专利名称：：合成后颗粒试剂的化学修饰的制作方法
技术领域：
：本发明
背景技术：
：发明所属领域本发明涉及用于光散射凝集反应试验中具有高敏感性的聚合物颗粒试剂，特别是涉及经生物兴趣化合物功能基共价结合的颗粒试剂，为了提高反应性和稳定性所述颗粒试剂已用修饰剂处理过。有关发明背景在对细菌、细胞表面抗原、血清蛋白或其他用以提高目测或仪器检测凝集反应或凝集抑制反应敏感性分析试剂的定量检测试验中，颗粒试剂已被用作半抗原、蛋白质或其他生物兴趣化合物的载体。现已公知了多种制备颗粒试剂的方法。美国专利4,401,765和4,480,042中公开了在利用凝集反应或凝集抑制反应进行的敏感的光散射免疫测定法中使用的具有高折射率的聚合物内核和带有直接或间接与生物兴趣化合物键合的功能基的聚合物外壳的颗粒试剂。通过光散射技术应用聚合物颗粒试剂检测血清或其他体液中各种药物是否存在以及存在量的测定方法是一种经济适用的方法。现已发现，这些聚合物颗粒试剂，特别是在聚合物颗粒外壳上带有环氧功能基的那些颗粒试剂，当在碱性条件下加热时，会失去活性。既使在低温和中等pH值下保存这些颗粒试剂，这种不稳定性也会出现而且这种不稳定性还涉及到丧失免疫活性反应性。因此，需要一种可提高聚合物颗粒试剂稳定性而又不使活性丧失的方法。本发明的一个目的是提供一种在光散射免疫测定法中使用的具有提高了稳定性和免疫反应性的颗粒试剂。本发明的另一个目的是提供一种制备这种颗粒试剂的方法。本发明概述本发明的目的是通过一种用以提高颗粒试剂稳定性和增强颗粒试剂免疫反应性的方法而提供的，所述颗粒试剂包括与生物兴趣化合物共价结合的聚合物颗粒。所述方法包括下述步骤，即通过将所述聚合物颗粒的活性功能基与生物兴趣化合物的互补性功能基共价结合合成所述聚合物颗粒试剂，然后在预定的pH和温度下，用可在所述颗粒表面投放负电荷的修饰剂培养所述聚合物颗粒试剂。优选的修饰剂是选自β-巯基乙酸和硫代硫酸盐的阴离子亲核试剂。所述颗粒上功能基的非限定性实例有环氧基、羧基、羟基、氨基或醛基。所述生物兴趣化合物包括血清、血浆、唾液、尿液或乳蛋白；药物、维生素、激素、酶、抗体、多糖、细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞和组织抗原以及其他血细胞或血液物质。所述化合物可以通过合成间隔臂(spacerarm)或者通过蛋白质材料直接键合到所述聚合物壳上。当所述化合物是药物时，其可以选自奎尼丁、苯巴比妥和氨基糖甙类抗生素例如万古霉素、妥布霉素和庆大霉素。优选的是，所述生物兴趣化合物的分子量小于2000。所述聚合物颗粒试剂可以是任何适宜的公知颗粒试剂。优选的试剂包括(A)含有内核和外壳的聚合物颗粒，其中所述内核是在钠D线波长下测得折射率不小于1.54的聚合物，而所述外壳是具有能与生物兴趣化合物互补性功能基反应的亲核性功能基的烯键不饱和单体的聚合物，并且其与(B)生物兴趣化合物共价结合。用本发明方法制备的所述聚合物颗粒试剂可用于测定生物兴趣化合物特别是包括生物体液内物质或者细胞和组织提取物的光散射免疫测定法中，为此可产生免疫学对抗反应物(immunologicalcounter-reactant)。本发明还包括一种含有聚合物颗粒的颗粒试剂，其中所述颗粒的最外层具有先与生物兴趣分子化合物或类似物互补性功能基反应的表面活性功能基，随后按照上述用于提高免疫测定法活性和稳定性的制备方法，将所述表面活性功能基的残基与带负电荷的小分子量化合物进行反应。本发明还包括一种检测生物兴趣化合物的方法，该方法包括下列步骤，即将(1)在所述颗粒表面带有负电荷并且带有直接或经蛋白接头与生物兴趣化合物互补性功能基共价结合的功能基的颗粒试剂，与(2)怀疑含有所述生物兴趣化合物的液体和(3)凝集剂进行培养；并且用光度计测定粒度的增长。