab1)可以用上述直接或间接的标记方式提供给抗原(单抗体测定系统)，或者以另一种抗体(Ab2)的方式被标记，这种抗体与Ab1结合，它自身按上述方法直接或间接地被标记以供给抗原(双抗体测定系统)。如果难以产生适当的抗原结合物，测定被捕获抗体-抗原复合物的单或双抗体系统就特别有用。例如一些抗原结合物作为商品使用时趋于不够稳定，而且一些抗原在结合时丧失了抗原性。
单抗体测定系统的优点在于涉及较少的洗涤和温育步骤，但缺点是对每一种需测定的抗原都必须产生一个抗体结合物(被标记的抗体Ab1)。双抗体测定系统的优点在于适当选择Ab1和Ab2，就可以如下所述只用一个抗体结合物(被标记的抗体Ab2)来测定所有被捕获的抗体当在同一动物种中产生每种抗体(Ab1)，则第二种抗体(Ab2)是抗该动物种的抗体。例如如果每一种Ab1抗体是绵羊的抗体，那么被标记的抗绵羊的抗体就被用作Ab2。对于使用者来说仅需一种抗体结合物就可以测定所有分析物的优点通常超过了需要额外温育和洗涤步骤的缺点，尤其是当使用自动化系统的时候。对于制造商来说，仅需一种抗体结合物是另一个显著的优点。
特别优选用于抗原或抗体结合物的标记系统是酶标记系统，特别是这样一种系统，该系统中，抗原或抗体与酶结合，当有适当的底物存在时，该酶能催化可检测的颜色变化。这种酶联免疫测定法或ELISA法作为商品应用广泛，而且能获得进行这种测定法使用的自动化设备，如微量滴定板，具有专有权的“珠”或者“IMX”(商标)系统，或者使用空心棒或移液管头。也可得到用来处理所得结果的计算机软件。
所用的酶系统已经众所周知，例如可参见Kemeny D.M.&Challacombe S.J.所编的“ELISA and OtherSolid PhaseImmunoassays，Theoretical and Practical Aspects”。
典型的酶系统的例子是那些使用碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或者过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶的系统。
捕获抗体的固相可以是例如小珠或微量滴定板的小孔或小杯，也可以是其它形式，如实的或空心棒或移液管，或者是直径为0.1μm至5mm的颗粒。(不管制作的原料是什么，这种颗粒通常都被称作“乳胶”颗粒。)固相可以是塑料或聚合材料，例如硝化纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙苯、酰胺、聚偏氟乙烯或其它合成的聚合物。另外，颗粒还可以是自然的聚合物，例如乳胶或蛋白质。微量滴定板和小珠被广泛用于血液筛分和临床检验，并作为商品可被广泛购买。
另一种也可使用的固相包括膜、薄片和条带，它们是由有孔的、纤维的或吸水的材料，例如尼龙、聚氯乙烯或其它合成的聚合物，纤维素的自然聚合物，如醋酸纤维素或硝化纤维素类自然聚合物的衍生物，或玻璃纤维制成。纸类如重氮化纸也可使用。吸水的或纤维的材料制成的薄膜和涂层如前所述也可用作固相。
应该理解上述所列固相的例子仅作为例证，本发明并不限于仅使用这些固相。本发明可以在适用于免疫测定的任何固相上实行。
如膜、薄片、条带、薄膜或涂层的固相可被安装进测定多种、更多时候是一种样品的装置。
“测定装置”一词在此表示进行免疫测定的工具，此测定法中包括一个固相，通常为薄层固相，如膜、薄片、条带、涂层、薄膜或其它薄层状物，其上固定有一类或多类免疫球蛋白的抗体。被固定的抗体优选在限定的区域存在，这里称为“抗原捕获区”。
检测装置在坚硬支持物或罩子内安有固相，它也包括检测过程必需的一些或全部的试剂。通常在检测装置中样品应放在预先指定的样品使用区，例如，将样品倒入或滴入该区域，或者将装置中的相关部分在样品中蘸一下。如果样品使用区与抗体捕获区位置不同，装置的安排通常使得样品中的抗体能移至抗体捕获区。然后，所需的试剂再按适当的次序被加入到指定的使用区，该使用区和样品使用区可以相同也可以不同。再者，如果这个或任何一个试剂使用区与抗体捕获区位置不同，则此装置的安排通常使得试剂能转移到抗体捕获区，在此区中任何所形成的抗原-抗体复合物都可被测定。免疫测定所需的全部或一些试剂可以以液体或干燥的形式置于装置内。要是这样的话，装置一般这样安排装置不同部分之间的相互作用使得不同的试剂相互之间以正确的顺序接触以使得免疫测定进行。这种相互作用可以在装置操作中自动发生也可以由装置使用者造成。
