专利名称：一种双功能层析材料及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域。
亲和层析技术是一种根据生物分子的生物学特性和化学结构进行分离纯化的技术，即将一种与被分离物质具有特异性吸附的配基通过直接或间接的方法与载体结合制成亲和吸附剂，用于分离纯化某种酶或蛋白质。疏水层析技术是根据生物分子表面疏水性不同进行分离纯化的方法。
苯酚和环氧氯丙烷在特定条件下的反应产物与琼脂糖(如Sepharose)交联，即可制得一种具有疏水作用的层析材料(如Phenyl Sepharose，Pharmacia公司产品)。
苯扎嘧啶(Benzamidine)通过6-氨基正己酸与琼脂糖交联，即可制得一种亲和层析材料(如Benzamidine SepharoseCL，Pharmacia公司产品)。
上述两种层析材料为现有产品，但分别作为一种层析材料在对多组份生物物质的分离纯化中其特异性和选择性均具有局限。
本发明的目的在于针对上述缺陷，提出一种双功能层析材料和制备方法，以及采用该层析材料去除尿胰蛋白酶抑制剂中人尿激肽释放酶和纯化激肽释放酶的方法。
本发明的双功能层析材料，满足下列结构要求 这里X＝C6H5_
Y＝_NHC6H5C(NH)NH2R代表一种基质材料，包括各种类型的琼脂糖。
本发明的双功能层析材料的制备方法如下1，环氧化合物的合成取苯酚和环氧氯丙烷在碱性条件下回流，使其充分反应，去除水层，减压蒸馏得到1，2-环氧-3-苯氧基丙烷；2，苯基-载体交联复合物的制备任何不溶于水的基质材料均可作为载体材料，最好采用琼脂糖胶(如琼脂糖2B、琼脂糖4B或琼脂糖6B)，将载体与适量1，2-环氧-3-苯氧基丙烷在室温条件下直接交联制得苯基-载体复合物；3，苯基-载体-苯扎嘧啶交联复合物的制备将苯基-载体复合物用溴化氰或其他激活剂活化，分别加入6-氨基正已酸和对氨基苯扎嘧啶盐酸盐，制得苯扎嘧啶双功能层析材料。
采用本发明双功能层析材料，根据在特定条件下对人尿激肽释放酶的吸附作用，可成功去除尿胰蛋白酶抑制剂中人尿激肽释放酶；并在一定的PH和离子强度条件下进行洗脱，纯化出人尿激肽释放酶。
实施实例I1.环氧化合物的合成取376克苯酚和748克环氧氯丙烷，置2000ml装有回流冷凝管、滴液漏斗的三颈圆底烧瓶中，加热回流并滴加20％氢氧化钠溶液600克，回流2小时，放冷。倒入分液漏斗分去水层，有机层用200ml蒸馏水(加20％氢氧化钠溶液1.0ml)分三次洗涤，除去水层，再加50ml乙醚振摇加速分层。有机层再用100ml蒸馏水分二次洗涤，去除水层，有机层再加入150克无水硫酸钠吸收残余水份。将有机层倒入减压蒸馏装置中，在5mmHg条件下减压蒸馏收集沸点在110℃左右的馏分液。制得1，2-环氧-3苯氧基丙烷。
反应方程式
2.苯基-载体交联复合物的制备取约3000ml沉淀体积的琼脂糖4B(Spharose 4B，Pharmacia公司产品)，用沙芯漏斗抽滤，用0.5mol/L氯化钠溶液洗涤，再用大量蒸馏水冲洗，除去其中的保护剂和防腐剂。加入2000ml的1mol/L的氢氧化钠、240ml的1，2-环氧-3-苯氧苯丙烷和3克四氢硼钠在室温(30℃)下搅拌至少12小时。再加热至50℃，加入3克的四氢硼钠搅拌5小时。反应完毕后抽滤，加蒸馏水洗涤。置95％乙醇中浸泡12小时，过滤，保存在95％乙醇中。制得苯基—琼脂糖4B复合物。
反应方程式
其中HO-R-OH代表载体琼脂糖4B
3.苯基-载体-苯扎嘧啶交联复合物的制备取1000ml沉淀体积的苯基-琼脂糖4B交联复合物。抽滤，用水洗涤三次，加600ml水和100克溴化氰置冰盐浴(-10℃)中滴加2mol/L氢氧化钠溶液，使pH值保持在11.0～11.5之间10分钟后移至室温旋转10分钟后倒入沙芯漏斗中，立即用冷0.1mol/L碳酸氢钠(pH9.5)缓冲溶液抽洗，在2～3分钟内洗下5000～6000ml体积的缓冲溶液，终止活化。
加500ml蒸馏水和100克6-氨基正己酸，调节pH值至9.5搅拌24小时后，抽滤加水洗涤。再加入500ml蒸馏水和4克对氨基苯扎嘧啶盐酸盐调节pH至4.5，加入50克EDC混匀，置室温下搅拌12小时以上。抽滤加水洗涤，置95％乙醇中保存备用。制得苯基-琼脂糖4B-苯扎嘧啶复合物。
反应方程式 (3)M-O-R-OC(NH)NH(CH2)5COOH+H2N-C6H5-C(NH)NH2*HCL—→ 其中HO-R-OH代表载体琼脂糖4BM代表C6H5-OCH2CH(OH)CH2-