所述生物兴趣化合物可以是药物，例如选自奎尼丁、苯巴比妥和氨基糖甙类抗生素如万古霉素、妥布霉素和庆大霉素等的药物。当所述偶合培养步骤完成后，将聚合物颗粒用修饰剂处理，所述修饰剂选自具有能与所述颗粒表面功能基例如环氧衍生物进行反应并且还带有负电荷的功能基的低分子量化合物，它们是阴离子亲核试剂，优选β-巯基乙酸和硫代硫酸盐。附图简要说明对比图表中，说明了按本发明方法制备的颗粒试剂的稳定性被提高了的情况，其中图1A说明了在35℃下贮存和于硼酸盐中用β-巯基乙酸处理的万古霉素试剂的稳定性；图1B说明了在35℃下贮存未处理的万古霉素试剂的稳定性；图1C说明了在35℃下贮存和仅用硼酸盐缓冲液处理的万古霉素试剂的稳定性；和图2说明了用β-巯基乙酸和硼酸盐处理万古霉素试剂，其活性意想不到地提高。本发明优选方案的详细描述本发明提供了一种不仅可达到提高在聚合物颗粒外壳上带有功能基的聚合物颗粒试剂的稳定性的目的，而且更意想不到的是可增强这些试剂的免疫反应性的方法。该方法通常包括下列步骤，即在所述聚合物颗粒与生物兴趣化合物共价结合后，在适宜pH和温度条件下，用可向所述聚合物表面施加负电荷的修饰剂对所述颗粒试剂进行处理。如此处理过的颗粒试剂与未处理过的颗粒试剂相比，表现出更高的稳定性和增强的免疫反应性。在用修饰剂例如β-巯基乙酸或硫代硫酸盐对所述聚合物颗粒试剂进行培养时，向所述聚合物颗粒表面引入阴离子基团，同时将残留的活性基团还原，结果令人惊奇的是，既提高了活性又改善了稳定性。当可能使用修饰所述聚合物颗粒表面以还原活性基团并引入羧基的其他试剂时，会令人意想不到地发现，不是所有曾经认为可用于阻滞颗粒试剂上残存活性基团的试剂都能达到本发明所述的两个目的。例如，美国专利4,480,042中指出，乙硫醇、巯基丙酸、半胱氨酸或带有氨基功能基的可溶性聚合物可用作阻滞剂，以结合并阻滞所述颗粒表面未被占据的部位。但是，现在发现，用乙硫醇处理可以改善某些颗粒试剂的稳定性，但不能改善免疫反应性，而在某些情况下，甚至会降低颗粒试剂的活性。作为本发明目的物的所述聚合物颗粒试剂是可用于凝集反应光散射测定法中的试剂。现在已有许多种凝集反应光散射测定法，它们包括比浊测定法、浊度测定法、微粒计数法、准光电散射法、自动相关色谱法以及对颗粒的光散射不对称现象和偏振作用进行测定的方法。每种类型的测定系统对所述颗粒试剂有不同的强制条件，颗粒悬浮液的光散射特性取决于多种因素，例如粒度、所述颗粒的折射率和悬浮介质，以及检测光的波长。在所有类型的测定方法中，在所选定的波长下，颗粒的折射率越高，光散射信号越强。目测凝集反应时，所用波长约为400-650nm。在所述凝集反应期间，有效粒度会增加。在比浊法中，为达到高灵敏度，优选用短波长检测具有高反射率的小颗粒。当测定血清样品时，由于蛋白质和其他组份吸收光，合适的波长是约大于320nm的波长。当用浊度测定法时，除了粒度和波长外，最佳灵敏度还取决于检测角度。本发明所用聚合物颗粒试剂是一种具有高折射率内核和与生物兴趣化合物(包括抗原类似物或其抗体)共价结合的外壳的聚合物颗粒。基于本发明，所述生物兴趣化合物抗原类似物是指分享抗原决定簇并因此在所述抗体和生物兴趣化合物结合特异性方面与所述生物兴趣化合物基本相同的任何物质或一组物质。所述聚合物颗粒内核可选自多种具有高折射率的材料。优选的是可经乳化聚合制备的材料，因为这样能够控制颗粒的均匀性和粒度。由于折射率对于光散射凝集测定法例如比浊法的重要性，对于较理想的测定灵敏度来讲，内核材料必须能够产生可接受的信号变化。在高浓度(μg/ml范围)下进行分析时，对材料的选择没有限定，但是在毫微克/ml范围内进行分析时，颗粒必须具有较高的折射率。折射率是波长的函数。因此，对波长的测定将影响散射性质。通常，在较短波长下，折射率较大。优选的内核是在钠D线569nm波长下测得的折射率不小于1.54的聚合物。