专利名称：用拉曼散射测定过氧化氢的方法和仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定过氧化氢的方法，用于一种市场上可买得到的含有过氧化氢的水溶液或其他含有过氧化氢的物质，或在过氧化氢的形成中，或者在酶催化等化学反应中的分散体系中进行质量控制，以及采用此种方法的仪器。
现有技术中，测定水溶液中过氧化氢采用下面方法(1)采用过氧化氢电极方法。
(2)感色(Leuco)或氧化缩合型分光光度法(参见日本专利公开公报号59-182361(1984))，该方法适用于过氧化氢和4-氨基安替比村和苯酚进行有色反应，并测量带有颜色的反应溶液在505nm处的吸收。
(3)荧光方法，适用于过氧化氢和高香草酸反应生成荧光，并测量该荧光。
(4)化学发光法，适用于在POD(过氧化物酶)等催化剂存在下由过氧化氢的氧化力激发鲁米诺或光泽精的基质，测量当上述基质从激发态返回基态时发出的光。
另一方面，所谓的拉曼散射分析包括在光分析方法中。拉曼散射分析方法采用了下面的现象当特定分子被电磁波的辐射性照射时，捕捉光子的少部分分子不再返回原来的振动能级而在释放了捕捉到的光子后落到那些带有不同电子的基态。因此，这些分子释放出的能是特定的，这些特定的分子就可以通过检测作为电磁波释放出的能量来确定。
当拉曼散射释放出的能量射束可能处在比吸收的能量低的状态(斯托克司拉曼散射)或高的状态(反斯托克司拉曼散射)，由于激发态的电子数远远少于基态电子数，反斯托克司拉曼散射非常弱。因此，判定特定分子的方法常常是通过斯托克司散射测量来进行的。
然而，尽管有关于在气相测定过氧化氢的拉曼散射的报导(参见拉曼光谱杂志2(1974)，PP.125-132)，对于水溶液中的过氧化氢的定量或定性分析没有任何例子见诸报导。根据上述报导如果拉曼光谱中能观察到3607cm-1，1393.5cm-1和863.1cm-1三个弱峰，则它们适合于检测过氧化氢的-O-O-键。此拉曼光谱用于气相过氧化氢的结构分析。而由于上述″拉曼光谱杂志″所述的检测器的灵敏度不高，不能进行定量测量。
上述测定样品溶液中过氧化氢的方法(1)到(4)存在以下问题方法(1)适合于测量过氧化氢被电氧化时带来的电流变化，因此样品溶液中共存的还原物质会造成影响。
在感色(Leuco)型分光光度测定法(2)时，误差容易来自于发色团自然氧化造成的试剂空白带色。另一方面，氧化缩合型分光光度法(2)中，负误差容易来自于还原性物质。而且，2摩尔的氢氧化物只形成1摩尔色料，因此此方法不适于低含量的测定。
在荧光法(3)中，灵敏度非常依赖于仪器的性能。因此，此方法受温度和共存物质影响很大。
在化学发光法(4)中，只有在碱性条件下，才能获得足量的发射光。反应速率慢并且重现性不够。而且，蛋白质共存造成发光强度下降。
过氧化氢气相拉曼散射测量实例是针对结构分析，不能确定过氧化氢的浓度。即使争取进行过氧化氢在水溶液中的-O-O-键的检测，由于水的氢键作用使得过氧化氢在水溶液中的性能发生变化，因此检测很困难。以上为采用方法(1)到(4)中任一个对过氧化氢进行检测的情况。
本发明的目的是通过光分析机构使得可以对水溶液中的过氧化氢进行简单定量分析。
根据本发明，将样品溶液装入一样品池，用一单波长激发光束照射，样品溶液的散射光按其光谱成分分开，使得通过一拉曼散射峰能进行测量，在上述峰处，它的光谱波数与上述激发光波长的偏离是在800到920cm-1之间。
按经典的解释，当过氧化氢上出现相干光，过氧化氢由于内部振动极化，产生特定的角振动，该角振动产生一光谱。按量子机理解释，当相干光照射过氧化氢分子时，捕捉了光子的少量特定的分子释放光子后不返回原来的能级而落入带不同电子的基态。也就是说，由于光子的能量，使得振动激发态能量变化，或者由于处于振动激发态的过氧化氢分子变到邻近的振动能级而释放出振动能。鉴定和检测过氧化氢就是通过将此时产生的光谱按其光谱成分分开来进行的。
按此方法，任意形态的电磁波的辐射能光束(尤其是激光束等相干光)的光能来辐照过氧化氢分子，产生的散射光按光谱成分分开。通过光谱中特定的波长出现的峰来鉴定和测量过氧化氢。已知这种方法得到的过氧化氢光谱的波数偏离在800到920cm-1之间(即拉曼散射波数偏离)。本发明中的这种方法可以通过此峰检测过氧化氢。
