检测分子结合作用的方法和仪器的制作方法

专利名称：检测分子结合作用的方法和仪器的制作方法
交叉参考相关申请本申请要求了1998年2月2日提交的美国临时专利申请第60／073445号的优先权，发明名称是“在导电体表面上测定分子结合作用”。
本发明的背景技术基本上所有生物制药领域都需要一种检测化学和生物化学反应和测定具体分析对象的存在和量。这种需要范围自在那里拟定出生物化学途径以及它们相应于疾病发生的功能的实验室基础科学研究到在那里对患者日常监测临床相关分析指标的水平的临床诊断。其它领域包括药物研究，军事应用，兽医，食品和环境应用。在所有这些情况下，需要测定具体分析物或者一组分析物的存在和量。
对于在化学，生物化学，生物技术，分子生物学和各种各样其它学科领域中的分析，检测一种或几种分子结构的存在和测定结构之间的结合通常是有用的。所感兴趣的分子结构一般包括但不限于细胞，抗体，抗原，代谢产物，蛋白质，药物，小分子，蛋白质酶，核酸和其它配体和分析物。在药物中，例如，测定自然存在于生理体液或者引入到该系统中的细胞组成例如受体或细胞因子，或者作为各种疾病进程的标记物的抗体和抗原的存在是非常有用的。另外，DNA和RNA分析在诊断，遗传测定和研究，农业和药学开发中是非常有用的。由于分子细胞生物学快速发展和正常和疾病系统的理解，越来越需要不需要标记物例如荧光团或放射性同位素的检测方法，其实现对所感兴趣的分子特异性的定性和定量的高敏感和相对简单的测定。
在过去开发出了多种符合这些领域要求的方法。例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，多种荧光测定，质谱，显色分析，凝胶电泳，以及更具体化测定的宿主。这些测定技术的大多数需要特殊的制剂，特别是接触一种标记物或者高度纯化和扩增要测定的样品。为了测定配体和抗配体之间的结合作用，需要一种与结合的存在或程度相关的可检测信号。通常由一种或者与所感兴趣的配体或者与抗配体结合的标记物提供信号。产生可检测信号并且对其存在合适的信号的物理或化学作用包括放射性，荧光，化学发光，磷光和酶活性等等。然后通过分光光度学，放射学或光学跟踪方法可以测定标记物。令人遗憾的是，标记一种或所有的需要特定分析的分子是困难的甚至是不可能的。并且标记物的存在可能会使得两种分子之间的分子识别没有功能，原因是多方面的，包括位阻效应。另外，这些标记方法中没有一个测定结合作用的精确性质，例如活性位点与受体结合与非活性位点结合例如变构结合是不能区分的，这样通过现有的检测方法不能获得功能信息。因此即消除对于标记物的需要又获得功能信息的检测结合作用的方法将大大改良上述方法。
研究生物化学体系的其它方法使用了各种类型的电介质测定来表征生物体系例如组织样品和细胞系统的类型。在50年代，使用用于测定那时已知的材料的电介质性质的的标准技术进行了实验来测定生物组织的电介质性质。从那时起，进行这些测定的各种方法包括频率功能域测定，和时间功能域技术例如时间功能域电介质光谱。在这些方法中，实验一般使用各种类型的同轴传输线或者其它传输线和一般在材料的电介质表征中使用的结构进行。这包括研究考虑广谱范围生物体系的电介质性质的应用和关系所感兴趣的遍布取自哺乳动种类类各种器官的组织样品，至包括细胞膜的细胞系统和亚细胞系统和细胞器作用。最近，试图将上述技术小型化(参见，例如美国专利5653939；5627322和5846708)以改进分子体系的电介质性质中的变化。典型地，这些使用生物样品-其是组织，细胞系统或分子系统-作为电路技术中的分路或系列元素。该组合具有几个缺点，包括测定策略中可使用的频率的一定程度上的基本限制和对测定分子体系的灵敏性的极度限制。
一般情况下，大多数测定系统的特异性和灵敏性范围存在限制。细胞碎片和非特异性结合经常使得测定有干扰，使得难以或者不可能获得精确有用的信息。如上所述，一些系统太复杂以致于不能使标记物结合所有的所感兴趣的分析物，或者进行精确的光学测定。此外，如上所述，这些检测技术的大多数对结合作用的功能性质不能获得信息。实现实践和经济上的普遍性，其可以在实际时间里不需要标记物就可以直接监测分析物或内含物的存在，在给定系统中实际发生的结合作用的功能和类型将代表显著的惊人进步。
更具体地说，生物制药工业需要一种普遍改进的平台技术，其对于各种各样的以水为基础的或者其它以液体为基础的生理系统，例如核酸结合，蛋白质与蛋白质之间的相互作用，小分子结合，以及其它所感兴趣的化合物，具有非常广阔的应用。理想地，测定应该不需要高度特异性探针，例如特异性抗体和精确互补的核酸探针；应该能够在自然环境下工作，例如全血，胞质混合物，以及其它自然存在的系统；它应该通过测定分子的本身性质来操作，而不需要另外的标记物或跟踪物来实际监测结合作用；在某些应用中，应该能够对于结合作用的本质提供一些期望的信息，例如给定的化合物是否作为一种拮抗剂或抗拮抗剂对特定的药物受体起作用，而不只是有作为指示结合作用是否发生的标记物功能。对于很多应用，应该是高度小规模的和高度平行的，使得可以设计出复杂的生物化学途径，或者可以在药物筛选方法中使用非常小量和大量组合的化合物。在很多应用中，应该还能在实际上监测一系列复杂反应，使得几乎可以立即获得精确动力学和亲和性信息。可能最重要的是，对于大多数商业应用，其应该成本低而且容易使用，有少量样品制备步骤，可提供电子学的易处理的成分，例如可以用于测试然后弃除的用于生物测试的表面试条，并且非常适合广范围的测试应用。
注意其它工业对于检测，鉴定或者其它分析有着同样的需要这一点是重要的。大多数应用涉及生物分子的使用，如果具体结合对象是可以得到的或者如果分子本身可以接触下面所描述的表面，则基本上可以测定任何分子。
本发明满足上面讨论的很多需要以及其它需要。
本发明概述本发明提供应用结合的分子结构的独特的电介质性质和局部环境，在具体的生物系统中，测定分子结合作用和其它环境作用，并且还鉴定分子种类的存在和浓度，以及局部环境的物理性质的系统和方法。
在本发明的第一个实施方案中，测定分子结合作用的方法包括提供信号电路和沿着该信号电路形成的分子结合层的步骤。试验信号沿着信号电路传导并且与分子结合层耦合。在对耦合的响应中，信号表现出即是分子结合作用又是分子结合层本身的指征的响应。
在本发明的第二个实施方案中，给出了测定未知配体类别的方法。该方法包括提供与第一分子结合层连接的信号电路步骤，所述第一分子结合层具有结合N个相关的配体亚结构的N个相关的抗配体。接着对所述分子结合层施用包括一些未知配体的溶液。相应地，沿着信号电路形成第二分子结合层，该第二分子结合层具有N个配体。N个相应的试验信号传导给N个相应的配体。提供确定已知配体种类的N个信号响应。最后，每个试验信号连接N个配体／抗配体复合体，各个表现出N个相应的测定的表明各个所述N个亚结构存在的响应，使得如果预先测定的所述数目的N个已知信号响应在预定范围与N个测定的响应相关联，则测定该配体是在已知的类别之内。
在本发明第三个实施方案中，提供用于鉴定未知分子结合作用的方法。该方法包括提供信号电路，通过使含有第一种配体的第一种溶液经信号电路并且相应地沿着该信号电路形成第一分子结合层的步骤，从而第一分子层包括第一配体并且沿着信号电路和第一种溶液定位。第一试验信号沿着信号电路传导，其部分包括包括连续传导线的分子结合层，靠着它，信号连接该分子结合层并且相应地显示第一信号响应。提供了相应于一种已知分子结合作用的已知信号响应，然后将第一信号响应与已知信号响应相比较，如果第一信号响应在预定范围与已知信号响应相关联，则未知分子结合作用包括已知的分子结合作用。
在本发明的第四个实施方案中，提供了定量测定溶液中配体的未知溶液的方法。该方法包括提供信号电路，其连接具有至少一个抗配体的第一分子结合层，将具有已知配体浓度的溶液施用到分子结合层，并且沿着信号电路传导试验信号。接着测定第一信号响应并且用外推规则系统。接着传导第二试验信号并且测定第二信号响应。并且使信号响应与规则系统相关联。
在本发明的第五个方面，提供了用于测定溶液中配体的存在的生物电学界面。所述生物电学界面包括信号电路，提供配体和分子结合层的溶液。所述分子结合层包括配体并且沿着信号电路和溶液连接。
在本发明的第六个方面，提供了用于使用试验信号的测定与分子结合层相关的一种或几种性质例如配体的存在的生物测试装置。所述装置包括具有用于传输试验信号的第一步分和第二部分的信号电路，和相互之间连续的导电区。所述生物测试装置进一步包括分子结合层，其可以具有配体并且其连接信号电路。所述生物测试装置可以进一步包括连接所述分子结合层的溶液，其可以将配体运送给分子结合层。