相对于脂族聚合物，具有高芳香性和高原子量取代基的核聚合物是优选的。除了已知具有高折射系数的取代基如卤化物、芳族、杂环、不饱和或碳环基团之外，所述内核单体选自含有乙烯基或烯丙基的单体。所述外壳是烯键不饱和单体的聚合物，其在内核存在下聚合形成，并具有能与生物兴趣化合物互补性功能基反应的功能基。所述外壳可以任意地带有足以形成水溶性聚合物颗粒的其他烯键不饱和单体。外壳单体含有例如环氧基包括甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、缩水甘油乙烯醚和甲代烯丙基缩水甘油醚。合成所述聚合物颗粒后，将所述生物兴趣化合物与所述聚合物颗粒共价结合，以制得所需颗粒试剂。本发明所用聚合物颗粒可以按照上述美国专利4,401,765和4,480,042(在此作为本发明参考文献)中所述方法制备。据信，迄今为止测得的颗粒试剂在贮存期间活性降低的原因可能是由于生物兴趣化合物与所述聚合物表面上未被占据的环氧化物键合点之间的第二次结合。在本发明方法中，在能还原所述残存的环氧化物并施加负电荷(例如通过向所述聚合物表面引入羧基基团)的条件下将上述聚合物颗粒试剂与修饰剂培养一段时间。所述反应的pH可根据所述生物兴趣化合物与所述聚合物颗粒之间的反应所公知的特有限制条件而变化。J.F.King，R.Rathore，J.Y.L.Lamb，Z.R.Guo和D.F.Klassen在JournaloftheAmericanChemicalSociety，Vol.114，pp.3028-33(1992)，＂pHOptimizationofNucleophilicReactionsinWater＂中提供了与生物兴趣化合物反应的最佳pH选择指南。所述反应温度必须低于能使所述生物兴趣化合物失活的温度并且高于能使其冷冻的温度。优选的温度是在4-100℃，更优选的是高于室温，而最优选的是约40-70℃。所述反应在室温即约20℃下可以顺利地进行，而在某些情况下要在100℃下进行。需要说明的是，对温度和pH的限定取决于所述特定生物兴趣化合物与所述聚合物颗粒之间的反应并根据该反应而变化。可使此类化合物失活的温度和pH是公知的或者可以用相对容易的公知方法测得。所述修饰剂上具有活性功能基，在与所述颗粒试剂进行培养的步骤中，将其缓冲，以维持pH高于所述修饰剂活性功能基的pKa。所述反应将通过下列胺功能基药物得以说明。首先，将所述聚合物颗粒与所述生物兴趣化合物共价结合，此时药物具有胺功能基。然后，将所述试剂用下列X所代表的修饰剂处理。其中R是药物或者药物类似物，例如万古霉素；和X是低分子量的双功能基化合物，其中一个功能基带有负电荷而另一个功能基能与所述颗粒反应。上述反应说明了适于将所述生物兴趣化合物与胶乳颗粒连接的一对常见反应物(胺与环氧化物反应)互补对。适于将生物兴趣化合物与环氧化物偶合的另一互补对包括巯基类化合物、酰亚胺类化合物和苯酚类化合物等等。公知的还有其他可用于将生物兴趣化合物与颗粒偶合的反应物互补对，例如，但不限于，醛类化合物和胺类化合物、醛类化合物和硫醇类化合物、氯甲苯基类化合物和胺类化合物、乙烯基砜类化合物和硫醇类化合物、胺类化合物和被活化的羧基化合物。用各种不同的药物进行试验，如下所述，用氨基糖甙类抗生素，万古霉素和苯巴比妥以及奎尼丁进行颗粒试剂的合成和试验。实施例实施例1氨基糖甙类抗生素(万古霉素)试剂的修饰材料和方法除了万古霉素盐酸盐和牛血清白蛋白(BSA)组份V来自SigmaCo.，IBEX，EP-110表面活性剂来自Rhone-PoulencCo.以及微生物抑制剂来自SupelcoCo.以外，所述颗粒试剂合成中所用材料均来自AldrichCo.。未衍生的环氧化物壳/核胶乳(环氧化物胶乳)根据上述美国专利4,480,042中所述制得。