免疫测定的文献中描述了大量测定装置。美国专利第4,623,461和4,693,984号中描述了膜装置的例子。根据它们的设计和动作速度，有些测定装置被称为“量尺”，有些被称为“快速测定”装置。“快速装置”一般在加入样品10分钟内就能提供结果。(典型的微量滴定板或小珠检测需要温育步骤，且通常至少需要一小时才能出结果。)因此，尽管测定装置一般比微量滴定板或小珠的测定方式昂贵，但它们在临床检测中有特别的用处，例如在紧急外科手术中需要快速给出结果的时候。
测定装置有一个特别的优点，即它们的使用不需复杂的实验室设备或甚至不需任何实验室设备。因此它们可用来“当场”检验，例如急救室里、医生的外科手术中、药店中或在某些情况下用于家庭检验。对于实验室设备少又相互离得远的地区，此装置特别有用。
如上所述，本发明的联合检测法对于捐献血液的筛分特别有用。因此，该检测法可用于检测至少两种病毒的抗体，这两种病毒选自HIV，如HIV-1、HIV-2和HIV亚型如HIV-1亚型0；HCV；乙型肝炎(核心抗原的抗体)；HTLV，如HTLV-I和HTLV-II；CMV；EBV(EB病毒)；还可以任选检测梅毒。优选两种或多种病毒的组合，这些病毒选自HIV，如HIV-1+2；HCV；HTLV，如HTLV-I+II；以及乙肝核心抗原(HBc)；例如HIV和HCV；HIV和HTLV；HTLV和HCV；HIV、HCV和HTLV；HIV、HCV和HBc；HIV、HTLV和HBc；HTLV、HCV和HBc；HIV、HCV、HTLV和HBc。上述组合中的任一种都可以包括梅毒。该组合的选择受特定国家的规章影响。在某些情况下，还需检测捐献的血液中的其它病原体，例如风疹病原体。
此外，当发现新的致病物时，(新的生物以及已知生物的新亚型)，血液筛分的要求就要重新审查，强制性的检验应扩展到那些病原体。例如，现在在大多数国家对HIV-1和HIV-2都需要检验。最后HIV-1亚型0的发现使得要求测定也必须检出此亚型。因此，所要检出的病原体组合几乎必然会随时间而扩大。本发明包括这种病原体组合的检测。
如使用试管/小珠两部件系统会产生进一步的多用性，例如，将试管和小珠与样品接触后，移走小珠并使之与一种或多种不同种病原体的抗原接触，试管则与不同的抗原或抗原的组合接触。
试管/小珠两部件检测方式进一步变型为将一种或多种抗免疫球蛋白固定于其中一个部件上，将抗乙型肝炎表面抗原(抗HBsAg)固定于另一个部件上。例如，将抗IgG和任选的抗IgM包覆于小试管的内表面，将抗HBsAg包覆于小珠上，反之也可。然后小珠和试管可以同时用于联合的HBsAg/多种抗体的检测，特别是HBsAg、HIV、HCV和从乙型肝炎(核心)、HTLV和梅毒中任选的一种或多种进行进一步检测的分析物。
与HIV-1和HIV-2发生特异性相互作用的肽和多肽已众所周知并有所描述，例如在欧洲专利申请EP-A-0347148中。我们已经发现用合成的HIV肽阻遏带有阻遏剂的半胱氨酸族的巯基特别有用，参见欧洲专利申请EP-A-0307149，可导致被标记的肽，尤其是酶标记的肽，在检测中比相应的未被阻遏的肽具有更大的免疫活性。
用于识别乙型肝炎核心抗体的抗原是核心抗原。不同的乙型肝炎血清型的DNA和预测的蛋白质序列已经被公开，例如Ono等人(1983)在Nuc.Acids.Res11，1747中的描述，同时从公开的序列中可以得到合适的合成和重组的肽和多肽核心抗原。
目前，丙型肝炎看上去还没有一种免疫占优势的抗原决定簇，优选检验一个以上区域的抗体。例如，将包括一个以上抗原决定簇的融合蛋白用作抗原是有利的，如来源于至少一个结构区和至少一个非结构区的氨基酸序列，如英国专利申请GB-A-2,239,245中所描述的。来自核心和外膜区的抗原是优选的结构抗原。非结构抗原可以从例如NS3、NS4和NS5区域中选择。
HTLV抗原可以是例如p21e或gp46重组蛋白质或来自p21e或gp46的肽(例如参见美国专利第4,743,678号)。经纯化的p21e可从Cambridge Biotech Corporation，1600 East Gude Drive，Rockv-ille，Md 20850-5300，U.S.A.获得，gp41可从Repligen Corpora-tion，1 Kendal Square，Building 700，Cambridge，Ma 02139，U.S.A.获得。
