专利名称：酶联免疫吸附elisa反应板的再生方法
技术领域：
本发明涉及用酶联免疫吸附试验(ELISA法)临床诊断肝炎、爱滋病等病毒以及其它细菌、衣原体、原虫感染所使用的反应板、管、珠的再生重复使用方法及其相应技术。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是国内外临床诊断和实验研究的一类重要技术，涉及到医学、生物学、遗传学、免疫学等许多学科，其基本原理是利用抗原、抗体的特异性反应、用已知的抗原(抗体)检测未知的抗体(抗原)，在疾病的诊断和疗效的观察及预防医学方面应用尤为广泛，如医学上用以诊断争鉴别诊断肝炎病毒(甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒)、爱滋病诊断及其它细菌、衣原体、原虫感染的诊断。
运用ELISA法检测的反应板，目前用的较多的是国产产品，几百元一块，进口价格更贵。反应板是将可溶性抗原或抗体吸附在固相载体上(如聚苯乙烯制成的反应板、管、珠)。这是一种非特异性吸附，吸附很牢，称之为“包被”，当被检样品中有相应的抗体或抗原，就会与吸附在反应器上的已知抗原或抗体结合被连接在反应板上，再用酶结合物(酶二抗标记物或生物素、亲和素系统、萤光素标记物等)及其相应底物显示结果，其结果可以用肉眼观察或更精确的用酶标仪测定OD值。由于被检样品中的抗体或抗原与反应器上的抗原或抗体的连接结合非常特异，用一般清洗液清洗不掉，因此，目前检测一次样品后，反应板只好丢弃了，致使检测成本较高。
本发明的目的就是为了克服上述反应板用过一次不能再重复使用的缺点，根据ELISA基本原理，抗原与抗体结合虽然是非常特异，但不是通过离子键、共价键结合，而是通过很弱的短距力而结合，如范德瓦耳斯力、静电引力、氢键及疏水性作用等，这些力在一定的外界条件下非常弱，以致抗原与抗体复合物解离，使抗原抗体的结合为可逆的化学反应。关键是一定的外界条件，如降低反应系统的PH值，用酸类，如硫酸、盐酸、醋酸等与离子强度有机溶剂，如乙醚或尿素混合，使相互已结合的抗原抗体复合物重新离解，而不破坏影响已包被在反应板、管、珠上的抗原或抗体的免疫反应功能。根据上述原理，配制了一种复合清洗液、解离标本中已结合到反应板上的相应抗体或抗原，恢复反应板再结合下一次被检物中的抗体或抗原的功能，其特异性、灵敏度不受影响。
本
发明内容
包括复合清洗液的组成及配比以及操作步骤。复合清洗液主要为硫酸、盐酸、醋酸中的任一种，浓度分别为0.25-1摩尔、0.5-2摩尔、0.5-2摩尔。在上述三种酸中还可分别加入乙醚(分析纯，加入量为酸量的1/25-1/30)、尿素(总浓度10-50g/L)，乙醚与尿素混合，三种中的任一种。用配制好的复合清洗液按下列步骤清洗用过的反应板a．把使用完的反应板中的反应液倒掉；b．加入300-400微升复合清洗液满反应孔，静置1-10分钟后倒掉；c．用PBS(硫酸盐缓冲液)洗3次，每次间隔15-30秒。在多次用复合清洗液进行清洗反应板，使其多次重复使用后，OD值会有所下降，操作时应略加大底物和延长孵育时间，并在测定时加入质控物。
实施例一，用厦门新创生产的抗-HIV试剂盒批号971113，按操作说明书，加底物显色时间到后，吸出阳性、阴性对照孔及检样显色孔，分别加入另一空白的酶标板内再加终止液、酶标仪测0D值，判断结果。原反应板，各孔加入复各清洗液(0.5摩尔H2SO4100ml+3ml乙醚)，注满反应孔静置5分钟倒去。再用PBS缓冲液洗涤3次，每次间隔30秒，即可用以测定下一批标本。如不在当时用此板，可放4℃冰箱保存，一周内结果不变，下次用时先拍干板，再按原法测定即可，循环二次以上，以后每次在最后一步加底物时每次较上一次多加5微升，放置时间延长3分钟，每次测定加1-2孔质控临界值参考来确定循环的次数。