试验所用抗体由鼠杂交瘤细胞系获得，其中所述鼠杂交瘤细胞系是经用万古霉素戊二醛钥孔血篮素免疫原免疫的鼠的脾细胞融合获得的。所述抗体是抗-万古霉素IgGl型抗体，它由小鼠制得并经蛋白A亲和性纯化分离出。所述抗体稀释剂是含有150mM氯化钠和1％BSA组份V的pH为5.5的100nM磷酸钠溶液。透滤用市售中空纤维透滤筒进行。离心用DupontSorvalRC28S离心机进行。所述免疫测定法试验用由RocheDiagnosticsCo.生产的CobasBio自动分析仪来完成。所述分析仪设定在37℃下工作。检测波长为340nm。首先，加入51μl水，随后加入150μl颗粒试剂和试验缓冲液的混合物。所述试验缓冲液是25mM硼酸钠、172mM硼酸、600mM氯化钠和1％阴离子表明活性剂的混合物。加入3μl校正剂试样，然后加入20μ1水，并且将此混合物培养30秒。校正剂由已知量的万古霉素的混合人血浆溶液制得。记录光强度读数，以“辅助读数”的形式识别光强度读数并以吸收单位((AU)其中一个AU等于使光按自然对数减弱的吸收度)对其进行测定，然后向起始反应物中加入10μl抗体溶液。反应开始后，以10秒间隔读取读数4分钟。用下列两种方法中的一种可计算出校正剂的测定结果；(i)由最终读数减去辅助读数，得到4分钟终点的测定值，或者(ii)由第一次读数之后的第一个10秒反应中光强度的变化计算初始速率，得到速率的测定值。试剂的合成a.颗粒试剂的合成在所述合成中使用两种缓冲液。第一种是偶合缓冲液(pH约为9.2)，它是含有2.0％EP-110的50mM四硼酸钠十水合物(19.05g/l)(66.7ml所述产物，由每升最终混合物回收得到)。第二种缓冲液是试剂贮存缓冲液，它是含有1.2％EP-110、pH为7.8的15mM磷酸盐缓冲液。它可以通过将2.07gNaH2PO4·H20、13.1ml1NNaOH和40.0mlEP-110混合，加水至1.0升制得。将50ml含20％固体的65nm环氧化物胶乳与46ml偶合缓冲液混合。向此悬浮液中，搅拌下加入400mg万古霉素盐酸盐的4ml水溶液。于循环水浴中40℃下，将此混合物加热22小时。用H1MPO1-43中空纤维筒，操作压力为10psi，工作柱是150-190ml胶乳，经透滤纯化所述产物。以相同的速度加入洗涤缓冲液，收集流出物，所述洗涤缓冲液由上述偶合缓冲液和贮存缓冲液的1∶1混合物构成。收集流出物至2升后，补充缓冲液由洗涤缓冲液转变成纯贮存缓冲液。在此过程完成前，用600ml贮存缓冲液洗脱。将纯化的胶乳浓缩，透滤筒用贮存缓冲液冲洗。所述浓缩物和冲洗液的终体积达到200ml。在实施例1的下列步骤中此试剂称为试剂1A。b.合成后化学修饰将试剂1A的两个10ml等分试样于28,000RPM下离心分离1小时，得到一上清液，将此上清液滗析并清除。搅拌下，将一份样品的胶乳颗粒片状物再悬浮于偶合缓冲液中，而另一份样品再悬浮于含有100mMβ-巯基乙酸钠(BMA)(11.4g/L)的偶合缓冲液(硼酸盐)中。将两份胶乳样品于40℃下培养18小时，然后如上所述进行离心分离，以相同的体积用贮存缓冲液进行再悬浮，第二次离心分离，以相同的体积用贮存缓冲液进行第二次再悬浮。在实施例1的下列步骤中，此产物分别称为试剂2A和2B。试剂试验c.试剂的比较活性试验将所述颗粒试剂依次用检定缓冲液以1/45稀释。当用CobasBio自动分析仪进行试验时，此浓度试剂在1cm光程长度下的光强度约为1AU。用于抗体试剂中的所述抗体浓度为111μg/ml。用上述速率模型检定试验条件对试剂1A、2A和2B进行试验。所得标准曲线如表1所示表1图2说明了用BMA处理的所述试剂的活性改善情况。上面的曲线是在硼酸盐缓冲液中用BMA处理后所述颗粒试剂的曲线。第二条曲线是未经处理的试剂的曲线，而下面的曲线是仅用硼酸盐缓冲液处理的试剂的曲线。