为了检测CMV抗体，可使用经纯化培养的CMV核心蛋白质，如p66或重组pp150，它在西方斑(Western blots)中占优势。为了检测EBV抗体，可使用衣壳或早期的抗原。经纯化的苍白密螺旋体抗原可用于检测梅毒抗体。
根据本发明的联合检测法在临床诊断中可用作几种病原体的初步的筛分试验。如果试验为阳性，接着进行每种病原体的独立试验。如果结果为阴性，就无需再进行。总的来说，节约了时间和金钱。这种联合的例子是在许多国家用于怀孕妇女被称为“TORCH”的筛分。与血液筛分要求相似，所研究的病原体组合在各国家之间是不同的，但通常是从风诊、弓形体病、CMV和疱疹中选择。利用经固定的抗IgG和抗IgM抗体的混合物以确保能检测出近期感染是很有利的。
以检测装置方式，特别是“快速检测”装置方式代表的本发明的联合检测法当迫切需要筛分结果，如进行紧急外科手术时，是很有用的。例如，对两种或更多种不同的血液病毒性病原体的快速检测，如果需要特别的警告，应通知外科大夫。这些病原体如上所述，例如HIV-1+2和HBc。
一种对所感兴趣的病原体组合的检测装置是有用的，例如，医生外科手术室的“现场”检测以辅助诊断；而且，总的来说，在临床实验室检测和避免重复进外科手术室方面，该装置都能节约时间和金钱。再者，检测装置对于实验室设备条件不易获得的地区的检测是有用的，例如在农村地区和发展中国家。病原体组合的例子是CMV和HIV、TB(结核杆菌)和HIV。
利用通用的抗体包覆的固相检测大量抗原的多用性在临床检验中得以进一步应用。在临床检验中，该目的通常是识别样品中的病原体。目前，如果大量样品必须用普通的微量滴定板或小珠的方式检验不同种病原体的存在，则通常需准备不同样品的等分试样，并进行一系列检验，每一个检验针对一种不同的病原体。这是因为常规的检验利用抗原包覆的方式捕获病原体的特异性抗体。因此，对于每种抗原有必要利用一种不同的抗原包覆方式，通常是小珠或者微量滴定板。这样就增加了对特殊样品获得结果的时间，也产生了风险，即当所有不同的试验进行时样品的等分试样可能会被放错或混淆。
再者，抗原包覆的工具一般与其它试剂一起以成套的形式出现，如阳性和阴性对照，洗涤液和稀释液。因此使用者必须有许多套不同的工具。
利用本发明的测定法，一个通用的抗体包覆工具和微量滴定板，仅需使用合适的抗原试剂就能同时并分别测定每种大量的病原体。不同的样品系列可以同时被检验，一些是为了检验这种病原体，一些是为了检验另外一种。特别有利的是可同时且分别检验不同病原体的单个样品的等分试样，例如，在微量滴定板的各个小孔中检验每一种等分试样以测定不同的病原体，结果节约了时间和金钱，也减少了由于样品的疏漏或混淆而出错的风险。
因此，本发明也提供了同时但分别测定液体检验样品中两种或更多种不同病原体的特异抗体的方法，该方法包括(i)将每种样品与大量单元中的一个接触，例如在单个的组件中，每个单元包括一个固相，该固相携有被固定的一类或多类免疫球蛋白的抗体，这样每个样品中含有的各类或各类群免疫球蛋白就在固相上被捕获，在组件的所有单元中被固定的抗体是同一类或类群。
(ii)将已经与样品接触的各个单元再与一种抗原接触，此抗原能选择性地与所要研究的一种病原体的特异性抗体结合；每一种抗原以能直接或间接提供可识别标志的方式被提供，和(iii)测定固相上最终形成的免疫球蛋白-抗原复合物。
所用不同单元的数目及其因此而使用的抗原数目是由所研究的病原体数目决定的。每个单元可以是例如微量滴定板的一个小孔或含小珠的一个容器。
可选择地，每个单元尤其是在检验装置中出现时可以是膜、薄片、条带、薄膜或涂层之上的一个限定区域。已经知道某些装置具有从所研究的样品中捕获成分的预定区域。根据本发明的最简单的一种用于同时但各自独立检验的条带检验装置包括，如一条吸水性材料制成的薄带，横跨该薄带的宽度有一个捕获免疫球蛋白的带，这里称为抗体捕获区。此带最好由未被捕获免疫球蛋白包覆的区域分割为多个部分。固定了免疫球蛋白的每一部分可以被认为是抗体捕获区的一个单元。
上述的同时但各自独立的检验所需的检验装置与联合检验是有关系的。
对于制造商和使用者，本发明的检验装置的多用性提供了特殊的便利，此装置可用于不同病原体的同时但各自独立的检测。主要的优点在于一个提供有许多限定的抗体捕获区的装置能与大多数抗原试剂一起被提供用于同时检验一个样品中大量不同的抗体。如前所述，制造商的便利在于对所有的分析物只需制造一种装置，使用者的便利也在于仅需要一种装置，更进一步的优点在于使用者可自由选择需测定的分析物组合。