在本发明的第六个方面，提供了检测分子结合作用的系统。所述系统包括发出试验信号的信号源，与所述信号源连接的生物测试装置和与生物测试装置连接的第二检测器。该生物测试装置包括信号电路和第一分子结合层，其可以包括一种配体或抗配体并且其可以与一种溶液和信号电路连接。试验信号沿着信号电路传导，其连续遍布分子结合层区，并且与分子结合层连接，并且相关地显示信号响应，其指示所述分子结合作用的存在。
在一个方面，本发明是电磁辐射，一般在大约1MHz和1000GHz之间，与分子结合层中的分子结构的相互作用在测定所述结构性质中的应用，所述性质是例如电介质性质，结构性质，结合作用等等。而且，本发明使用生物电学界面上的试验信号，所述界面具有信号电路，沿着该信号电路，分子结合层与其中的测定分析物连接。
参照下面的附图和详细的说明将更好地理解本发明的性质和优点。
附图的简要描述

图1A图示说明根据本发明生物测试系统的一个实施方案。
图1B图示说明根据本发明生物测试系统的第二个实施方案。
图1C图示说明图1B中的生物测试系统的剖面图。
图1D图示说明根据本发明分子结合层的一个实施方案。
图1E图示说明根据本发明特殊分离的具有多抗配体的分子结合层的一个实施方案。
图1F图示说明根据本发明的具有多种类配体的分子结合层的一个实施方案。
图1G图示说明根据本发明的包括一个或多个细胞的分子结合层。
图1H图示说明根据本发明的包括细胞膜和膜相关结构的分子结合层。
图2A图示说明根据本发明生物测试装置的一个实施方案。
图2B图示说明根据本发明生物测试装置的第二个实施方案。
图3图示说明沿着生物电界面的传导层发生的结合表面化学的一个实施方案。
图4A图示说明图2A所示的生物电界面结构的相当的电路模型的一个实施方案。
图4B图示说明相应于图4A所示的相当的电路模型的电路一个实施方案。
图4C图示说明图2B所示的生物电界面结构的相当的电路模型的一个实施方案。
图4D图示说明相应于图4C所示的相当的电路模型的电路一个实施方案。
图5A-5G图示说明根据本发明的两个导体电路中实现的生物电界面的具体实施方案。
图6A图示说明根据本发明用于测定分子结合作用的方法的一个实施方案。
图6B图示说明根据本发明用于测定二级和高级结合作用的方法的一个实施方案。
图6C图示说明根据本发明用于测定分子结合层的电介质变化的方法的一个实施方案。
图6D图示说明根据本发明用于鉴定未知溶液中配体的方法的一个实施方案。
图6E图示说明根据本发明用于鉴定配体的类别的方法的一个实施方案。
图6F图示说明根据本发明用于定量测定溶液中配体浓度的方法的一个实施方案。
图6G图示说明根据本发明提供具有自诊断能力的生物测试装置的方法的一个实施方案。
图7A图示说明执行为实现图6A-G所示方法的每一个所设计的软件程序的计算机系统的一个实施方案。
图7B图示说明用来执行上述方法中的软件程序的典型计算机系统的程序块简化系统。
图8A图示说明根据本发明的频率测定系统的一个实施方案。
图8B图示说明根据本发明的可以用来测定或鉴定分子结构的测定的第一频率响应。
图8C图示说明根据本发明的可以用来测定或鉴定分子结构的第二频率响应。
图9图示说明根据本发明的频率测定系统的第二个实施方案。
图10图示说明根据本发明的时间范围测定系统的一个实施方案。
图11图示说明根据本发明的电介质衰减测定系统的一个实施方案。
图12A-B分别图示说明尿激酶对于ITO表面一级结合的回程损耗和传导损耗测定。
图12C和12D图示说明胶原酶和溶菌酶一级结合作用的传导损耗测定。
图12E图示说明结合的和未结合的葡聚糖的传导损耗响应。
图12F图示说明与葡萄糖未结合的和结合的con-A的响应。
图12G图示说明相对于抗生物素蛋白响应的生物素／抗生物素蛋白的传导损耗。
图12H图示说明葡聚糖和葡萄糖之间的竞争滴定的结果。
图12I图示说明con-A的回程损耗作为响应时葡萄糖浓度的函数。
图12J图示说明相对于聚赖氨酸响应的DNA／聚赖氨酸复合体的传导损耗。
图12K图示说明在100MHz，1GHz和10GHz时作为一系列缓冲液的pH的函数的传导损耗响应的变化。
图12L图示说明在100MHz，1GHz和10GHz时作为一系列缓冲液的离子浓度的函数的传导损耗响应的变化。
图12M图示说明指示复合体环境中测定能力的1GHz时探测的全血的10个样品的传导损耗响应。
图12N图示说明指示四极矩测定的生物素结合的结果。
优选实施方案的描述内容表I．术语的定义II．导论A．生物测试系统B．系统化学III．生物测试装置A．装置结构B．结合表面化学C．生物电界面D．具体实施方案IV．测定方法A．一般性综述B．测定分子结合作用C．测定电介质性质变化D．鉴定分子结合作用E．鉴定结合的分子结构的类别F．定量测定浓度G．生物测定装置自校正V．测定系统A．频率测定系统
B．时间范围测定系统C．电介质衰减测定系统VI．实施例VII．应用I．术语的定义如这里所使用的，生物学术语“结合配偶体”或“配体／抗配体”或“配体／抗配体复合体”指特异性识别(例如结合)其它分子形成结合复合体例如抗体-抗原，凝集素-碳水化物，核酸-核酸，生物素-抗生物素蛋白等等的分子。生物结合配偶体不需要局限于单个分子对。因此，例如，单配体可以通过两个或多个“抗配体”的共同作用而结合。
如这里所使用的，术语“配体”或“分析物”或“标记物”指测定的任何分子。通过其与抗配体的相互作用来测定，其特异性地或非特异性地结合配体，或者通过配体的特征性电介质性质来测定。配体一般定义为对其存在由于对所述配体的某些部分的识别而特异性地或非特异性地结合所述配体的另一个分子(即抗配体)的任何分子。抗配体，例如可以是一种抗体和配体分子，例如特异性结合抗体的抗原。在抗原与表面结合并且抗体是要检测的分子的情况下，为了本发明的目的，抗体成为配体并且抗原是抗配体。配体还可以包括细胞，细胞膜，细胞器及其合成类似物。
用于实施本发明的合适的配体包括但不限于抗体(形成抗体／表位复合体)，抗原，核酸(例如天然的或合成的DNA，RNA，gDNA，cDNA，mRNA，tRNA，等等)，凝集素，糖(例如形成凝集素／糖复合体)，糖蛋白，受体和它们的相关配体(例如生长因子和它们的相关的受体，细胞因子和它们相关的受体，信号受体等等)，小分子，例如候选药物(或者来自天然产物或者在组合实验室开发和贮存的合成类似物)，代谢产物，滥用药物和它们的代谢副产物；辅助因子，例如维生素和其它天然存在的和合成的化合物，生理体液中发现的氧和其它气体，细胞成分，细胞膜和相关的结构，植物和动物源中发现的其它天然产物，其它部分或完全合成的产物等等。
如这里所使用的，术语“抗配体”指特异性或非特异性结合其它分子(即配体)的分子。通过其与其特异性结合的配体的相互作用或者通过其自身特征性电介质性质来测定抗配体。如这里所使用的，抗配体通常固定在表面上，或者单独地或者作为固定在表面上的结合配偶体的成员。在一些实施方案中，抗配体可以由信号电路或导体表面上的分子组成。或者，一旦抗配体与配体结合，得到的抗配体／配体复合体可以被认为是用于下面的结合目的的抗配体。
如这里所使用的，术语“特异性结合”当指蛋白质或多肽，核酸，或者受体或者这里所描述的其它结合配偶体时，指是蛋白质和／或其它生物物质异源种群中所感兴趣的相关配体的决定因素的结合反应。因此，在指定条件下(例如抗体情况下的免疫测试条件)，具体的配体或抗体结合其特定的“靶物”(例如激素特异性结合其受体)，并且不以明显量结合样品中存在的其它蛋白质或者结合配体或抗体可以在来自生物体的器官或样品中接触的其它蛋白。类似地，核酸可以在预先选择的条件下相互杂交。
如这里所使用的，术语“分离的”，“纯化的”或“生物纯的”指实质上或基本上没有其天然状态发现的天然伴随成分的物质。
如这里所使用的，术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，除非另有说明，包括可以以天然存在的核苷酸相同的方式起作用的天然核苷酸已知类似物。
如这里所使用的，术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一种或几种氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸，以及天然存在的氨基酸聚合物的人工合成的化学类似物。