用硼酸盐缓冲液处理所得活性结果是预想得到的。上面的曲线表示未预想得到的结果用BMA处理的试剂的活性明显提高。由于已知万古霉素在所述反应条件下会发生重排，因此，活性失活是意想得到的。表明在硼酸盐缓冲液中用BMA处理所述万古霉素试剂提高了活性。d.试剂的比较稳定性试验于35℃下贮存每一上述试剂1A、2A和2B的样品，而所有其他试剂于4℃下贮存。如上所述取出样品并用于上述万古霉素的检测中。此时，用上述4分钟终点检测应答模型取得比较试验数据。所述颗粒试剂于35℃下静置贮存后第0、1、4、7天进行检测。检测的目的是确定在进行第0天以后的几天里是否以相同的速率进行了所述凝集反应。每一试剂的应答结果如图1A、1B和1C所示。在这一系列图表中，每天试验的检测应答结果用mAU表示。所述与未经处理的万古霉素相比，用BMA处理的所述万古霉素试剂的稳定性得到了提高。1、4、7和11天用BMA处理的所述万古霉素的活性与第0天相同，说明了在较冷温度下贮存时，所述试剂相对于时间的稳定性。附图1B说明了当所述万古霉素试剂未经处理时，相对于时间来讲其活性丧失的情况。在4℃下贮存未经处理的试剂样品(◆)，表明11天后是稳定的，但所述样品(◆)在35℃下贮存时，相对于同一段时间，其活性丧失约20％。对于仅用硼酸盐缓冲液处理的所述万古霉素试剂来讲，其活性可以在第0天随时间降低至640mAU，也可以在第0天随时间升高超过850mAU，活性的升高和降低都是不理想的。尽管贮存了一段时间，但所述颗粒试剂的活性应当保持不变。所述颗粒试剂合成后用修饰剂例如BMA修饰，可获得理想的稳定性和提高了的免疫反应性。实施例2对奎尼丁的测定a.颗粒试剂的合成通过将奎尼丁衍生物偶合到核/壳胶乳颗粒上合成奎尼丁颗粒试剂。所述核/壳胶乳颗粒由高折射率聚苯乙烯核和与乙二醇二甲丙烯酸酯交联的甲基丙烯酸缩水甘油基酯构成。所述颗粒表面上的环氧化物功能基通过与亲核试剂基团反应添加上。所用奎尼丁衍生物是11-(2-羧基乙硫基)二氢奎尼丁(QAD)和间隔基(2，2′-(1，2-亚乙二氧基)乙二胺)之间形成的含氨基加合物。QAD是通过用2，2′-偶氮二(异丁腈)作初始游离基来源，由3-巯基丙酸和所述奎尼丁双键之间进行游离基加成而制得。b.合成后化学修饰将按照实施例2中所述方法合成的奎尼丁颗粒试剂样品作为对照。按照下列所述骤冷方法制备带有表面环氧化物未活化的颗粒试剂。将奎尼丁颗粒试剂(5.0ml)样品离心分离并除去上清液。固体再悬浮于骤冷缓冲液(5ml，50mM碳酸钠溶液，pH9.0)中，随后加入修饰剂(巯基乙酸钠，43mg或硫代硫酸钠五水合物，48mg)。将每一反应的pH调至9.5，将混合物混合，然后于70℃下培养16小时。随后，将各种奎尼丁颗粒试剂经离心分离纯化并再悬浮(3×)于颗粒洗涤缓冲液(15mM磷酸盐缓冲液，1.0％阴离子表面活性剂，pH7.4)中。将最终片状物再悬浮于颗粒贮存缓冲液(15mM磷酸盐缓冲液，0.5％阴离子表面活性剂)中并用声处理，直至吸收率A340/A600大于100.0。c.检测分析用磷酸盐测定缓冲液(105mM，pH7.0，0.4％阴离子表面活性剂，0.002％乙基汞硫代水杨酸钠)将所得颗粒稀释(1∶50，340nm下吸收率为1AU)。抗体试剂是单克隆抗体腹水样品(5mg/ml，按1∶45用50mM磷酸钠缓冲液、75mM氯化钠、0.1％叠氮化钠、0.05％乙基汞硫代水杨酸钠稀释)。用DupontacaDiscrete临床分析仪作奎尼丁校正剂标准曲线。在由RocheDiagnosticsCo.生产的CobasBio临床分析仪上用实施例1所述终点测定法于37℃下进行浊度免疫测定分析，如下所述进行修饰将颗粒试剂(240μl)、样品(4μl)和水(14μl)进行培养(30秒)。用抗-奎尼丁(20μl，用20μl水冲洗)引发反应。