如上所述，为了研究样品中任何特殊的病原体组合，可以施行本发明的对不同病原体的同时但各自独立的检测。例如，对肝炎病人的样品可以同时被检验甲型肝炎、乙型肝炎的抗-核心抗原的抗体和丙型肝炎病毒(HCV)，对非特异性尿道炎病人的样品可以被检验淋病、衣原体属和念珠菌属。
本发明的同时但各自独立的检验的变型是每个单元不再具有同一类或类群的固定抗体，一个或多个单元上可以具有不同类的固定免疫球蛋白。例如，可提供一套有两个单元的装置，一个单元具有固定的抗-IgG，另一个具有固定的抗-IgM。
将这种两个单元的检验装置用于检验从同一个体得到的样品的特殊抗体的一系列同时检验已进行了一段时间，该检测对于测定早期感染和以后的疾病过程特别有用，尤其是以后的血清转换，如HIV或HCV。一套三单元的装置，一个单元具有固定的抗IgG、一个单元具有固定的抗IgM，第三个单元具有固定的抗IgA，该装置对于检查婴儿是否带有HIV尤其有用婴儿的血液中既有其自身抗体也有来自母方的抗体，因此用常规检验难以确定婴儿是否带有其自身的HIV抗体，该抗体是感染的表征。
利用一种以上抗体的进一步的例子是在很多国家对孕妇进行的所谓“TORCH”试验。病原体选自风疹、弓形体病、CMV和疱疹。选择的组合因国家而不同。风疹检验应包括IgM检测以测定有潜在危险的近期感染。因此，对于涉及风疹的“TORCH”检测，所用的装置中至少一个单元应被包覆抗-IgM。
包括两个或多个单元的组件本身也是本发明的一部分，这些单元带有被固定的抗不同类群免疫球蛋白的抗体。因此，本发明也提供了具有两个或更多单元的组件用于对不同病原体同时但分别地进行检测，这些单元包括被固定的抗免疫球蛋白的抗体，至少一个单元具有已固定抗体直接抗另一单元中被固定的免疫球蛋白中来的不同类免疫球蛋白，例如，一个单元中可有固定的抗IgM，而一个或多个单元中可有固定的IgG。另一方案是组件包括三个单元，一个单元有固定的抗-IgG，一个单元有固定的抗-IgM，第三个单元有固定的抗-IgA。
在检测装置中也可有包括两个或多个单元的组件，例如，安排有两个或多个抗体捕获区，如IgG捕获区和IgM捕获区。这种检测装置可以用作不同病原体的同时但各自独立的测定，如上述的特殊用法的任何一种。
组件可选择性地包括两套或多套单元(每套包括相同的单元)。不同套单元系列可作为一个组件被提供。例如一套单元可以作为微孔条被提供。这种微孔条可以按需要安装于包括两套或多套单元的组件中，例如，一个组件可包括两个微孔条，一个用抗人类-IgG包覆，另一个用抗人类-IgM包覆。第三条带有固定的抗人类-IgA也可被加入。微孔条即成套单元可以按需要安装以形成常规的微量滴定板。例如，板上抗-IgM和抗-IgG所包覆的微孔以行或列交错排列以备随后的血液转换。再者，对制造成本和多用性来说是有利的，尤其是微孔条或类似的成套单元。
除非另外限定，以下描述可应用于本发明的联合测定法和同时但各自分别测定法对临床检验，液体检验样品可以是任何体液，如血液、血浆、血清、唾液、尿液、脑脊髓液、奶液、淋巴液或眼泪。可选择地，固体样品如细胞或组织可以变为液体的形式如组织渗出液用于检验。
对于血液筛分(用联合测定法进行更好)，感兴趣的病原体是所谓的血液病毒性病原体(HIV、乙型肝炎和丙型肝炎，还可任选HTLV、CMV和EBV)和梅毒。对于临床检验，感兴趣的病原体的范围很宽，包括上述有机体和其它的病毒、细菌及其它种类的致病微生物，下述只为了举例，而不作为限制风疹、麻疹、疱疹(单纯的和生殖的)、衣原体属、淋病、甲型肝炎、水痘、流行性腮腺炎、人类细小病毒、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、炭疽芽孢杆菌(抗原/毒素)、放线菌(如链霉菌、诺卡氏菌、红球菌)、伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、幽门卷旋杆菌、空肠弯曲杆菌、鼻疽假单胞菌和假鼻疽假单胞菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)及其亚种、土拉热弗朗西斯氏菌、马尔他布鲁氏菌、肺炎枝原体、问号状钩端螺旋体、疏螺旋体的亚种、苍白密螺旋体、白色念珠菌以及由原生动物病原体所引起的疾病，例如阿米巴病、巴倍虫病、恰加斯氏病、利什曼病、疟疾和弓形虫病。