实施实例II重复实施实例I，用琼脂糖2B(Sepharose 2B，Pharmacia公司产品)代替琼脂糖4B同样操作，制得苯基-琼脂糖2B-苯扎嘧啶复合物。
实施实例III重复实施实例I，用琼脂糖6B(Sepharose 6B，Pharmacia公司产品)代替琼脂糖4B同样操作，制得苯基-琼脂糖6B-苯扎嘧啶复合物。
实施实例IV1.柱层析分别取采用上述实施实例制备的双功能层析材料各1000ml。事先用0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH8.0)平衡柱床。另取尿胰蛋白酶抑制剂(比活力2500U/mg)制成浓度为100000U/ml的溶液(pH8.0)冲洗柱床，激肽释放酶被吸附尿胰蛋白酶抑制剂则随溶液流出，收集流出液。
2.激肽释放酶测定(1)激肽释放酶的测定方法采用发色底物S-2266测定法[入江章子等，临床药理(日本)29，419，(1981)]。
取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH8.0)500ul，37℃保温5～10分钟，另取检品溶液(样品溶液调节pH至8.0并稀释至1倍)400ul，混合37℃保温2～5分钟后加底物溶液[25mgS-2266(日本第一化学制药株式会社产品)加28.8ml的蒸馏水溶解]混合37℃保温30分钟，再加50％醋酸终止反应。另取含抑肽酶10000～50000IU/L的0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH8.0)代替0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH8.0)同样操作，作为空白对照在波长405nm处测定吸收度(A)，按下式计算出激肽释放酶的含量激肽释放酶的含量(mU/ml)＝A×9.55(2)按上述方法测定尿胰蛋白酶抑制剂中经柱层析前后激肽释放酶(Kalikrein)的含量，测定结果见表一表一
实施实例V1.激肽释放酶的纯化接实施实例IV，将吸附有激肽释放酶的层析柱用0.1mol/L的碳酸钠缓冲溶液(含0.5mol/L的氯化钠)pH10.0洗脱，收集洗脱峰。用高效液相色谱分析，分析激肽释放酶的纯度。
2.高效液相色谱分析
色谱条件贝克曼高效液相色谱仪色谱柱Tskgel 3000SW，7.5*600mm(贝克曼公司产品)流动项0.1mol/L磷酸二氢钠溶液检测波长280mm流速0.6ml/min进 样 量10ul本方法为凝胶色谱法，是根据样品分子量的大小和其空间构象来进行分离。在流动项的作用下样品中不同分子量的成份依次分开，分子量大的先流出。通过检测器即可检测出样品的组成和纯度。
经检测采用该双功能层析纯化的激肽释放酶，高效液相色谱分析凝胶色谱纯度均超过80％，说明采用该柱层材料可达到分离纯化激肽释放酶的效果。
权利要求
1.一种双功能层析材料，其特征在于满足下列结构要求 这里X＝C6H5_Y＝_NHC6H5C(NH)NH2R代表一种基质材料，包括各种类型的琼脂糖。
2.一种双功能层析材料的制备方法，其特征在于1，环氧化合物的合成，取苯酚和环氧氯丙烷在碱性条件下回流，使其充分反应，去除水层，减压蒸馏得到1，2-环氧-3-苯氧基丙烷；2，苯基-载体交联复合物的制备，取任何不溶于水的基质材料作为载体材料，如各类玉脂糖，将载体与适量1，2-环氧-3-苯氧基丙烷在室温条件下直接交联制得苯基-载体复合物；3，苯基-载体-苯扎嘧啶交联复合物的制备，将苯基-载体复合物用溴化氰或其他激活剂活化，分别加入6-氨基正已酸和对氨基苯扎嘧啶盐酸盐，制得苯扎嘧啶双功能层析材料。
3.一种双功能层析材料的应用，其特征在于用双功能层析材料装柱，加入尿胰蛋白酶抑制剂，调节PH至8.0，用磷酸缓冲液(PH8.0)冲洗柱床，激肽释放酶被吸附，尿胰蛋白酸则随液流出。
4.根据权利要求3所述的双功能层析材料的应用，其特征在于将吸附有激肽释放酶的层柱析用0.1mol/L的磷酸钠缓冲液(含0.5mol/L的氯化钠)PH10.0洗脱，收集洗脱峰，即得纯化的激肽释放酶。
全文摘要
一种双功能层析材料，其结构要求
文档编号G01N33/50GK1142984SQ9511425
公开日1997年2月19日 申请日期1995年12月4日 优先权日1995年12月4日
发明者傅和亮, 谢永立, 何栏, 巫锦娣, 郑少亮 申请人:广州市博普生物技术有限公司, 广东天普生物化学制药有限公司