由220秒间隔内终点读数减去起始辅助读数计算反应率。所述奎尼丁颗粒试剂对照的各种标准浓度对BMA修饰的试剂的凝集应答如表2所示。表2对照和用BMA或硫代硫酸盐处理的颗粒试剂的奎尼丁检测结果</table></tables>所述结果说明试剂合成后用β-巯基乙酸处理的试剂与所述对照相比活性显著提高。由于由降低抗体浓度而建立起来的校正剂标准曲线与所述对照颗粒样品的相同，因此证实增强的凝集反应信号是免疫特异性的。实施例3对苯巴比妥的测定a.颗粒试剂的合成向反应容器中依次加入偶合缓冲液(164ml，20mM硼酸盐缓冲液、0.3％IBEXEP-110、0.005％乙基汞硫代水杨酸钠，pH8.0)、苯巴比妥/PEPA共轭物(12ml10％DMSO溶液，苯巴比妥3-(5-戊)酸和多亚乙基多胺连接剂的加合物)和颗粒原料(24ml，20％固体，70nm聚苯乙烯/甲基丙烯酸缩水甘油酯核/壳胶乳颗粒)。将pH调至8.0。溶液于70℃下加热6小时，然后将pH调至6.5。然后将此颗粒溶液经中空-纤维柱(Amicon0.10μ筒)溶剂透滤纯化(2升20mM硼酸盐缓冲液、0.30％IBEXEP-110、0.005％乙基汞硫代水杨酸钠，pH8.0)。随后用颗粒贮存缓冲液(1.2升5mM柠檬酸盐缓冲液、0.30％IBEXEP-110，pH5.5)进行第二次透滤。用所述颗粒贮存缓冲液将所得颗粒残余物调至200ml。苯巴比妥3-(5-戊酸)可通过苯巴比妥和5-溴戊酸乙酯之间进行取代反应并随后将酯水解制得。这种类型的反应如J.March，＂AdvancedOrganicChemistry＂pp.357，349(McGraw-Hillpub.1977)中所述。所述多亚乙基多胺如上述W.A.Frey和D.M.Simons的美国专利4,581,337中所述。b.合成后化学修饰向每一反应容器中依次加入水(0.5ml)、苯巴比妥颗粒试剂(2.0ml)和骤冷缓冲液(2.5ml，100mM磷酸盐缓冲液、2％IBEXEP-110，pH6.5)。在此步骤，每一试验取一对照。欲骤冷的样品进一步用(i)BMA(57mg)或(ii)硫代硫酸钠五水合物(124mg)或(iii)5，5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)(50mg)和二硫苏糖醇(DTT)(19mg)的混合物或(iv)DTNB(50mg)和DTT(19mg)和β-巯基乙醇(2ME)(9μl)的混合物处理。将每一反应的pH调至6.5。将混合物搅拌，然后于70℃下培养1.5小时。将各种苯巴比妥颗粒试剂经离心分离纯化并再悬浮(3×)于颗粒贮存缓冲液中。c.检测分析在DuPontDimension临床分析仪上进行浊度免疫测定。常规原始记录包括苯巴比妥颗粒试剂(40μl，按1∶5用颗粒稀释剂稀释)和水(40μl)的检测缓冲液(150μl，200mm磷酸盐缓冲液、0.64％阴离子表面活性剂、约0.01％抗微生物防腐剂，pH7.0)的悬浮液。通过加入抗-苯巴比妥单克隆抗体(约10μg/40μl10mM磷酸盐缓冲液、1M氯化钠、约0.01％抗微生物防腐剂、1％BSA检测液)和水(40μl)引发反应。用每240秒mAU终点检测法计算反应率。对照试验和用BMA或硫代硫酸盐处理的带环氧化物的苯巴比妥颗粒试剂的浊度免疫测定结果如表3所示。表3所示结果表明，合成后同时用BMA或硫代硫酸盐进行化学修饰提高了所述苯巴比妥试剂的活性。结果显示，所述苯巴比妥颗粒试剂用硫代硫酸盐处理好于用BMA处理。表3苯巴比妥的检测结果对照对BMA或硫代硫酸盐处理</tables>注苯巴比妥颗粒是按照常规负荷方法，在骤冷步骤以消除表面活性环氧化物基团后用BMA或硫代硫酸盐制得。对照试验和分别用DTNB和DTT混合物或者DTNB、DTT和2ME处理带环氧化物的苯巴比妥颗粒试剂的浊度免疫测定结果如表4所示。