经固定的抗免疫球蛋白可以是一类或多类，也就是说，可以是IgG类、IgM类和IgA类。如上所提到，IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白，IgM是应答感染产生的第一种免疫球蛋白，因此它比IgG更能提供感染的早期迹象。对于血液检验(血浆或血清)，通常根据检验的目的，IgG或IgM都可以单独使用，或者对于联合测定抗-IgG和抗-IgM的混合物可以在一个单元中使用，或者对于同时但分别的检验，抗-IgG和抗-IgM可以放在不同的单元里。对于唾液检测，也优选捕获IgG和/或IgM。对于尿检验，优选使用抗-IgG，任选与IgM和/或IgA结合。
对于本发明中利用小珠/试管两部件形式的那些检测方式，通过在塑料试管的内表面固定一种或两种抗免疫球蛋白，在试管中使用的小珠上固定一种或两种不同类别的抗免疫球蛋白，可以进一步增加本发明的检测的适用性。例如，可在这两个部件的一个上包覆抗-IgG，另一个包覆抗-IgM。
另外，可以使用结合小珠/试管形式，将试管和小珠与样品接触后，移去小珠将之与一种抗原接触，而试管与另一种抗原接触，以使得在一个样品中进行两种抗体检测。
尽管上面已经描述了血液筛分和临床检验，检测所用的原理或所用材料的类型没有什么不同。血液筛分的特殊分析物范围是由特定的国家管理机关限定的，而且仅由于大量相同的检验使得它比临床检验更加趋向于完全自动化。然而，应当理解整个说明书中除非另有限定，所有描述都大体上与本发明的检测法有关，既包括在检测装置中进行的检测，也包括那些在例如微量滴定板或小珠上进行的检测。
本发明的检测可按常规方法进行，例如参见Kemeny D.M.和Challacombe S.J.所编的“ELISA and Other Solid Phase Immun-oassays Theoretical and Practical Aspect”，免疫球蛋白可以被固定在固相上，例如将固相与适当浓度和pH值的免疫球蛋白溶液接触，如pH范围可为7到11，特别是9到10。优选使用缓冲液，如碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液。如上所述，适当的免疫球蛋白制剂可以买到，而且市售抗体溶液适当的稀释度是，例如，1∶200到1∶4000V/V。
经标记的抗原试剂(结合物)可通过大量方法中的任何一种产生，例如参见Kemeny和Challacombe，loccit，一般使用抗原-酶组合物。
样品可被稀释，例如血液或血浆样品可以对半稀释，如将50μl样品加入微孔中的50μl稀释液中。必须指出所用的任何样品稀释液不能含有所要捕获的那类或那些类人类免疫球蛋白。在以微量滴定板或小珠形式进行的检测中，样品一般接着要与固相一起温育。温育的时间和温度是互相依赖的，温度较低时所需的时间较长。典型的温育条件是37℃下1小时。温育后，滴定板或小珠要彻底洗涤后再与抗原试剂(结合物)一起温育。用于结合阶段的典型的温育条件是37℃下30分钟。与结合物温育后，还有一个洗涤步骤。在ELISA情况下，还需接着与酶的底物一起温育，典型的温育条件也是37℃下30分钟。温育结束时加入反应终止溶液。在ELISA情况下，结果一般是通过阅读分光光度计中每个单元的吸光值来得到的。如果使用另一种标记系统，方法要相应地修改，例如，在放射性免疫测定或者荧光测定中，与放射性标记或荧光标记抗原结合物一起温育后才能得到结果。对于彩色颗粒，通过眼睛就可确定阳性和阴性结果。
在实验室外使用检测装置的情况下，彩色颗粒作为标记物特别有用，因为阳性或阴性结果可由眼睛判定，反应步骤最少。ELISA系统可用作更为灵敏的检测。
本发明也提供了成套装置，该装置包括(a)一种固相，尤其是塑料小珠或微量滴定板，它携有固定的一类或多类免疫球蛋白的抗体，特别是抗-IgG和抗-IgM的抗体混合物，(b)两种或多种抗原试剂，每一种能选择性地与所研究的一种病原体的特异性抗体结合，而且每一种抗原以能直接或间接提供可识别标志的方式被提供，可选择地还包括下述一种或多种(c)阳性和阴性对照试剂、洗涤液和稀释液。
成套装置可以这样提供，或者，抗体包覆部件和抗原试剂部件各自单独被提供。
本发明还提供了适于免疫测定法中使用的固相，其上固定了抗-IgG和抗-IgM的抗体混合物。抗体混合物中还可以包括抗-IgA抗体。这些抗体是特别的抗人类抗体。固相是例如上述固相中的任何一种，如微量滴定板和小珠，也包括那些适用于检测装置的固相。