如这里所使用的，术语“抗体”指实质上免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。识别的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε，μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为α，γ，δ，ε或μ，其接着分别定义为免疫球蛋白IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元已知包括四聚体。各个四聚体由两个多肽链的相同的对组成，各个对具有一条“轻”链(大约25kD)和一条“重”链(大约50-70kD)。各条链的N-末端定义了主要起抗原识别作用的大约100-110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体作为完整的免疫球蛋白或者作为多种用肽酶消化而产生的表征充分的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区二硫键处消化抗体产生F(ab)’2，其是Fab的二聚体，其自身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和的条件下还原裂解铰链区二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是带有部分铰链区的Fab(参见，Fundamental Immunology，W．E．Paul，编著，Raven Press，N．Y．(1993)，更详细描述其它抗体片段)。各种各样的抗体片段定义在术语完整抗体的消化中，本领域技术人员理解这样的Fab’片段可以是从头化学合成的或者通过使用重组DNA方法合成。因此，如这里所使用的术语抗体还包括或者通过全抗体的修饰产生的抗体片段或者使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。优选的抗体包括单链抗体，更优选单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接地或者通过肽连接体)形成连续的多肽。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH∷VL杂二聚体，其可以从包括或者直接连接或者通过编码肽的连接体连接的VH-和VL-编码序列的核酸表达。Huston，等，(1988)，Proc．Nat．Acad．Sci．USA，855879-5883。将天然聚集的-但是化学分离的抗体V区的轻和重多肽链转化为将折叠成三维结构的scFv分子的多种结构基本上类似于抗原结合位点的结构。参见美国专利No．5091513和5132405和4956778。
“抗原结合位点”或“结合部分”指参与抗原结合的免疫球蛋白分子部分。重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成抗原结合位点。重链和轻链的可变区内的高度分支的片段称之为“高变区”，其插入在已知为“构架区”或“FRs”的更加保守的侧翼序列之间。因此，术语“FR”指邻接免疫球蛋白高变区和免疫球蛋白高变区之间天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区以相互之间三维空间排列以形成抗原结合“表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。各个重链和轻链的三个高变区称之为“互补决定区”或“CDRs”，并且例如由Kabat等人鉴定，Sequences of proteins of immunologicalinterest第4版，U．S．Dept．Health and Human Services，Bethesda，MD(1987)。
如这里所使用的，术语“免疫结合”和“免疫结合性质”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异性结合的抗原之间存在的非共价相互作用类型。如这里所使用的，生物样品是用于所感兴趣的分析物测试的健康和／或病理状态的生物组织或液体的样品。这样的样品包括但不限于痰，羊水，血液，血细胞(例如白细胞)，组织或细针活组织检查样品，尿，腹膜液，和胸膜液，或其中的细胞。生物样品还可以包括组织切片，例如为了组织学目的的冷冻切片。尽管样品一般取自人患者，但是测试可以用来测定来自任何哺乳动物例如狗，猫，绵羊，牛和猪的样品中所感兴趣的分析物。可以根据需要，通过在合适的缓冲溶液中稀释或如果需要浓缩来预处理样品。可以使用多种标准缓冲水溶液，使用多种缓冲液中的一种，例如磷酸盐，Tris，或者类似物，优选在生理pH下使用。
如这里所使用的，术语“信息途径”指沿着生物电界面的传导介质，所述界面能支持包括DC静电领域的任何有用的频率的电磁信号。非消耗信号电路包括导体和电介质波导结构，多导体传导介质，例如横向电磁(TEM)传导线，具有支持TE，TM或TEM模式传导的三个或多个导电体元件的传导线，例如四极和八级线，耦合的波导，可能耦合或可能不耦合的谐振腔结构，其它不典型结构如电线，印刷回路和其它分布的回路和阻电团导电体结构等等。所述信号电路结构上可以包括信号信号平面，地平面或者两种结构的组合。典型地，信号电路沿着对于MBL表面是非垂直的方向形成。在其中信号电路由导电体层或区组成的实施方案中，所述导电体区连续延伸过该范围。在其中信号电路是非金属的，例如电介质波导的实施方案中，所述信号电路定义为具有最少量信号丢失的途径或者定义为具有大于3mhos／m导电性的途径。
如这里所使用的，术语“分子结合层”或“MBL”指具有至少一种与沿着生物电界面的信号电路连接的分子结构(即分析物，抗配体或配体／抗配体对等)的层。分子结合层可以包括一种或几种配体，抗配体，配体／抗配体复合体，连接体，聚合物基质和其它物质，或者这里所描述的其它分子结构。此外，分子结合层可以非常不一样并且可以包括一种或多种成分，包括基质层和／或绝缘层，其可以具有一个或多个结合基团。MBL或者通过直接或者非直接物理连接或者当配体从信号电路物理分离时通过电磁耦合与信号电路连接。MBL可以是衍生化表面，例如通过硫连接体生物素化金属等等，都是根据本领域标准实践。
如这里所使用的，术语“结合作用”指最小的两个分子结构例如配体和抗配体之间的相互作用或相关性。当两种分子结构直接或非直接物理接触时或者当两种结构物理分离但是之间电磁耦合时可以发生这种相互作用。药学概念上所感兴趣的结合作用的实施例包括但不限于配体／受体，抗原／抗体，酶／底物，DNA／DNA，DNA／RNA，RNA／RNA，核酸错配，互补核酸和核酸／蛋白质。或者，术语“结合作用”可以指这里所描述的与信号电路结合的单分子或分子结构，例如配体或抗配体／配体复合体。在这种情况下，信号电路是第二分子结构。
如这里所使用的，术语“配体／抗配体复合体”指与抗配体结合的配体。结合可以是特异性的或非特异性的，键一般是共价键，氢键，免疫结合，范德瓦耳力或者其它类型的结合。
如这里所使用的，术语“偶联”指或者通过直接或非直接物理连接或者通过信号连接的任何形式，例如静电或电磁偶联，两种结构之间的能量的转移。
如这里所使用的，术语“试验信号”指电磁谱内定义的任何使用的频率的信号传导。例如，试验信号频率在或者高于1MHz，例如5MHz，10MHz，20MHz，45MHz，100MHz，500MHz，1GHz，5GHz，10GHz，30GHz，50GHz，100GHz，500GHz，1000GHz和这之间的频率范围。
如这里所使用的，术语“酶”指作为催化剂起作用以减少其它化合物或“底物”化学反应的激活能量的蛋白质，但不是反应的最终产物。
如这里所使用的，术语“溶液”包括其中有配体的物质。非限制性溶液录包括固体，液体或气态物质。固体溶液可以由天然存在的或者合成的分子组成，包括碳水化合物，蛋白质，寡核苷酸或者任何有机聚合物，例如尼龙，人造纤维，聚丙烯，特氟纶，氯丁橡胶，delrin等等。液体溶液包括含有含水的，有机的或者其它一级成分，凝胶，气体和乳液的那些。例举的溶液包括纤维素，葡聚糖衍生物，d-PBS水溶液，Tris缓冲液，去离子水，血液，生理盐水，脑脊液，尿，唾液，水，有机溶剂。这里所使用的溶液指其中配体和／或抗配体被施用到结合表面的物质。溶液含有要分析的样品。
如这里所使用的，术语“连接基团”或“连接体”指用来接触生物测试装置上任何两种成分的化学结构。因此连接基团具有结合一种成分例如导电体表面的第一结合部分，和具有结合另一种成分例如基质或抗配体的第二结合部分。
如这里所使用的，术语“生物测试装置”指其中形成分子结合层的结构。生物测试装置可以由表面，凹面组成或者是密封的，它们都可以是任何特殊大小或形状。
如这里所使用的，术语“生物测试系统”指与电磁探测和检测生物测试装置的必需成分连接的如上所述的生物测试装置。这些成分包括但不限于信号电路，底物，电子装置，例如信号发生器，示波器，和探测和检测来自生物测试装置的信号所必需的载体分析物，可以探测和检测电磁信号和分析物数据的微芯片，微信息处理机等等。
