专利名称：霍乱一步法两价快诊试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用以检测霍乱弧菌的快速诊断试剂。
霍乱是由霍乱弧菌引起的急性传染病，它以发病急，传播快，波及范围广为特征，给人类生命健康造成极大威胁。从1871年至今的100多年内，全球范围已引发过7次由O1群霍乱弧菌感染的霍乱大流行，夺去了成千上万人的生命，特别是1961年开始的第七次大流行，波及五大洲的140多个国家和地区，历时30多年，至今势头未减。而在1992年，印度和孟加拉国又发生了由O139群霍乱弧菌引起的霍乱，并于1993年后在十几个国家和地区流行或发生输入性病例。O139群霍乱弧菌有无引发新的世界性大流行的可能性，已引起全世界范围内广泛关注。常规的霍乱诊断多采用细菌分离鉴定法，虽然具有特异、敏感的优点，但是需要十几个小时才能得到结果。近年来报导的一些快诊方法，一般也要4-6小时做出诊断报告，并且需要比较精密的仪器设备，价格昂贵，不利于在临床和防疫现场推广普及。目前，本发明所涉及的技术，国内外尚未见有报道。
本发明的目的，旨在发展一种特异、快速、方便的检测O1群和O139群霍乱弧菌的方法，为霍乱的疫情报告和防治工作提供便利条件。
本发明是由一次性纸条、标本稀释液及说明书组成的，可一次性同时检测O1和O139群霍乱弧菌，其内容要点如下1、一次性纸条是一种根据需要设计不同规格的膜片，每片包装在一个密闭的小塑料袋内，里面附有吸水材料以保持干燥。
①生物制剂的制备包括抗O1霍乱弧菌脂多糖(LPS)群特异性因子(A因子)的单克隆抗体、抗O139群霍乱弧菌脂多糖单克隆抗体、兔抗O1及O139霍乱弧菌血清(多抗)及兔抗鼠血清(多抗)的制备，以及单抗和多抗的提纯(提取免疫球蛋白IgG)和胶体金制备及标记单克隆IgG等。
②试纸条的构建根据功能的不同，可将试纸条分为三个部分(图1)。上段为手持部位(图1-Ⅰ)，中断为实验反应区(图1-Ⅱ)下段为吸水区(图1-Ⅲ)。试纸条的支持部分(图2-g)采用硝酸纤维膜(NC)制成。实验反应区内有三条用生物制剂标记的条带，其中a为兔抗鼠IgG,b为兔抗O1群霍乱弧菌多抗IgG,c为兔抗O139群霍乱弧菌多抗IgG。d处于吸水区的最上端，为胶体金标记的抗O1群和抗O139群霍乱弧菌的单抗IgG。e为吸水材料，覆盖在胶体金标记的抗O1群和抗O139群霍乱弧菌的单抗IgG上面。以上抗体的使用浓度均为1∶50u～1∶250u，使用量50～100μl/条带。在各条带的标记完成后，用1％小牛血清白蛋白封闭硝酸纤维膜。手持部位f为一层不透水的材料覆盖着。
2、标本稀释液配制它具有稀释样品及裂解细菌的功能，其使用浓度为0.05M Tris(三羟甲基氨基甲烷、缓血酸胺)；0.05MEDTA(乙二胺四乙酸二钠)；0.1MNaCL(氯化钠)pH8.23、使用操作步骤①用灭菌牙签挑取患者的新鲜吐泻物(大多为粪便)约0.5克(3mm×3mm)，置于灭菌的小杯内，加入2ml标本稀释液。
②盖紧杯盖，将小杯上下强烈振摇10次以上，让标本内的细菌充分裂解。
③启开试纸条的包装袋，将一次性试纸按上面箭头所指方向浸入小杯内，使下段吸水部分完全浸没在标本液中，30秒后取出。
④计时观察结果在5～10分钟内，凡试纸中断实验反应区出现两条以上玫瑰红色反应带的视为阳性结果。两条带表明所测样品内有O1或O139群霍乱弧菌存在；三条带表明样品为两种菌的混合感染，但这种情况临床上不多见；如仅出现一条反应带，则视为阴性结果，表明样品中无霍乱病原菌(或其浓度过低)；如在10分钟内无任何玫瑰红色带出现，可能是操作有误或试剂失效，应予重视。整个反应过程均应避免阳光直接照射。
本发明的优点和积极效果在于使用方便，勿需特殊运输保存条件，操作时直接使用患者吐泻物做标本，不用任何附加仪器设备；诊断快速，只需10分钟即可测出O1或O139群霍乱弧菌，使霍乱疫情能得到及时报告处理，尤其对海关港口检疫更加行之有效；特异性强，具有单克隆抗体的高度专一性。
图1两价霍乱一步法快诊试纸条俯视图其中Ⅰ-手持部位Ⅱ-实验反应区Ⅲ-吸水区a-兔抗鼠IgGb-兔抗O1群霍乱弧菌多抗IgGc-兔抗O139霍乱弧菌多抗IgG图2两价霍乱一步法快诊试纸条侧剖视图其中d-胶体金标记的抗O1群和抗O139群霍乱弧菌的单抗IgGe-吸水材料f-手持部位不透水材料g-硝酸纤维膜制成的支撑部分
权利要求
1.霍乱一步法两价快诊试剂盒，其特征是它由一次性试纸条、标本稀释液及说明书组成，可一次同时检测O1和O139群霍乱弧菌。
2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征是一次性试纸条实验反应区内用生物制剂标记显色条带，其中a为兔抗鼠IgG,b为兔抗O1群霍乱弧菌多抗IgG,c为兔抗O139群霍乱弧菌多抗IgG。
3.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征是一次性试纸条吸水区内最上端为标体金标记的抗O1和抗O139群霍乱弧菌的单抗IgG。
4.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征是标本稀释液由三羟甲基氨基甲烷、缓血酸胺、乙二胺四乙酸二钠和氯化钠(偏碱条件下)配制而成，用以稀释样品和裂解细菌。
5.按照权利要求1、2、3、4所述的试剂盒，其特征是判断检测结果应按以下步骤进行1)将试纸条按箭头所指方向进入经标本稀释液稀释、裂解的标本中，30秒种后取出；2)试纸条中段实验反应区出现两条以上玫瑰红色反应带者视为阳性结果，表明所测样品内有O1或O139群霍乱弧菌存在；3)实验反应区出现三条带时，表明所测样品为两种菌O1和O139的混合感染；4)如果实验反应区仅出现一条反应带，则视为阴性结果，表明所测样品中无霍乱病原菌或其浓度偏低；5)如在10分钟内无任何玫瑰红色带出现，则视为操作有误或试剂失效。
全文摘要
本发明涉及的检测霍乱弧菌的快速诊断试剂,主要由一次性试纸条和标本稀释液组成,前者的实验反应区内有三条用生物制剂标记的条带,吸水区上端为胶体金标记的抗霍乱弧菌的单抗IgG,各条带的标记完成后,用小牛血清白蛋白封闭硝酸纤维膜,使用时将试纸条浸入经标本稀释液稀释并裂解的标本中,经过一定时间,根据出现玫瑰红色条带的数目判断检测结果,具有方便、快速、特异性强之优点。
文档编号G01N33/53GK1224165SQ98123359
公开日1999年7月28日 申请日期1998年12月15日 优先权日1998年12月15日
发明者刘端, 张树波, 孟凡亮 申请人:中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所