“检测”和“测定”这两个词用在这里都表明病原体定性、定量和半定量的检验。
利用免疫球蛋白捕获方式测定不同样品中大多数病原体的抗体(“联合检测法”)或者同时但分别测定同一样品的等分试样中大多数不同抗体(“同时测定法”)既省时又省钱。这种方式潜在的多用性在于只需选择抗原试剂，多种病原体就可在一个单元或一系列平行单元中测定，但这种多用性以前并未被意识到。能利用通用的抗体包覆方式，如抗体包覆的微量滴定板，抗体包覆的小珠以及检验装置中经固定的抗体来进行任何抗体检验在实际操作中和经济上很实在的优点是不应被低估的。
当然，要意识到本发明不局限于检测病原体，还可应用于检测所感兴趣的任何抗体，无论引发抗体产生的抗原的性质如何，例如与病原体无关的抗体。引发产生这种抗体的条件的例子包括自身免疫疾病和变态反应如非器官特异性自身免疫疾病，如风湿性关节炎、红斑狼疮和风湿热，和器官特异性自身免疫疾病以及被认为与自身免疫有关的疾病，如甲状腺自身免疫疾病，重度肌无力，自身免疫性溶血性贫血、多发性硬化、口腔溃疡、恶性贫血和溃疡的结肠炎。所需要的一切是一个可特异性地与所感兴趣的任何抗体结合的实体。
因此，应该理解本说明书的学说与检测与病原体无关的抗体和检测病原体的抗体所用的学说是相关的，而且本发明包括所有这些方案。
本发明可用于识别人或动物病原体的测定，既可用于人类，也可用于兽医的应用，包括在肉类贸易中的应用。
下述非限制性实施例阐述了本发明。
实施例试剂下述试剂用于下述检测中1、固相96孔微量滴定板(Nunc)，包覆有多克隆抗人类IgG(DAKO)和多克隆抗人类IgM(DAKO)的混合物。(Nunc产品可从LifeTechnologies，PO BOX 35，Washington Road，Abbotts InchIndustrial Estate，Paisley，Renfrewshire，TA3 4EF，Scotla-nt获得；DAKO产品来自DAKO，16 Manor Courtyard，HughendenAvenue，High Wycombe，Bucks HP3 5RE，England)。
2、与HRP(辣根过氧化物酶)结合的HIV-1重组蛋白质，它包括来源于HIV-1的分离物CBL-1的核心和外周抗原(Sattentau Q.J.等人(1986)Science2341120)(“HIV-1结合物”)。
3、与HRP结合的HIV-2肽，它包括gp36外周抗原(“HIV-2结合物”)。
4、与HRP结合的肝炎核心抗原。
5、阳性样品a)HIV-1，内部参考号4034，于HIV-1阴性血清中稀释。
b)HIV-2，内部参考号91/174，于HIV-2阴性血清中稀释。
c)抗-HBc核心抗原的阳性样品，于HBc阴性血清中稀释。
6、阴性样品从捐献血液中得到的正常人的血清。
方法将100μl稀释的样品(10μl样品和90μl样品稀释液)加入到微量滴定板的小孔中，在37℃的潮湿条件下温育60分钟。然后用洗涤液将小孔彻底洗涤5次，每次洗涤都要将每个孔的内容物吸出移走，将小孔用洗涤液充满((含吐温的甘氨酸硼酸盐缓冲液))，浸泡30秒。最后一次洗涤后，移去小孔中的内容物，将小孔倒置，在擦面纸或薄纸上轻叩至干。将溶于含有牛血清白蛋白和去污剂的HEPES缓冲液中的、50μl相关结合物的工作强度溶液加入小孔中，既可以按下述单独加或组合起来加入，然后将滴定板在37℃的潮湿条件下温育30分钟，如上述进一步洗涤后，将含有TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)和过氧化氢的100μl底物溶液加入到每一个孔中，将滴定板在37℃的潮湿条件下温育30分钟，然后用50μl 2M硫酸终止反应，小孔内的吸光率在450nm处被记录下来，参比波长是690nm。
实施例1各含一种感兴趣的抗体(抗-HIV-1、抗-HIV-2和抗-HBc)的一系列阳性样品根据上述使用HIV-1、HIV-2和HBc结合物的记录被稀释和检验，可以象下表所列的一样单独或以不同的组合进行。HIV-1样品被系列稀释为1/40、1/80、1/160和1/320。HIV-2样品被稀释为1/32、1/64、1/128和1/256。许多不同的HBc阳性样品以1/2稀释。
(i)用下列结合物对稀释度不断增加的HIV-1阳性样品中的每一种进行检验，该结合物是HIV-1HIV-1+HIV-2；HIV-1+HBc；HIV-1+HIV-2+HBc。结果列入表1。