实施例二、厦门新创抗HCV试剂盒，批号971110、按操作说明书、加底物显色时间到后，加终止液，酶标仪测OD值判断结果，之后即倾去原反应液，加入复合清洗液(0.5摩尔HCl100ml与3ml乙醚及3g尿素混合)满反应孔，静置10分钟倾去，反复一次，再用PBS缓冲洗涤3次、即可用以测定下一批标本，按原操作步骤测定即可。当时不用，可放4℃冰箱二周以内结果不变，每次加1-2孔质控物作参考来确定循环的次数。
实施例三、洛阳华美生物公司抗-HGV试剂盒，按操作说明书，加底物显色后加终止液、酶标仪测OD值，判断结果。之后即倾去原反应液，加入复合清洗液(0.5摩尔HCl+3g尿素)注满反应孔静置5分钟倾去，再用PBS缓冲液洗涤3次，即可以测定下一批标本。如不当时用，置4℃冰箱二周内结果不变，每次测定加1-2孔质控物，作参考来确定循环次数。以上各种方法的酶质结合物自配后要作预试验以确定最佳效价，底物等按一般常规法配制即可。
本发明同样适合于用ELISA方法制作的反应管和反应珠。本发明为所有使用ELISA方法的试验及诊断技术，开辟了充分利用资源、降低成本的新途径。由于配制的清洗液成本很低，制作方便、效果明显，将为广大医务单位所采用。
权利要求
1.酶联免疫吸附ELISA反应板的再生方法，其特征是用一种复合清洗液将使用过的ELISA反应板清洗，解离标本中已结合到反应板上的相应抗体或抗原，恢复反应板再结合下次被检标本中的抗体或抗原，复合清洗液主要为硫酸、盐酸、醋酸中的任一种，浓度分别为0.25-1摩尔、0.5-2摩尔、0.5-2摩尔。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫吸附ELISA反应板的再生方法，其特征是在上述酸中还分别加入乙醚(分析纯，加入量为酸量的1/25-1/30)、尿素(总浓度10-50g/L)，乙醚与尿素混合，三种中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫吸附ELISA反应板的再生方法，其特征是用配制好的复合清洗液按下列步骤清洗用过的反应板a、把使用完的反应板中的反应液倒掉；b、加入300-400微升复合清洗液满反应孔，静置1-10分钟后倒掉；c、用PBS(硫酸盐缓冲液)洗3次，每次间隔15-30秒。
4.根据权利要求3所述的酶联免疫吸附ELISA反应板的再生方法，其特征是在多次用复合清洗液进行清洗反应板，使其多次重复使用后，OD值会有所下降，操作时应加大底物和延长孵育时间，并在测定时加入质控物。
全文摘要
本发明涉及用酶联免疫吸附试验(ELISA法)临床诊断肝炎、爱滋病等病毒以及其它细菌、衣原体、原虫感染所使用的反应板、管、珠的再生重复使用方法及其相应技术。为了克服上述反应板用过一次不能再重复使用的缺点，配制了一种以硫酸或盐酸或醋酸为主再加入适量乙醚或尿素的复合清洗液，解离标本中已结合到反应板上的相应抗体或抗原，恢复反应板再结合下一次被检物中的抗体或抗原的功能，其特异性、灵敏度不受影响。
文档编号G01N33/53GK1239225SQ9811135
公开日1999年12月22日 申请日期1998年6月12日 优先权日1998年6月12日
发明者徐树良 申请人:南京红十字血液中心