此结果表明，其他负电荷修饰剂可改善活性。但是，在独立试验中发现，只用2ME处理不会改善活性。表4苯巴比妥的检测结果对照对DTNB/DTT或DTNB/DTT/2ME相同抗体浓度下被骤冷的颗粒注苯巴比妥颗粒是按照常规负荷方法，在骤冷步骤以消除表面活性环氧化物基团后用DTNB、DTT和2ME的混合物制得。表3中硫代硫酸盐的活性值在校正值为0、10和20时较高。为说明所述数值是用硫代硫酸盐处理的结果，而并不是非特异性凝集反应的贡献，所述检测化学计量被再优化。通过试验中进一步稀释所述抗体试剂可得到信号增强的标准曲线。用硫代硫酸盐处理的颗粒的标准曲线优化结果如表5所示。同样，用DTNB/DTT和DTNB/DTT/2ME处理颗粒的标准曲线优化结果如表6所示。表5硫代硫酸盐处理的颗粒的检测标准曲线优化结果<p>注通过进一步稀释所述抗体试剂，将带有增强标准曲线信号的用硫代硫酸盐处理的颗粒进行再优化，以得到普通形态的标准曲线。注通过进一步稀释所述抗体试剂，将带有增强标准曲线信号的同时用DTNB/DTT和DTNB/DTT/2ME处理的颗粒进行再优化，以得到普通形态的标准曲线。将各种样品于35℃下贮存并如实施例1所述对稳定性进行试验，结果如表7所示。表7对苯巴比妥颗粒试剂的加速校正的稳定性表7中所述稳定性数值表示由0开始的变动百分比。正如上述图1A、B和C中所说明的，稳定的试剂应当是活性没有变化的，即变化为0％。活性提高用正数表示，活性降低用负数表示。表7中未经处理的对照样品表示基线。表7中用修饰剂处理的颗粒若高于所述对照，则其稳定性强于对照，若用修饰剂处理的颗粒低于对照，则其稳定性低于对照。表7表明，单独用2ME和一硫代甘油处理颗粒试剂，可提高所述试剂的稳定性。但是，将用2ME和一硫代甘油处理的试剂的检测结果与未经处理的对照试剂的结果进行比较发现，在活性方面没有显著变化。因此，仅在合成后用BMA或硫代硫酸盐进行修饰可相对于时间来讲同时增强所述苯巴比妥颗粒试剂的稳定性并提高苯巴比妥颗粒试剂的活性。用BMA或硫代硫酸盐处理可向所述聚合物表面引入负电荷，而在本文所述反应条件下，用2ME和一硫代甘油处理则不能。令人惊奇的是，在所有颗粒试剂的试验中，合成后颗粒试剂用BMA修饰可增强稳定性并且可改善免疫反应性。用硫代硫酸盐处理不能改善奎尼丁颗粒试剂的活性，但是能改善苯巴比妥颗粒试剂的活性和稳定性。权利要求1.一种提高颗粒试剂活性和稳定性的方法，其中所述试剂包含一种在其外层上带有能与生物兴趣化合物互补性功能基反应的表面活性功能基的聚合物颗粒，并且该聚合物颗粒与所述生物兴趣化合物共价结合，所述方法包括下述步骤在预定pH和温度下，将所述颗粒试剂用能在所述聚合物颗粒外层上施加负电荷和还原未反应功能基的修饰剂进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰剂是阴离子亲核试剂。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述阴离子亲核试剂选自β-巯基乙酸和硫代硫酸盐。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物兴趣化合物是奎尼丁并且所述修饰剂是β-巯基乙酸。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物兴趣化合物的分子量低于2000。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰剂带有功能基并且在所述培养过程中进行缓冲以维持pH大于所述修饰剂活性功能基的pKa。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度在4-100℃范围内。