如这里所使用的，术语“谐振”或“共振”一般指作为频率函数的快速变化的电介质响应。
如这里所使用的，术语“生物电界面”指支持试验信号和分子结合层传导的信号电路之间的界面结构。
如这里所使用的，术语“基质”或“结合基质”指生物测试芯片上的物质层，所述芯片用作间隔臂或者增强结合所获得的表面积或者优化增强的结合的分子的取向，或者增强结合的任何其它的性质，使得优化生物测试装置。基质层可以由碳水化合物组成，例如葡聚糖，聚氨基酸，交联的和非交联的蛋白质等等。
II．导论A．生物测试系统本发明应用了大量分子可以在大多数分子所具有的独特的电介质性质的基础上加以区分的发现。这些明显不同的电介质性质可以通过偶联信号和结合的分子结构来发现。独特的电介质性质调制信号，使其具有独特的信号响应。独特的信号响应然后可以用来检测和鉴定组成分子结合层的配体和其它分子。
图1A图示说明根据本发明的生物测试系统100的一个实施方案。系统100说明了两个导电体，信号平面，地平面，可以在多个构造中实现的电路布局，包括微波传输带，微波条状线，共面波导，跟踪线或同轴线系统中集中或分散的元件电路。此外，电学领域技术人员容易理解该系统可以容易地改变成单一导体波导系统，或者三个或多个导体系统。
如图所示，系统100包括信号源110，传导线120，地平面130，生物测试装置150，和信号检测器160。图示的实施方案给出与生物测试装置连接的两条传导线120，但是可替换的实施方案中，单一的传导线可以连接生物测试装置150，或者，三条或多条传导线可以连接生物测试装置150。传导线120是从可以支持信号以期望的操作频率传导的材料形成的。使用常规光刻石印术或者半导体加工技术，将传导线120制成为一层导电层，例如沉积在一种底物上的金，所述底物例如氧化铝，金刚石，蓝宝石，聚酰亚胺或者玻璃。
系统100进一步包括与传导线120连接的生物测试装置150。生物测试装置150包括导电层153沉积在其上的支持底物151。导电层153形成支持试验信号传导的界面。支持底物151可以包括任何绝缘材料，例如玻璃，氧化铝，金刚石，蓝宝石，硅，镓氧化砷或者在半导体加工中使用的其它绝缘材料。分子结合层(MBL)156与一处或多处界面传导线153连接。如本领域技术人员将会理解的，或者通过如图所示的界面传导线153和MBL156之间的直接连接，或者通过下面进一步描述的信号耦合，可以发生连接。
MBL156主要由一种或多种配体组成，但是如这里所述，也可以包括其它分子和结构。MBL156可以只是由一层结合的配体组成，例如在初次结合的基础上，或者它可以由两层，三层，四层或多层结合的配体组成，在这些情况下，发生二级或较高级结合作用发生。多层配体可以沿着相同的界面传导线153在不同的结合表面155存在。
在该图示的实施方案中，电介质底物158位于溶液157和地平面159之间。在该图示的实施方案中，电介质层158和地平面159位于生物测试系统150之内，但是在可替换的实施方案中，一者或两者可以位于外部。此外，MBL156和溶液157装置可以连通并且向地平面运动，或者在接近该界面传导线153的这些层之外。
系统100包括将试验信号发射到传导线120和向着生物测试装置150的信号源110。信号检测器160沿着传导途径放置来检测得到的信号(或者反射或者传导或者两者皆而有之)。当信号沿着生物测试装置150的界面传导线153传导时，MBL156的电介质性质调制试验信号。然后可以回收调制的信号并且用来检测和鉴定生物测试装置内发生的分子结合作用，下面进一步描述。
在本发明的一个可替换的实施方案中，当自界面传导线153物理分离时，这里所描述的配体，抗配体／配体复合体或者其它分子结构的检测和鉴定是可能的。在这种实施方案中，配体与界面传导线153分开但是与界面传导线153电连接或电磁连接。界面传导线153和待测的配体之间的连接将改变沿着界面传导线153传导的试验信号的响应，从而提供了检测和／或鉴定它的方法。界面传导线153和待测的配体之间的最大分离通过这样一些因素决定，例如界面传导线153和配体之间的介质的有效介电常数，总的连接面积，信号检测器的灵敏度，溶液中配体的浓度，和期望的检测时间。分开的距离一般在10-1m，10-2m，10-3m，10-4m，10-5m，10-6m，10-7m，10-8m，10-9m，10-10m数量级，或者其中的范围。
在一些实施方案中，例如细胞基础测试，MBL可以通过溶液与信号电路电磁连接。这样，细胞，特别是细胞膜和以细胞为基础的结构可以连接信号。
图1B图示说明了包括共振微芯片电路170阵列的生物测试系统的第二个实施方案。每一个共振电路170包括在开路头176中终止的传导线172。电路设计领域的技术人员将会理解在集成元件，分散元件或者两种电路布局技术的组合中可以使用其它共振结构。
图1C图示说明了一种共振电路170的剖面图。开路头176形成共振电路170的生物电界面和图1A所示的紧密平行生物电界面。特别是，开路头176由沉积在电介质层176b上的界面传导线176a组成，并且位于地平面176c之上。
在该实施方案中，MBL176d通过直接连接与传导线176a连接。MBL176d可以以特殊的或不特殊的方法沿着界面传导线连接。如上所述，主题分子结构可以从提供结合作用检测和鉴定信息的与界面传导线176a的电学连接或电磁连接推测。
界面传导线176a的尺度受下面考虑的影响，例如期望的测定时间(较大的面积导致快长的检测时间)，期望的共振频率fres，一些实现更高效率或者引起最显著结合作用的不连续性的电阻匹配条件，和通过它形成完全阵列的方法。例如，如果使用常规微波光刻石印术，使用相对厚的电介质层例如氧化铝，金刚石，蓝宝石，硅铁(duriod)或者其它常规底物材料，则结合表面积可以从10-1m2至10-6m2。或者，如果使用半导体加工，使用相对薄的硅或镓氧化砷电介质层，则结合表面积可以从10-6m2至10-12m2。
使用常规微波设计技术或者CAD方法，例如MicrowaveSpiceTM，EEsofTouchstone和LibraTM，则可以选择传导线172的尺度和位阻，传导线176a的尺度，和电介质层176b的厚度和介电常数，使得共振结构在期望的共振频率点fres表现出共振信号响应。期望的共振频率fres点一般是覆盖所感兴趣的分子在其电介质性质，使其可检测的测定上表现出惊人的变化的频率范围。或者，共振频率点fres可以定义为对于最宽范围信号检测所允许的期望的试验频率范围的中心。在该图示的实施方案中，共振频率fres包括10MHz，20MHz，45MHz，100MHz，500MHz，1GHz，5GHz，10GHz，30GHz，50GHz，100GHz，500GHz，1000GHz，或者其之间的范围的频率。
在测定中，对一个或多个开路头172施用溶液176e。当溶液中的一个或多个分子结合界面传导线176a时形成MBL176d。在该例子中，MBL176d和溶液电学行为是作为无源电路，下面进一步描述，其引起共振频率点fres在其源共振频率点之上或之下位移。频率中的这种位移可以检测，并且用来指示分子结合作用的发生。信号响应也可以以宽谱探测来确定结合的分子结构的鉴定，如下所述。可以装配各响应电路170以结合不同的分子结构，并且各响应电路170还可以固定地址，从而允许同时检测和鉴定相同溶液中大量的分子结构。在一个可替换的实施方案中，可以设计各响应电路170，表现出截然不同的响应频率，在这种情况下，可以以连续的频率谱检测所有的响应电路170，来测定分子结合。
B．系统的化学该系统的化学一般发生在生物测试装置中，特别是沿着导体层(图1A-1C中的界面传导线)。导体层可以由材料制备并且具有一定的形态，其对于支持该高频率试验信号的传导是导电的。用对期望的试验频率范围表现出合适的导电性并且具有如上所述好的分子结合性能的材料制备导电体表面。这样的材料包括但不限于金，氧化铟锡(ITO)，铜，银，锌，锡，锑，镓，镉，铬，锰，钴，铱，铂，汞，钛，铝，铅，铁，钨，镍，钽，铑，锇，铊或者它们的合金。导电体层也可以从半导体材料制备，所述半导体材料可以是晶体或者非晶形结构，包括化学涂层或者纯的碳，硅，锗，镓-氧化砷，idium-镓-氧化砷等等。所述导体材料也可以从聚合物制备，尤其是那些导电体，例如聚乙炔，聚噻吩等等。导电体层可以根据实施需要是厚的或者厚度只有几层分子。所述导电体层可以包括一层挥发性薄的金属层或者一外延层的镓-氧化砷或者通过已知的半导体加工技术使导电的其它半导体材料。另外，导电层可以被衍生化，其中方法是公知的，例如，参见Kumar等，“PattermedSelf-Assembled Monolayer and Mesoscale Phenomena”，Accounts ofCemical Research，28219-226(1995)。