表1
(ii)用下列结合物对稀释度不断增加的HIV-2阳性样品的每一种进行检验，该结合物是HIV-2；HIV-2+HIV-1；HIV-2+HBc；HIV-1+HIV-2+HBc。结果列入表2。
表2
(iii)用下列结合物对六种不同的HBc阳性样品中的每一种进行检验，该结合物是HBc；HBc+HIV-1；HBc+HIV-2；HBc+HIV-1+HIV-2。结果列入表3。
表3
讨论上述表1至表3所列的结果清楚地表明不同的抗原结合物在联合反应中或单独被使用时能有效地识别各自的抗体。当使用两种甚至三种结合物时几乎没什么干扰，只是当使用两种或多种结合物时，所观察到的阴性样品的背景水平有一些轻微的升高。
实施例2用原始的单个样品稀释液制备含HIV-1、HIV-2和HBc抗体的系列样品A到D，如表4所列。
表4
<p>然后用下列抗原结合物对样品A至D的每一种进行检验，该结合物是HIV-1；HIV-2；HBc；HIV-1+HIV-2；HIV-1+HBc；HIV-2+HBc；HIV-1+HIV-2+HBc。结果见表5。
表5
讨论这些结果清楚地表明当有其它抗体存在时，每一种抗体仍可被选择性测定，这就是说，非相关性抗体的存在并不影响相关抗体的测定，而且较低稀释度下测得的结果定性地表明三种特异性抗体的存在，较高稀释度下测得的结果实质上是附加的。
所得结果表明测定两种不同病原体的抗体时，特异性没受损害，同时也表明联合测定的灵敏度非常高。
权利要求
1.一种测定液体检验样品中两种或多种不同病原体的特异性抗体的方法，该方法包括(i)将样品与固相接触，固相上固定有一类或多类免疫球蛋白的抗体，这样样品中存在的各类或类群免疫球蛋白就能被捕获在固相上，(ii)用两种或多种不同的抗原同时或依次接触固相，该固相上从样品来的免疫球蛋白被捕获，每一种抗原能选择性地与所研究的一种病原体的特异性抗体结合，每一种抗原以可以直接或间接提供一种可识别的标志的方式被提供，和(iii)测定固相上最终形成的任何免疫球蛋白-抗原复合物。
2.权利要求1中所述的方法，其中固定的抗体是抗-IgG、抗-IgM或抗-IgA抗体，或是两种或多种此类抗体的混合物。
3.权利要求1中所述的方法，其中抗-IgG和抗-IgM的抗体混合物被固定在固相上。
4.权利要求1至3中任何一个所述的方法，其中固定的抗体是亲和纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
5.权利要求1至4中任何一个所述的方法，其中每一种抗原以能提供一个可识别标志的方式直接被标记。
6.权利要求1至4中任何一个所述的方法，其中可为抗原提供一个可识别标志的方法包括(i)抗体Ab1，它可与该抗原结合，抗体Ab1自身以能提供一个可识别标志的方式被提供或(ii)包括可与该抗原结合的抗体Ab1和第二个能与抗体Ab1结合的抗体Ab2，该抗体Ab2以能提供一个可识别标志的方式被提供。
7.权利要求1至6中任何一个所述的方法，其中所研究的样品是捐献血液的样品。
8.权利要求1至7中任何一个所述的方法，其中所研究的两种或多种病原体选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HTLV、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒。
9.权利要求1至7中任何一个所述的方法，其中所研究的两种或多种病原体选自风疹、麻疹、疱疹(单纯的和生殖的)、衣原体属、淋病、甲型肝炎、水痘、流行性腮腺炎、人类细小病毒、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、炭疽芽孢杆菌(抗原/毒素)、放线菌、伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、幽门卷旋杆菌、空肠弯曲杆菌、鼻疽假单胞菌和假鼻疽假单胞菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)及其亚种、土拉热弗朗西斯氏菌、马尔他布鲁氏菌、肺炎枝原体、问号状钩端螺旋体、疏螺旋体的亚种、苍白密螺旋体、白色念珠菌以及由原生动物病原体所引起的疾病。
10.权利要求1至8中任何一个所述的方法，其中所研究的两种或多种病原体选自风疹、弓形体病、巨细胞病毒和庖疹病毒。