本发明所述方法的新颖和有益之处在于可以直接确定过氧化氢分子。由于没有通过过氧化氢的氧化能或还原能和一发光物质反应的第二次操作，本发明不同于现有技术，没有反应误差。
一种进行上述方法的测量仪器，包括一个带反射内表面的整个球形池托，一个有球形部分的池，放在上述池托内，该池用于贮存样品溶液，一个对池托内池中的样品以某一单波长激发光束辐照的光源部分，和一光谱探测器，该探测器用于接收位于池托中池内的样品溶液发出的散射光并按其光谱成分将其分开的测定过氧化氢的拉曼散射光强。
球形池装在整个球池托内，该池托有一反射内表面，因此激发光束被多路反射进样品池，使得拉曼散射加强。
本发明所述方法不仅可以用于已含有过氧化氢样品的水溶液的检测，而且可以用于监控形成或分散过氧化氢的酶反应的反应体系。
在第一个例子中，本发明的方法用于由氧化性酶和生物或代谢成分之间的特定反应形成过氧化氢的反应体系。假设S代表被酶作用物(基质)，P代表产物和E为酶，下列反应中形成的过氧化氢的量由本发明中所述方法测量。被酶作用物S和产物P的量可以通过对过氧化氢的量的测量获得。而且，从测得的过氧化氢的量也可以测定酶的活性。
被酶作用物S和酶E的组合的典型例子为葡萄糖和葡萄糖氧化酶，胆甾醇和胆甾醇氧化酶，尿素和尿酸酶，丙酮酸和丙酮酸氧化酶，己糖和吡喃糖氧化酶，这些组合不局限于形成过氧化氢的酶(催化)反应。
采用本发明的方法用于测量过氧化氢的第二个例子是通过一专门和过氧化氢反应或分解之的酶进行反应的情况。假设，PH2为一反应物，P为产物，E为酶，通过测量下面酶反应中还原的过氧化氢的量可以测得反应物PH2或产物P的量。而且通过测量还原了的过氧化氢的量还可以测得酶的活性。
当所说酶是过氧化物酶或过氧化氢酶等脱氢酶时，本发明也适用于涉及到另一种与过氧化氢的共轭反应的酶的反应。
首先用一种和过氧化氢有反应活性的化合物如过氧化物酶或过氧化氢酶等化合物来标记反应剂，然后将它与定量的过氧化氢反应，从被还原的过氧化氢量来判断反应剂的量。例如，测定一种抗体的量是通过将用过氧化物酶标记的反-抗体和一抗原-抗体反应组合反应，进行BF分离，将来和抗原-抗体反应组合反应的已标记的反-抗体与已反应的部分分离并移去，此后用和过氧化氢反应了的过氧化物酶，来测量过氧化氢还原的量来实现的。抗原或抗体，或抗体或反-抗体都可能标记。此抗原-抗体反应对本领域技术人员来说是周知的，而且进行抗原-抗体反应的方法不受限制。
按照本发明，过氧化氢的浓度通过用激发光束来照射样品溶液，根据拉曼散射光的波数偏离为800到920cm-1的峰的强度来测定，因此可以直接测定过氧化氢而不必经过由过氧化氢的氧化性或还原性与一发光物质反应的第二步操作，不同于已有技术，因此该反应带来的误差也降低了。
绝大多数酶反应产生过氧化氢。虽然一般来说都是用一成色剂来监视酶反应，本发明的方法直接监视酶反应不用任何成色剂。
结合附图以及下文的详细说明使本发明的上述以及其他目的，特点，情形及优点将变得更清楚了。
图1是本发明中过氧化氢测定仪的简要方框图；图2A和2B分别是仪器中池部分收集180°加强的散射和90°加强的散射的剖面图；图3为用过氧化氢浓度从0到30％的标准样品测得的拉曼光谱图；图4为通过图3中的峰得到的过氧化氢标准曲线图；图5为一种市场上可买得到的隐形眼镜清洗液的拉曼光谱图；图6为图5中测得结果转化成图4那种标准曲线图；图7为一种市场上可买得到的过氧化物消毒液的拉曼光谱图；图8为图7测得结果转化成图4那种标准曲线图。
图1为按本发明一实施例的用于测定过氧化氢的测量仪。
数字1代表了用于测量拉曼散射光的激发光源，由一激光器元件一灯组成。激光器元件可以从连续振动的Ar(氩)离子，Kr(氪)离子，氦-氖，氦-镉和钕钇铝石榴石激光器元件，半导体激光器元件，脉冲激光器元件等有从近紫外到近红外区宽波长范围的激光器元件中选择。当只用激光器元件的一振动光束作为激发光束，该激光器元件可以加上一干扰滤光片或一单色器，以防止自然发射。然而，自然发射也可能用于光谱的波长校正。当用氙灯等灯作为光源，用做激发光束的单一波长是从用一滤光片或单色器等波长选择装置的灯的发射中选出的。
从光源1发出的激发光由一带光束分离设备的调整光路的光学系统2分成测量光束10S和参比光束10r，测量光束10s作用于贮存在池3的一样品上。样品所产生的拉曼散射光经过一用来调整光通量的调整散射光路的光学系统4和和经过一用来除去来自散射光的激发光束的如滤光片等的波长选择器5而由光谱检测器6进行检测。