另外从材料制备所述导体层并且具有对于有利于分子结合是导电的形态。配体可以直接结合，通过其它分子结构间接结合，或者通过两种构型与导电层结合。可以与导电层结合的分子范围包括但不限于蛋白质，核酸小分子，糖类，类脂类，和所感兴趣的任何其它分子。化学反应可以只是涉及与表面接触的单一分子种类，与表面接触的不同种类的全阵列，或者与表面直接接触的种类和溶液中所感兴趣的配体之间的多结合作用。
典型的化学反应涉及配体与导体层接触一般取决于配体和它所结合的抗配体的性质，以及它们在该测试中的功能。表面上可能发生的相互作用的可能类型包括但不限于蛋白质／蛋白质相互作用，DNA／蛋白质相互作用，RNA／蛋白质相互作用，核酸杂交，包括碱基对错配分析，RNA／RNA相互作用，tRNA相互作用，酶／底物系统，抗原／抗体相互作用，小分子／蛋白质相互作用，药物，受体相互作用，膜／受体相互作用，固相配体中的构象变化，蛋白质／糖类相互作用，和脂质／蛋白质相互作用。
在一个实施方案中，实际表面化学可以描述为一级结合和二级结合。也可以存在另外的分子结合层。一级结合指抗配体与导电体表面的接触，其可以通过借助于连接体分子来实现。二级结合指配体与抗配体的结合，其可以是MBL中另一种分子或者直接指导电体表面本身。一般情况下，该结合涉及液相配体与固定的固相抗配体结合。例如，一级结合可以是特异性抗体与生物测试装置的导电体层的接触和二级结合可以涉及样品溶液中的特异性抗原与抗体的结合。或者，二级结合可以是蛋白质与导电体表面的直接接触，例如蛋白质的胺末端与金导电体层直接接触。
上述结合导致分子结合层(MBL)180沿着一处或多处导电体层形成，其一个实施方案在图1D中图示说明。在该实施方案中，MBL180任意地由第一连接体181，绝缘体182，第二连接体183，基质184，第三连接体185，抗配体层186和配体层187组成。
第一连接体181提供绝缘体层182和导电体层(没有图示)之间的接触。第一连接体181由硫醇，胺类，酰胺或者金属例如铬或钛这样的分子组成。绝缘体层182提供导电体层和MBL180和溶液(没有给出)之间的屏障。绝缘体层182可以提供密封屏障以防止导电体层由于暴露给MBL和／或溶液而破坏结构。可替换地，或者另外，绝缘体层182可以由电学上不导电的材料组成以防止DC流或可能会干扰测定的从导电体层至MBL和／或溶液的低频率能量流。该绝缘体层可以包括聚酰亚胺，氧化铝，金刚石，蓝宝石，不导电的聚合物，半导体绝缘材料，例如二氧化硅或镓氧化砷或者提供气密性和／或电绝缘性质的其它材料。该绝缘层还可以由空气或者其它气体物质组成，在这种情况下可以省略连接体181。
第二连接体提供绝缘体层182和基质184之间的接触并且由和第一种连接体181一样的或类似的分子组成。基质层184可以由聚合物层组成，但是也可以任意地包括碳水化合物，蛋白质，聚氨基酸层等等。第三连接体185由适合基质层和抗配体186接触的分子组成并且可以由和第一种和／或第二种连接体181和183一样的或类似的分子组成。
抗配体186用来特异性地或非特异性地结合溶液中的配体187和／或来测定溶液的物理性质，例如温度，pH，离子强度等等。该抗配体由特异性地或非特异性地结合配体187的分子或分子结构组成。例如在其中配体由抗原组成的情况下，抗配体186将由抗体组成。配体187由特异性地或非特异性地结合抗配体186的分子或结构组成。
一般情况下，MBL足以如这里所描述的可测定地与沿着相关信号电路的电磁试验信号相互作用。因此，可以分析基本上所有的表现出各种各样的电介质性质的MBL组合物。在大多数实施方案中，MBL的厚度范围在大约1-5埃至1厘米之间。对于简单的分子结合作用，该范围通常在大约10埃至10000埃之间，一般在100埃和5000埃之间，或者500埃至1000埃之间。较大的MBL相互作用(例如细胞)其范围将在1μm和100μm之间，优选5μm至50μm。对于绝缘体，基质等等，该尺度范围将大得多。
图1D的实施方案不是要穷指所有可能的MBL构型。本领域技术人员将会理解，根据特殊的应用要求，可以设计制备MBL的多种组合。例如，没有补充第一，第二和第三连接体181，183，185，绝缘体层182，和基质层184，并且MBL由抗配体186和配体187组成。此外，可替换地，可以没有第一连接体181和绝缘体层182。其中没有一层或几层上述层或者添加另外的层的其它可替换实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。
此外，MBL可以由不同的分子组成，它们可以是立体成组的或者随机成层的或者根据特定的排列版本分布。例如，图1E图示说明了具有四种立体分开的不同抗配体190，191，192和193的MBL180的俯视图。图1F图示说明了其中四种不同抗配体190，191，192和193随机分布的MBL180。在另一个实施方案中，图1G图示说明了其中MBL180含有与信号电路153连接的溶液157中的细胞194的剖面图。在另一个实施方案中，具有膜结合结构(没有给出)的细胞膜195在与信号电路153连接的溶液157中。这些层可以包括例如连接体，基质，抗配体，配体和一层或多层绝缘层。在一些实施方案中，可以使用一种或多种膜，例如控制离子运输，大小或电荷选择或者支持抗配体或其它分子结构接触的那些。
电学方面，MBL表现出独特的电介质性质，其部分归因于结构和构象性质和其中结合的分子的变化，分离的和在环境存在下的变化，例如结合作用，pH变化，温度，离子强度等等。结合的分子结构的电介质性质与溶剂化介质(溶液)的局部结构一起也可以归因于一级或者其它更高级结合引起的分子内和分子间键的变化，并且溶剂化介质的置换在导电体层附近。
一旦提供导电体层，本领域技术人员一般会熟悉为了选择其操作系统的目的的生物和化学文献。关于对于生物系统的通论，参见，当代分子生物学方法(Current Protocals in Molecular Biology)，F．M．Ausubel等编著，Current Protocals，ajoint venture between GreenePublishing Associates，Inc，和John Wiley＆Sons，Inc．(1997年增刊)(Ausubel)；Watson等(1987)基因分子生物学(MolecularBiology ofthe Gene)第四版，The Benjamin／Cummings Publishing CO．，MenloPark，CA；Alberts等(1989)，细胞分子生物学(Molecular Biology of thecell)，第二版，Garland Publishing，NY；诊断和治疗默克手册(TheMerckManual of Diagnosis and Therapy)，Merck＆Co．，Rathway，NJ．。生物试剂和试验设备生产商的产品信息也提供了在测试生物系统中有用的信息。这些生产商包括例如SIGMA化学公司(圣路易斯，MO)，R＆D系统(Minneapolis，MN)，PharmaciaLKB生物技术(Piscataway，NJ)，CLONTECH Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)，Aldrich化学公司(Milwaukee，WI)，GIBCOBRL生活技术有限公司(Gaithersberg，MD)，Fluka Chemica-Biochemika Analytika(FlukaChemie AG，Buchs，Switzerland，Applied Biosytems(Foster City，CA)，以及本领域技术人员公知的其它很多商业来源。
可以使用公知的技术，例如静脉穿刺术，腰椎穿刺，液体样品，例如唾液或尿液，或者活组织检查组织等等。当生物材料来自非人类时，例如商业相关的家畜，则一般从家畜加工厂获得血液行业组织样品。类似地，本发明中使用的植物材料一般可以来自农业或园艺来源和自然产物的其它来源。或者，生物样品可以从贮藏组织和／或血液的细胞或血库得到，或者来自体外来源，例如细胞培养。用作生物材料来源的细胞培养技术是本领域技术人员公知的。Freshney，动物细胞的培养，基础技术手册(Culture of Animal cell，aManual of Basic Technique)，第三版，Wiley-Liss，NY(994)，提供了细胞培养的一般性介绍。
