专利名称：一种快速检测伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的方法
技术领域：
本发明涉及一种病原微生物抗原的检测方法，特别是一种伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的检测方法。
伤寒是发展中国家经消化道传播的常见病、多发病，其发病率可达10万分之540。在我国大部分地区，全年都有伤害病的散发及流行。伤寒病是内科、传染科发热原因待查病人的鉴别诊断必需排除的疾病之一，而现行对于伤塞病的病原检验方法仍为传统的伤寒菌培养及肥达氏反应。由于现有的伤寒病人的细菌培养的阳性率不足50％，且耗时5-7天；而肥达氏反应的突出问题则是早期阳性率不高，在流行区，单份标本的效价的诊断意义不够明确，需依恢复期的效价判断，实际上只有回顾诊断价值，且假阳性率高达18％。在临床医疗及卫生防疫工作中，都亟需快速、敏感的伤寒病原抗原的检测方法，以早期发现伤寒病人并对其进行隔离治疗。目前，虽有间接血凝试验，对流免疫电泳、乳胶凝集试验等免疫学方法用于伤寒的病原检测，但都不具有实用价值。
本发明的目的在于给临床医生及卫生防疫人员提供一种具有实用价值，能早期发现伤寒病人的伤寒病原抗原的快速检测方法。
本发明的技术方案如下1、以伤寒沙门氏菌鞭毛抗原作为建立检测系统的靶抗原。提取并经SDS-PAGE及免疫学方法鉴定，得到纯的鞭毛抗原。
2、用淋巴细胞杂交瘤技术，制备鞭毛抗原的单克隆抗体。
3、建立可定量检测血清中可溶性伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的双抗体夹心酶标法。其具体步骤如下经棋盘滴定试验，双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)的最优条件为三株单克隆抗体用PH9.60.05M的碳酸缓冲液稀释成50微克/毫升，100微升/孔，加于耐康(NUNC)条板4℃过夜10％白明胶150微升/孔，37℃2小时封闭，磷酸缓冲液(PBST)洗三遍，真空抽干，封口后4℃保存。待检血清加100微升，37℃1小时，磷酸缓冲液洗三遍。加酶标记的鼠单克隆抗体2H4及3A6，1∶100稀释，100微升/孔，37℃1小时，磷酸缓冲液洗三遍，加邻苯二胺(OPD)为底物，37℃25分钟，2M硫酸(H2SO4)终止，490纳米(nm)测吸光值(OD)，得出检验结果。
本发明的优点和效果如下1、利用本发明建立可定量检测血清中可溶性伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的双抗体夹心酶标法，灵敏度可达0.078ug/ml，批内及批间差异分别为4.9％和6.9％，具有良好的重复性及特异性。
2、对34例血培养阳性的伤寒病人血样的检测，32例阳性，符合率达94％。
3、利用本发明的方法，从加样到判读实验结果仅需2.5小时，而血培养为1周，肥达氏反应为48小时。
4、利用本发明的方法，可在发热原因待查病人就诊当天作出伤寒的甄别，适用于早期、快速检出伤寒病人。
实施例本检测方法是通过一个检测伤寒沙门氏菌鞭毛抗原试剂盒来实现的。该试剂盒的组成及操作方法如下
一、试剂盒的组成1、抗H-d包被干板条(12孔×4条)2、酶标抗体 150微升3、酶标抗体稀释液 10毫升4、阴性对照 1毫升5、阳性对照 1毫升6、空白对照 1毫升7、底物液A1瓶8、底物液B1瓶9、终止液(2MH2SO4)6毫升10、浓缩洗液(使用前用蒸馏水20倍稀释) 50毫升二、操作方法1、按需检测的例数取出微孔条，室温置15分钟后撕去封口胶纸，固定于支架上，编号。
2、加待检血清100微升，每次检测均需设空白对照、阴性对照、阳性对照，用封口胶封口，37℃，45分钟。
3、将浓缩洗液用蒸馏水20倍稀释，洗板三次，拍干。
4、取酶标抗体用稀释液1∶100稀释，混匀，每孔加100微升，(空白对照孔除外)，用封口胶封口，37℃，45分钟。
5、洗板5次，拍干。
6、每孔滴底物A、B各1滴，37℃，10分钟。
7、加终止液，每孔1滴，混匀。
三、结果判断1、目测将酶板反应板置于白纸板上观察，无色透明孔为阴性，呈明显橙色孔为阳性。
2、测光判读490nm测OD，用空白对照孔调零，阳性对照孔OD应大于0.600，阴性对照孔OD若小于0.06，以0.06计。
S/N＞2.1为阳性
权利要求
1.一种快速检测伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的方法，其特征在于(1)以伤寒沙门氏菌鞭毛抗原作为建立检测系统的靶抗原，提取并经SDS-PAGE及免疫学方法鉴定，得到纯的鞭毛抗原；(2)用淋巴细胞杂交瘤技术，制备鞭毛抗原的单克隆抗体；(3)建立可定量检测血清中可溶伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的双抗体夹心酶标法，其步骤如下经棋盘滴定试验，双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)的最优条件为三株单克隆抗体用PH9.60.05M的碳酸缓冲液稀释成50微克/毫升，100微升/孔，加以耐康(NUNC)条板4℃过夜，10％白明胶150微克/毫升，37℃2小时封闭，磷酸缓冲液(PBST)冲洗，真空抽干，封口后4℃保存。待检血清加100微升，37℃1小时，磷酸缓冲液冲洗。加酶标记的鼠单克隆抗体2H4及3A6，1∶100稀释，100微升/孔，37℃1小时，磷酸缓冲液冲洗，加邻苯二胺(OPD)为底物，37℃25分钟，2M硫酸(H2SO4)终止，490纳米(nm)测吸光值(OD)，得出检验结果。
全文摘要
一种伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的速测法，以伤寒沙门氏菌鞭毛抗原作为建立检测系统的靶抗原，用淋巴细胞杂交瘤技术制备鞭毛抗原的单克隆抗体，并通过双抗体夹心酶标法得出检验结果，符合率可达94％，从加样到判读实验结果仅需2.5小时，利用本法可在发热原因待查病人就诊当天，作出伤寒的甄别，适用于早期快速检出伤寒病人。
文档编号G01N33/53GK1156826SQ9610268
公开日1997年8月13日 申请日期1996年2月6日 优先权日1996年2月6日
发明者马义跃 申请人:广州市第八人民医院