8.一种测定生物兴趣化合物的方法，该方法包括下述步骤培养(1)在其外层具有(a)直接或者通过蛋白接头与生物兴趣化合物互补性功能基共价结合的活性功能基和(b)带负电荷的被还原的未反应功能基的聚合物颗粒试剂，与(2)怀疑含有所述生物兴趣化合物的液体，和(3)凝集反应试剂；并且用光度计测定粒度的增长。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物兴趣化合物是选自氨基糖甙类抗生素、奎尼丁和苯巴比妥的药物。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述氨基糖甙类抗生素包括万古霉素、妥布霉素和庆大霉素。11.根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合物颗粒试剂外层被还原的未反应功能基是在用还原所述外层未反应功能基的修饰剂将所述生物兴趣化合物与所述活性功能基共价结合后制得的。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述修饰剂是选自β-巯基乙酸和硫代硫酸盐的阴离子亲核试剂。13.一种颗粒试剂，该颗粒试剂包括一种聚合物颗粒，所述聚合物颗粒具有在其表面带有羧基功能基的外层以及直接或者通过蛋白接头与生物兴趣化合物互补性功能基共价结合的功能基，所述颗粒试剂通过下述方法制备，所述方法包括在预定pH和温度下，将(1)带有能以共价键与生物兴趣化合物结合的所述生物兴趣化合物互补性功能基反应的功能基的聚合物颗粒，用(2)能在所述聚合物颗粒外层上施加负电荷和还原未反应功能基的修饰剂进行培养。14.根据权利要求13所述的颗粒试剂，其中所述生物兴趣化合物是药物。15.根据权利要求14所述的颗粒试剂，其中所述药物选自氨基糖甙类抗生素、奎尼丁和苯巴比妥。16.根据权利要求13所述的颗粒试剂，其中所述修饰剂是选自β-巯基乙酸和硫代硫酸盐的阴离子亲核试剂。17.一种制备颗粒试剂的方法，所述试剂包括(1)具有外壳的聚合物颗粒，其中所述外壳带有能与生物兴趣化合物互补性功能基反应的功能基，和(2)所述生物兴趣化合物，所述方法包括下列步骤通过将聚合物颗粒的反应活性功能基与生物兴趣化合物互补性功能基共价结合，合成颗粒试剂，然后，在预定pH和温度下，将所述聚合物颗粒试剂用修饰剂培养一段时间，以足以使所述修饰剂将所述聚合物颗粒外壳表面未反应功能基还原并向其上施加负电荷。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述修饰剂是选自β-巯基乙酸和硫代硫酸盐的阴离子亲核试剂。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物兴趣化合物是选自氨基糖甙类抗生素、奎尼丁和苯巴比妥的药物。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述修饰剂带有反应活性功能基并且在所述培养过程中进行缓冲以维持pH大于所述修饰剂活性功能基的pKa。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述温度在4-100℃范围内。全文摘要本发明提供了一种可提高聚合物颗粒试剂的稳定性并且增强聚合物颗粒试剂活性的方法，该方法通过用可在所述聚合物颗粒表面施加负电荷并还原功能基的修饰剂培养已与生物兴趣化合物如药物共价结合的聚合物颗粒。所述修饰剂优选是选自β-巯基乙酸和硫化硫酸盐的阴离子亲核试剂。文档编号G01N33/543GK1166205SQ96191118公开日1997年11月26日申请日期1996年8月2日优先权日1995年8月3日发明者V·P·徐,A·R·克雷格申请人:达德化学系统公司