本发明可以以多种实施方案实施，下面详细描述一些，在应用部分详细描述另外的实施方案和应用。
在一个实施方案中，本发明用来检测分子结构与信号电路的结合。在该实施方案中，信号沿着信号电路传导。当其传导时，其连接结合的结构并且被调制。被调制的响应的分析表明结合。
在另一个实施方案中，本发明可以用来鉴定二级结合。例如，一级结合可以是抗体与导电体表面的接触。二级结合可能涉及固定的抗体与溶液中其抗原之间的结合。一级结合根据上段所述检测过后，含有抗体的溶液被加到生物测试装置中并且再次测定响应。该响应与一级结合响应相比较。变化表明发生了结合作用。
一方面，本发明可以用来在一级结合阶段鉴定配体，例如蛋白质。在标准相中，可以测定并保存多种已知蛋白质的响应。未知蛋白质接触测试表面后，可以测定该系统的电介质性质，并且信号的电介质性质用来鉴定表面上的蛋白质。因为保存了每一种蛋白质的指印响应，未知的响应可以与保存的响应相比较并且可以用模式识别来鉴定该未知蛋白。
在另一个实施方案中，本发明可以在阵列格式中使用。该装置具有多个地址点，每一个结合了特异性的抗配体。将溶液运送到该装置后，将测定和表征每一点处的结合响应。该类型装置可以用来测定和／或鉴定样品中特异性核酸序列的存在。在每一个地址位点处，独特的核酸序列连接为抗配体。当暴露给样品时，互补序列将结合合适的位点。每一个位点处的响应将表明是否结合了一个序列。这样的测定也表明该结合的序列是否和抗配体序列完全匹配或者是否有一个或多个错配。该实施方案也可以用来鉴定蛋白质和蛋白质类型。
在另一个实施方案中，本发明可以用来产生标准曲线或滴定曲线，这些曲线接着可以用来测定特定分析物或配体的浓度。例如，一种抗体不能接触该装置。该装置可以暴露给几种不同浓度的配体并且测定每一种浓度的响应。这样一种曲线对于本领域技术人员公知为剂量-响应曲线。一种未知的样品可以暴露给该装置并且测定响应。其响应可以与标准曲线相比较来测定未知样品中配体的浓度。
在另一个实施方案中，本发明可以用来内部自我校正由于老化和其它稳定性原因的损耗。例如，对于抗体-抗原系统，本发明使人通过在暴露未知之前测定一级响应来测定表面上活性抗体的量。通过反应保留在该装置上的活性抗体的量的常数，一级响应的值用来调节二级响应，抗原结合。
III．生物测试装置A．装置结构结构上，该生物测试装置包括信号电路和生物电界面。所述信号电路可以由单一的输入／输出信号口组成；一个输入信号口电路和一个输出口电路，或者多个输入和／或输出信号口电路。信号电路可以以多种不同的设计实现，例如导电线，传导线，波导结构，共振腔，或者将支持试验信号以期望的频率范围传导的任何其它传导介质。关于可能的实施方案，参见R．E．Collins微波工程基础(Foundations for Microwave Engineering)，McGraw-Hill出版公司，1996；和S．March，Microwave Transmission Lines and Their PhysicalRealizations，Les Besser and Associates，Inc．，1986。此外，该生物测试装置还可以具有各种各样的结构。非穷指的结构包括使用常规制备技术大至小的结构，常规的蚀刻和光刻技术或者半导体加工技术。
图2A图示说明了剖面图所示的该生物测试装置的一个实施方案。该生物测试装置230由顶板231，接触端237和底板239组成。顶板231包括界面传导线233安置于其上的底表面。电介质底物240和地平面250位于该生物测试装置的外部。顶板231和／或电介质底物240由绝缘材料产生，例如玻璃，其优选与常规光刻或金喷涂，蚀刻或化学气相沉积(CVD)方法相匹配。其它材料例如铝，硅，镓氧化砷或者其它绝缘材料可以替换使用。
如图2A所示，界面传导线的底表面与分子结合层(MBL)234接触。如图所示，MBL可以由不同层或类型的结合的分子结构以及溶液中存在的分子结构组成。在另一个实施方案中，MBL234可以将界面传导线233延长小部分或大部分，并且可以由所示的不同的结合分子结构组成。MBL可以只是由抗配体／配体结构组成，或者如图1D所示，由各种各样的连接体中间体，基质和绝缘层组成。当补充时，除了其它常规绝缘材料外，绝缘层182(图1D)可以由空气，聚酰亚胺，氧化铝，金刚石，蓝宝石或半导体绝缘材料例如二氧化硅或镓氧化砷或者非导体材料组成。绝缘层的厚度和介电常数是使得MBL234和界面传导线233在信号传输期间紧密连接在一起的厚度和常数。绝缘层182的厚度可以是10-1m，10-2m，10-3m，10-4m，10-5m，10-6m，10-7m，10-8m，10-9m，10-10m或者厚度更小，或者数值在这其间，取决于所需要的连接的量，绝缘层的介电常数，和总的连接面积。连接可以通过多种不同的构型实现，包括多层中宽边和不均匀连接构型，共平面，或者波导电路拓扑学。补充的绝缘层对于将界面传导线与溶液介质气密密封开来和／或防止可能干扰其中存在的分子结合作用的DC或低频电流流向溶液是有好处的。
界面传导线233由能支持信号传导并且能结合MBL234的材料组成。该材料将根据MBL的组成而不同，但是一些包括金，氧化铟锡(ITO)，铜，银，锌，锡，锑，镓，镉，铬，锰，钴，铱，铂，汞，钛，铝，铅，铁，钨，镍，钽，铑，锇，铊或者它们的合金。或者，所述界面传导线233可以包括与一种或多种靶分子(配体)形成键的一种或多种分子结构(抗配体)(其形成MBL234的一部分)。也可以选择包括界面传导线的材料来促进连接体的接触以及支持信号传导。可以用来形成界面传导线233的其它材料对于本领域技术人员来说是显而易见的。
使用溶液260可以将配体传送给MBL234，例如Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(d-PBS)。所感兴趣的蛋白质，核酸或者其它配体可以使用各种各样的技术例如芯给，移液，滴加，直接接触，或者通过毛细作用施加给结合表面。
在一个具有实施方案中，设计界面传导线233来提供低信号丢失并且与外部传导线270密切电阻匹配。通过从导体材料制备界面传导线233来实现低信号丢失，所述导体材料的一些例子是金，铜，铝，氧化铟锡(ITO)，或者其它上述导体材料。通过将界面传导线233的宽度定义在大约外部传导线270的宽度来实现密切电阻匹配，取决于底物，溶液和MBL的相对电介质性质。通过接触端237提供界面传导线232和外部传导线270之间的信号持续性。如上面所解释的，MBL234和溶液介质260可以位于接近地平面250，或者，另外这些平面位于接近界面传导线232。
该生物测试装置的输入和／或输出口处可以包括另外的集中元件形式，分散形式或者两种组合中的另外的模拟和／或数字电路。例如，电阻匹配电路和／或缓冲放大器电路可以在输入口使用。或者，或者另外，可以补充电阻匹配电路和一种或多种输出放大器来进一步增强输出信号。本领域技术人员将理解也可以在可替换的实施方案中使用其它类型的调控电路。
图2B图示说明了生物测试装置的第二个实施方案。在该实施方案中，溶液占据了在底板239上表面上形成的界面传导线233之上的空间。界面传导线233的顶部形成MBL234黏附的结合表面。电介质层240位于界面传导线233和地平面150之间。接触端237提供给外部传导线270以信号电路。界面传导线，顶部，底板，接触端和电介质层可以如上所述由材料制备并且处理。MBL也可以如图1D所示或者其变化方式构型。此外，MBL234和溶液介质60可以位于接近地平面250，或者另外这些层位于接近界面传导线233。
另外的结构实施方案包括具有多元件传导线，波导和共振腔的生物测试装置，其中MBL可以以一定方式连接一个或多个线或腔元件使得增强检测特异性和灵敏性。这样的结构的例子包括平行放置的信号组合器，共振腔，或者波导，沿着波导，一个元件上的结合的MBL与另一没有结合结构的平行元件相比改变了信号传导性质，这样改变组合信号的模式性质，结果容易检测输出信号性质。后者有效使用公知技术来测定频率，频率稳定性和频率超高精确度的非常小的变化。
B．结合表面化学图3详细说明了沿着生物电界面的导电层发生的结合表面化学反应的一个实施方案。所述生物电界面包括底物320，导电层330，MBL340和溶液350。底物320可以是这里所描述的任何电介质层或底物材料，包括氧化铝，金刚石，蓝宝石，塑料，玻璃等等，并且可以提供对导电层320的结构支持。在一个可替换的实施方案中，去除底物320而通过绝缘层342提供结构支持。
导电层330由将促进信号以期望的频率传导和将促进如上所述MBL340的结合材料和方法制备。在二导体电路拓扑学中，导体层330可以包括信号平面或地平面。但是在另一种情况下，第二导电层(或者信号平面或者地平面，没有给出)或者位于底物320的下部(图2B的排列)或者至少一个底物层从溶液350去除(图2A的反转放置)。或者，导体层可以位于这两种水平。