另一方面，为校正激发光束强度的波动，参比光束10r经由一带有与滤光片和测量光一边的波长选择器5同样特性的波长选择器的波长选择器9，和一调节光路的光系统，由光谱检测器6进行检测。
控制器7控制光谱检测器6的分光镜操作，并用检测到的指示光源强度的参比光束值校正由光谱检测器6检测的拉曼散射光值以得到相应的拉曼光谱来测定过氧化氢。数字8代表了打印机或CRT等输出元件。
图2A和2B分别为池3的实例。
参见图2A，贮存样品溶液的池3是由玻璃，石英，或聚乙烯对苯二酸酯等透明材料制成的圆底烧瓶。该池3装在整个球形池托10a中。该池托10a有一反光内表面。池托10a上有一窗用于接收激发光源发出的激发光束12并从与入射方向成180°的方向收集散射光。激发光束12经由反光镜14折射由池托10a的窗进入池3。数字16代表一将从池托10a的窗发出的散射光聚光的聚光镜。反光镜14安放在聚光镜16的光轴上，它和聚光镜16的镜径相比小得不会妨碍聚光镜16对散射光的聚光。照射到池3中的样品溶液的激发光束被池托10a的内表面反复反射之后，从池托10a的窗收集拉曼散射光并射向光谱检测器。
另一方面，见图2B所示，一池托10b的窗从相对于激发光12入射方向成90°的方向收集散射光。池3装在有反光内表面的整个球形池托10b中，该池托10b带有从Y方向引入激发光束12的窗和从与Y方向成90°角的X方向收集散射光18的窗。
再参见图1，从池3收集的散射光经光学。系统4聚光，波长选择器5从散射光中滤去激发光束成分，拉曼散射光按其光谱成分分开，并由光谱检测器6检测。光谱检测器6根据参比光束强度校正信号并放大，信号输入控制器7对检测到的过氧化氢的峰进行运算处理。数字运算等处理用于检测和确定过氧化氢的特征峰。
下面说明采用图1所示测量仪器的实例。激发光源1包括一个100mW输出的氩激光器，用其514.5nm的振动光束，采用图2B所示的池3和带有一帕尔帖控制的CCD(电荷耦合装置)检测元件作为光谱检测器6的紫外/可见分光光度计进行测量。
(校准曲线的形成)-30％的标准过氧化氢试剂(由Santoku化学工业有限公司出品的批号为3018930428的试剂)用蒸馏水稀释成浓度分别为15％，10％，5％，3％，1％和0.5％的过氧化氢标准样品，并测量这些标准样品及水的拉曼散射光级。得到的拉曼光谱见图3。参见图3，水的光谱作为本底从各标准样品中扣除。观察到的峰相对于激发光束波长的位置偏离878.8cm-1。
图4为过氧化氢的校准曲线，其纵坐标为在878.8cm-1处峰强度级，横坐标为浓度。
(样品测量)然后，通过该校准曲线来测定市场上可买得到的过氧化氢溶液。
(1)对市场上可买得到的隐形眼镜清洗液的测量用与形成上述校准曲线的测量相同的方法来测量一种市场上可买得到的隐性眼镜清洗液(由Barndshaind有限公司进口的(商品名)为ConseP F的清洗液)(由指示浓度计算为2.98％)，所得到的拉曼光谱见图5。在此拉曼光谱中，从样品光谱中扣去作为本底的蒸馏水的光谱。图6说明了由图4的标准曲线得到的拉曼波数偏离为878.8cm-1的光谱峰强度。由此结果估计出的过氧化氢为3.13％。
(2)市场上可买得到的过氧化物消毒液的测量。
用与形成校准曲线的测量相似的方法测量市场上可买得到的过氧化物消毒液(由Fujimi Seiyaku有限公司制造，指示浓度为3W/V％)，所得到的拉曼光谱见图7。在本光谱中，仍将蒸馏水光谱作为本底从样品光谱中扣除。图8说明了由图4的校准曲线得到的拉曼波数偏离为878.8cm-1的光谱峰强度。由此估计出的过氧化氢浓度为3.04％。
可见，通过拉曼波数偏离在800到920cm-1的峰可以确定含过氧化氢样品中的过氧化氢含量。
虽然已对本发明进行了详细的叙述和图解说明，但不用说，上述情况只是用了图解和实例的方法，不是对本方法进行的限定，本发明的精神和范围只受到所附的权利要求的限定。
权利要求
1.一种测定过氧化氢的方法，包括下面步骤用一单波长的激发光束照射池中的一样品溶液，将上述样品溶液的散射光按其光谱成分分开，通过一拉曼散射峰进行定量测量，在该拉曼散射峰处，它的光谱波数偏离所述激发光束的所述波长在800到920cm-1的范围。