11.一种同时但各自独立的测定液体试样中两种或多种不同病原体的单个特异性抗体的方法，包括(i)将每个样品与单个组件中的大量单元中的一个接触，每个单元包括一种固相，其上固定有一类或多类免疫球蛋白的抗体，这样每个样品中存在的各类或类群免疫球蛋白就可被固相捕获，在组件的所有单元中，被固定的抗体属同一类或类群。(ii)将已与样品接触的组件中的每个单元再与抗原接触，此抗原能选择性地与所研究的一种病原体的特异性抗体结合，每种抗原以能直接或间接提供一种可识别标志的方式被提供，和(iii)测定固相上最终形成的任何免疫球蛋白-抗原复合物。
12.权利要求11所述的方法，其中至少一个单元包括固定有抗-IgG抗体的固相，至少一个单元包括固定有抗-IgM抗体的固相和，任选地，至少一个单元包括固定有抗-IgA抗体的固相。
13.权利要求11或12所述的方法，其中所研究的样品是单个样品的等分试样。
14.权利要求1至13的任何一个所述的方法，其中固相包括小珠、或微量滴定板上的孔或杯，或实心或空心棒或移液管，或颗粒；或包括有孔的、吸水的或纤维的材料制成的膜、薄片、条带、薄膜或涂层，任选地安置在检验装置中。
15.用于不同病原体同时但各自独立的检测的包括两个或多个单元的一种组件，该单元包括固定的抗免疫球蛋白抗体，至少一个单元带有已固定的抗体，该抗体直接抗一种与另外单元中固定的免疫球蛋白不同类的免疫球蛋白。
16.权利要求15所述的一种组件，该组件包括一个带有固定的抗-IgM的单元和一个或多个带有固定的IgG的单元。
17.权利要求15所述的组件，该组件包括三个单元，一个单元具有固定的抗-IgG，一个具有固定的抗-IgM和第三个单元具有固定的抗-IgA。
18.免疫测定法中适用的固相，其上固定有抗-IgG和抗-IgM的抗体混合物。
19.权利要求18中所述的固相，其上也固定有抗-IgA抗体。
20.权利要求18或权利要求19中所述的固相，该固相包括小珠，或微量滴定板的孔或杯，或实心或空心棒或移液管，或颗粒；或包括由有孔的、吸水的或纤维的材料制成的膜、薄片、条、薄膜或涂层，任选地安置在检测装置中。
21.一种测定液体试样中两种或多种不同病原体的特异性抗体的方法，该方法包括(i)将样品与固相接触，固相上固定有一类或多类免疫球蛋白的抗体，这样样品中存在的各类或类群免疫球蛋白就可在固相上被捕获。(ii)将两种或多种不同的抗原同时或依次与固相接触，该固相上已经捕获了样品中的免疫球蛋白，每一种抗原能选择性地与所研究的一种病原体的特异性抗体结合，每种抗原以能直接或间接提供可识别标志的方式被提供，和(iii)测定固相上最终形成的任何免疫球蛋白-抗原复合物。
22.一种同时但各自独立地测定液体试样中两种或多种不同抗原的特异性抗体的方法，该方法包括(i)将每一样品与单个组件中的大量单元中的一个接触，每一单元包括固定有一类或多类免疫球蛋白抗体的固相，这样，每个样品中存在的各类或类群免疫球蛋白就可在固相上被捕获，在组件的所有单元中，固定的抗体属于同一类或类群，(ii)将已与样品接触的组件的每个单元与抗原接触，此抗原能选择性地与所研究的一种病原体的特异性抗体结合，每种抗原以能直接或间接提供一种可识别标志的方式被提供，和(iii)测定固相上最终形成的任何免疫球蛋白-抗原复合物。
23.权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所研究的抗体是非病原体相关性抗体。
24.权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所研究的抗体是自身免疫性抗体或与变态反应有关的抗体。
25.权利要求21至24中所述的任何一个方法，该方法具有权利要求2至6、11和12中的任何一个所限定的参数。
全文摘要
本发明涉及一种测定液体试样中两种或多种不同病原体抗体的方法，该方法包括在固定有抗一类或多类免疫球蛋白抗体，尤其是抗-IgG和抗-IgG抗体混合物的固相上捕获抗体，以及测定所捕获的任何抗体。该方法可用于测定其它非交叉反应性抗体，也可以用于不同病原体的抗体的同时但各自独立的测定。
文档编号G01N33/576GK1105181SQ94190200
公开日1995年7月12日 申请日期1994年4月14日 优先权日1993年4月14日
发明者理查德·J·S·邓肯, 厄苏拉·贝克福德 申请人:国际莫莱斯技术公司