溶液350与MBL340连接允许配体流向MBL340。配体从溶液350流向MBL340可以是直接地或者间接地。溶液由任何传送介质组成，例如气体，液体或者固相材料，一些例子是含水的d-PBS，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液等等。
沿着生物电界面，MBL位于至少一部分溶液和信号电路之间，使得MBL比沿着那部分的溶液更接近信号电路。在图3的实施方案中，MBL340位于溶液350和导电层330之间，更接近后者。在一个实施方案中(图2A所示)，该溶液位于信号和地平面之间。在第二个实施方案中(图2B所示)，该溶液位于信号-地平面区外部。
MBL结合导体表面中所涉及的典型的化学反应一般将取决于MBL的性质和含量，其在测试中的功能。MBL可以由配体，配体／抗配体复合体，或者这里所描述的其它分子结构组成。典型地，配体将会功能完整，尽可能靠近表面，抗配体的表面密度将足够高以提供最大的电介质作用，但是不足以高至减弱结合的功能，例如通过空间位阻或者通过邻近分子物理封闭固定化抗配体的活性结合位点。
如图3所示，配体可以特异性地或非特异性地或者直接结合导体层320或者结合中间结构。如果期望特异性结合配体，则任意地使用一种连接体来有利于结合，例如为了结合所有的蛋白质，使得导体层320暴露给溶液。为了保证稠密地填满结合层，可以使用巯基，Fab或者蛋白质例如蛋白质A来有利于抗体或者其它抗配体沿着导体层320的结合。可以以多种方法将这些和类似的物质施加给导体层320，包括光刻，半导体加工或者任何其它常规应用技术。
另外，一些配体和抗配体可能能以多种方法结合。这些配体一般具有统计学支持的结合模式或者可以被工程处理以位点特异性方法结合。一些抗配体任意地以位点特异性方式结合表面。例如，一种寡核苷酸可以在一个末端被结合。一般情况下，抗配体将以不会减弱抗配体功能的方式接触，例如，优选以将表面变性最小化的浓度。
结合表面上的抗配体浓度将不同，取决于具体的分析物。例如，对于蛋白质的典型浓度是107／cm2，108／cm2，109／cm2，1010／cm2，1011／cm2，1012／cm2，1013／cm2，1014／cm2，1015／cm2，或者其间范围的浓度。对于核酸的典型浓度是107／cm2，108／cm2，109／cm2，1010／cm2，1011／cm2，1012／cm2，1013／cm2，1014／cm2，1015／cm2，1016／cm2，1017／cm2，1018／cm2，1019／cm2，1020／cm2，或者其间范围的浓度。对于全血中分析物的典型浓度范围是55M，25M，10M，1M，5M，10-1M，10-2M，10-3M，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M，10-13M，10-14M，10-15M，10-16M，10-17M，10-18M，或者其间范围的浓度。
MBL内应该粘附足够的配体以改变信号通过生物电界面传导。粘附结合表面的配体的量可以是1，10，102，103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013，或更多的配体，以及这之间的任何量，取决于导体层的表面积。导体不需要在沿着导体层的预先确定的区域内施用，因为信号响应是通过生物测试装置或者芯片上对面放置的MBL的固有电介质性质测定的。对于较小分子，MBL一般具有1010cm2至1024cm2范围的表面密度，一般是1015cm2至1020cm2。配体层可以象一层这样薄，但是任意地使用2，3，4，5或10层或更多层。
一旦一种配体与该导体层结合，则开始启动该系统的化学和／或结构生物学。该配体的电介质性质得到一个信号响应，其是结合的结构的特征，通过该信号响应使检测结合作用，以及检测该结构中所感兴趣的其它性质。结合作用提供的独特的响应将取决于固定的抗配体，其靶配体和附近溶液分子的排列(例如水和自由离子)。能与表面结合的分子的范围包括但不限于蛋白质，核酸，小分子，糖类，脂类和所感兴趣的任何其它分子。
一般情况下，MBL的分子置于溶液中，所述溶液可以包括下面物质的水溶液水，d-PBS，Tris，血液，生理盐水，脑脊液，尿，汗液，唾液，其它渗透分泌物，有机溶剂等等。其它溶液可以包括气体，乳液，胶体，和有机和无机化合物。
二级结合反应发生在生物测试装置的MBL处。溶液中的配体通过生物测试装置送递使得其接触结合层的抗配体。溶液中配体的浓度是不同的，可以是10-1M，10-2M，10-3M，10-4M，10-5M，10-6M，10-7M，10-8M，10-9M，10-10M，10-11M，10-12M，10-13M，10-14M，10-15M，10-16M，10-17M，10-18M，10-19M，10-20M。当相互作用时，例如结合，发生在配体和抗配体之间，然后配体任意地成为结合层的一部分，这是由结合作用的化学平衡特征所决定的。
MBL包括结合的配体，也可以包括溶液分子。结合的配体可以是任何分子，包括蛋白质，碳水化合物，脂类，核酸，和这里所讨论的所有其它分子。MBL可以进一步包括一种连接体以有助于抗配体与表面结合层的结合。
另外，抗配体与配体的相互作用改变了只有抗配体接触的结合层的特征电介质响应。例如，如果抗配体A是形成结合层的抗配体，则沿着传导线传导的试验信号的电介质响应将反映抗配体A的结构的特征性质。当配体B结合抗配体A时，该结合层的结构和／或电介质性质将由于A结合B而变化。A的结构可以在B与它结合的时候改变，因此提供了不同的信号响应。由于结合相互作用的信号变化将是A与B结合的特征。因此，可以从信号变化测定结合作用的存在。
此外，通过记录信号响应的哪一部分由于相互作用而变化获得关于随着结合的键或结构和／或构象变化的类型。任意地通过其结合抗配体A的信号变化检测和鉴定配体B。配体B与抗配体A的结合诱导了构象变化，或者分子结构或周围溶液的其它变化。这些变化改变了MBL的电介质性质，从而改变了沿着信号电路传导的试验信号的信号响应。试验信号的变化可以用来检测配体B结合作用，变化的特殊性可以用来鉴定配体B。分子的结构和功能之间的关系如此之多是公知的，例如在酶，抗体，受体等等的情况下，结合的配体的功能可以从其光谱特征推断出。
在一个实施方案中，将一种类型的抗配体施加给结合表面形成MBL，遍布分子结合层使用一种配体来检测两种分子之间的结合作用。在另一个实施方案中，抗配体可以是一种混合物，并且遍布分子结合层使用的所述配体是已知的分析物或抗体。通过检测信号响应的特异性变化，根据配体或抗配体中诱导的构象个其它变化和从中产生的光谱响应，可以测定抗配体与之相互作用的特殊配体。这样一种实施方案不需要空间分离各种具体的抗配体，但是确实产生了期望水平的光谱响应特异性，使得通过观察电磁响应而不是记录在测试的哪一部分上发生结合作用来测定给定的结合相互作用。
在另一个实施方案中，抗配体可以是结合层上一种已知的分子，而配体作为未知的混合物例如全血样品遍布生物测试装置施用。在这种情况下，通过信号通过生物测试装置传输得到的光谱中的特殊峰或信号的存在与否来测定特定配体例如血液中的抗体的存在。或者可以根据配体结合时抗配体或配体光谱中的变化来测定。这样一种实施方案比只是结合化学提高了测定的特异性，因为该信号包含关于结合作用的性质的信息。这样，可以将特异性结合与非特异性结合区分开来，并且总的测定特异性可以与单独的化学的特异性大幅提高。
通过使用生物测试装置形成的检测系统提供了高效率检测系统，因为可以快速分析实际时间和很多样品中任意地发生的测定。响应周期任意地以纳秒时间规格监测。一旦分子与另一个结合，则发生监测。任意地需要更长的时间来测定具有低结合亲和性的分子之间的低浓度或结合作用。任意地，扩散速度限制实际时间。除了这些潜在的限制外，上千种化合物任意地非常快地例如在一个小时内通过该系统。例如使用难以置信的芯片技术，10000条通道装置(使用一些微流排出技术)是可能的，用小体积和短的扩散时间，和动力学测定不只是测定反应的开始，而且每小时任意地测定一百万个样品。用已知浓度，单从动力学任意地计算出结合亲和性，这样该装置可以以非常快的时间内探测并且从动力学曲线的斜率计算和／或估计亲和性。关于动力学和亲和性的参考在任何标准生物化学或化学教科书中可以看到，例如Mathews和Van Holde，生物化学，Benjamin Cummings，纽约，1990。