2.如权利要求1所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于上述的样品溶液为已含有过氧化氢的样品水溶液。
3.如权利要求1所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于，所述的样品溶液是用于进行生成过氧化氢的酶反应的反应溶液，假设S为被酶作用物，P为产物，E为酶，下面生成过氧化氢的酶反应体系为
4.如权利要求3所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于，通过测量生成的过氧化氢的量测得所述的被酶作用物S或所述产物P的量。
5.如权利要求3所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于通过测量生成的过氧化氢的量来测量酶的活性。
6.如权利要求3所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于所述的酶为氧化酶。
7.如权利要求6所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于所述的被酶作用物和所述的酶的组合是从下面一组中选择的，即葡萄糖和葡萄糖氧化酶，胆甾醇和胆甾醇氧化酶，尿素和尿酸酶，丙酮酸和丙酮酸氧化酶，己糖和吡喃糖氧化酶。
8.如权利要求1所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于所述的样品溶液是一种反应液，用于分解过氧化氢的酶反应，假设PH2为反应物，P为产物，E为酶，下面的酶反应中还原过氧化氢的反应体系为
9.如权利要求8所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于通过测量还原了的过氧化氢的量来测量所述的反应物PH2和所述的产物P的量。
10.如权利要求8所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于所述的酶是包括过氧化物酶或过氧化氢酶的脱氢酶。
11.如权利要求1所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于所述样品溶液是一个反应体系，该体系含用一化合物来标记的一反应物，并含一恒量的过氧化氢，上述化合物具有与过氧化氢的反应性，上述反应物的量是从还原了的过氧化氢的量而得到的。
12.如权利要求11所述的测定过氧化氢的方法，其特征在于，一种由过氧化物酶标记了的反-抗体和一种抗原-抗体反应组合进行反应，再进行BF分离，此后再与过氧化氢反应，通过测量所述的过氧化氢还原的量来得到所述的抗体的量。
13.一种用于过氧化氢的测定仪器，包括，带有一反光内表面的整球形池托；一用于装样品溶液的，有一可装于所述池托的球形的池；一个用所述的单波长激发光束来照射位于所述池托中池内所述样品溶液的光源部分；一光谱检测部分，用于接收从所述池托中所述池的所述样品溶液发出的散射光，将其按其光谱成分分开，并检测过氧化氢的拉曼散射光强。
14.如权利要求13所述的过氧化氢的测定仪器，其特征在于所述的池托上带有一窗用于接收从所述的激发光源发出的所述的激发光束，和在与入射光成180°的方向收集上述散射光，和一位于从所述的池到所述光检测部分的光路上的聚光镜，用于对从所述窗中射出的上述散射光进行聚光，一个位于所述的窗和所述的聚光透镜间的光路上的一反射镜，用于将所述的激发光束折射并使其通过所述的窗进入所述的池。
15.如权利要求13所述的过氧化氢的测定仪器，其特征在于所述的池托有一入口窗，用于接收从所述的激发光源发出的所述的激发光，和一出口窗，用于从与入射光成90°方向收集所述的散射光束。
全文摘要
从一光源发出的一激发光束由一带一光束分离器的光路调节系统分成一测量光束和一参比光束，上述测量光束作用于池中样品。样品发出的拉曼散射光经由一调节散射光路的光系统和一波长选择器被一带分光镜的光谱检测器检测。在光谱检测器测得的光谱中，一相对于激发光波长来说波数偏离在800-920cm
文档编号G01N21/47GK1160201SQ96107309
公开日1997年9月24日 申请日期1996年3月18日 优先权日1996年3月18日
发明者山口佳则, 上野上晴三, 八木雅之, 窦晓鸣 申请人:株式会社京都第一科学