C．生物电界面所述生物电界面是沿着其形成MBL和信号电路的结构。如上所述，所述信号电路可以由导体或电介质波导结构，两种导电体结构例如常规的信号／地平面结构，或者本领域公知的三种或多种导体结构组成。一般情况下，设计信号电路的导电区域的厚度以提供最小的信号丢失。例如金传导线的典型厚度是0．1至1000μm数量级，优选大约1-10μm。
信号电路沿着与MBL不正交的方向形成。在一个实施方案中，试验信号与切线平行传导给其上形成MBL的表面上。在另一个实施方案中，试验信号可以以相对于MBL结合表面±1．，±2．，±3．，±4．，±5．，±10．，±15．，±20．，±30．，±40．，±50．，±60．，±70．，±80．，或±85．或者其间任何范围的角传导。在第一个实施方案中，所述信号电路由两种导电体结构的传导线组成，并且信号电路的方向由电磁领域公知的Poynting矢量确定。在第二个实施方案中，所述信号电路可以由导电区或者沿着生物电界面区连续延伸的层组成。在第三个实施方案中，所述信号电路可以定义为在期望的操作频率范围内沿着生物电界面最少量信号丢失的电路。在第四个实施方案中，所述信号电路可以定义为具有大于3mhos／m的a．c．导电性，即具有大于盐水溶液的导电性，一般大于5mhos／m，但是理想地，在100至1000mhos／m范围内或更大。
生物电界面操作通过开发界面的等效电路模型会更好地被理解。存在的所述相当的电路模型以两个导电体电路布局技术所示，但是电路设计领域的技术人员容易理解在单一导体波导布局，响应电路布局，以及电路布局中具有补充三个或多个导体。
图4A图示说明了用于图2A所示生物电界面结构的等效电路模型420的一个实施方案。电路设计领域技术人员理解图示说明的电路模型不是穷举，也可以从图2A的生物电界面产生其它等效电路模型。
图示说明的等效电路模型包括模拟全部如图2A所示的各界面传导线232，MBL234和溶液260的系列电学作用的串联装置422a，424a和426a。因为界面传导线，MBL和溶液各提供了沿着界面的可能的经度信号电路，所以界面传导线，MBL，溶液电路部件422a，424a和426a并联连接。在其中MBL和溶液位于接近地平面的可替换实施方案中，接通等效电路模型420的界面传导线和地平面。在其中MBL和溶液位于接近界面传导线和地平面两者的实施方案中，图2A代表等效电路的上半部，如果使用相同的溶液和MBL，则其下半部(地平面)相同。
等效电路模型420进一步包括分布模拟图2A中所示的电介质层240，MBL234和溶液260的分路电学作用的分路电路部件422b，424b和426b。从这些元件的每一个物理排置得到分路装置422b，424b和426b的串联取向，所述元件串联地从界面传导线通过MBL，溶液和电介质层至地平面产生，其排置如图2A所示。
图4B图示说明相应于图4A所示等效电路模型的电路430的一个实施方案。电路设计领域的技术人员容易理解其它电路接法也是可以的。这些串联电路部件422a，424a和426a每一个由串联连接的电阻和电感器组成。分路电路部件422b，424b和426b每一个由并联位阻和电容器组成。串联电阻Rl，Rm，Rs分别模拟界面传导线，MBL和溶液的位阻。分路电阻Rm’，Rs’，Rd分别模拟MBL，溶液和电介质层的位阻。串联电感器Ll，Lm，Ls分别模拟界面传导线，MBL和溶液的电感。分路电容器Cm，Cs，Cd分别模拟MBL234，溶液260和电介质层240的电容。总地来说，上述电阻，电感器和电容器确定电路430，其将输入信号Vi转化为输出信号Vo。
MBL的电介质性质很大程度上决定相应于那些层的各个的电路元件的值。例如在图4B图示说明的实施方案中，MBL的灵敏度很大程度上决定分路电容Cm的值。此外，MBL的扩散性质很大程度上决定分路电阻Rm’的值。Cm和Rm’的值将生物电界面的信号响应定义到明显程度。因此，该生物电界面的信号响应是MBL电介质性质的显著特征，并且可以用来检测和鉴定分子结合作用，下面将进一步描述。
在其中溶液260是水溶液的实施方案中，与其相关的电介质性质对于信号沿着界面传导线传导是不利的。具体地说，水和其它含水量高的水溶液例如全血，表现出相对高的电阻Rs和相对低的电阻Rs’，以及关于在光谱某些面积中的电磁辐射的吸收性质。这些参数的放大导致沿着界面传导线的非常高的信号丢失。本发明中界面传导线和溶液之间的MBL定位用来绝缘或者另外调控与信号和溶液的连接，从而调控信号丢失和改变信号传导的其它参数。
图4C图示说明图2B所示生物电界面结构的等效电路模型450的一个实施方案。电路设计领域技术人员明白图示说明的线路模型不是穷举，也可以从图2B的生物电界面衍生其它等效电路模型。
图示说明的等效电路模型450包括串联和分路电路部件452a和452b，其电学模拟界面传导线。等效电路模型450还包括与电学模拟MBL和溶液的溶液电路部件456串联的MBL电路部件454。如上面所解释的，串联和分路部件452a和452b的取向确定了常规传导线结构。另外，MBL和溶液电路部件454和456的串联取向是从界面传导线通过MBL延长到溶液中的信号场线路的结果，其排列如图2B所示。或者电路模型可以按照上面对于补充MBL和溶液接近地平面，或者另外它们接近界面传导线的生物测试装置产生。
图4D图示说明了相应于图4C所示等效电路模型的电路470的一个实施方案。电路设计领域技术人员溶液理解其它电路接法是可能的。串联和分路电路部件452a和452b总地代表界面传导线的常规模型。MBL电路部件在界面传导线和溶液电路之间连接，并且在一个实施方案中，由并联的电容器Cm，电阻Rm和电感器Lm组成。上述电阻，电感器和电容器总地确定电路470，其将输入信号Vi转化为输出信号Vo。
如上所解释的，MBL和溶液的电介质性质将影响各电学元件的值。特别是，MBL的灵敏度和其它电介质性质将很大程度上决定Cm的值；MBL的介电常数，其它电介质性质和表面形态将有力地确定Lm的值；MBL的扩散性质以及导电性和其它电介质性质将明显确定Rm的值。因此，生物电界面信号响应是MBL的电介质性质的显著特征，并且可以用来检测和鉴定分子结合作用，这一点下面将进一步描述。
D．具体实施方案图5A-5G图示说明了在两个导电体电路布局中补充的生物电界面的具体实施方案。电路设计领域技术人员容易理解单导体波导布局以及三个或多个导体电路布局中可以补充。
这些实施方案的每一个由单平面520，电介质层530和地平面550组成。与信号平面520，地平面550或者两者连接是MBL515和溶液510。在每一个实施方案中，MBL515可以或者直接与界面传导线520接触或者与之连接。当信号平面520直接接触MBL515时，其是从能即支持信号传导又粘附配体例如蛋白质，核酸，碳水化合物，酶等等的材料形成的。这样的材料包括但不限于金，ITO，铜，银，锌，锡，锑，镓，镉，铬，锰，钴，铱，铂，汞，钛，铝，铅，铁，钨，镍，钽，铑，锇，铊或者它们的合金。可以使用的其它材料对于本领域技术人员是显而易见的。
电介质层530可以由空气，聚酰亚胺，聚四氟乙烯，织物绝缘材料例如DuriodTM，氧化铝，金刚石，蓝宝石或者半导体绝缘材料例如二氧化硅或镓氧化砷，或者其它绝缘材料组成。选择电介质层530的厚度和介电常数以提供本领域公知的期望的传导线电阻。溶液510可以由任何运输介质组成，例如Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(d-PBS)，其提供研究对象的分子结构。可以使用各种各样的技术将蛋白质，核酸或者其它所感兴趣的配体进入生物电界面，例如芯给，移液或者通过毛细作用。
图5A和5B图示了微波带状线路布局中实现的界面剖面图，其中溶液510和MBL515分别位于界面传导线之上和之下。图5C和5D图示了其中溶液510和MBL515分别位于地平面550之上和之下的界面的剖面图。
图5E图示了在共面波导布局中实现的界面的剖面图。在该实施方案中，溶液510和MBL515位于界面传导线530之上。或者，溶液510和MBL515可以位于界面传导线530之下，或者在共面地平面550一者或两者之上或之下。图5F图示了在微波带状线电路布局中实现的界面的剖面图。在该电路连接中，溶液510和MBL515位于界面传导线530之上。在另外的实施方案中，这些层可以可替换地或者另外置于界面传导线530之下，或者在地平面550一者或两者之上或之下。
图5G图示同轴电路布局中补充的生物电界面的一个实施方案。第一绝缘体530a具有部分外接界面中心导体530的腔570。MBL515位于接近界面中心导体530的未覆盖的部分。外导体550和第一绝缘体之间有第二绝缘体540b，并且外接外导体550，形成其中蓄积溶液510的腔570。第一和第二绝缘体530a和530b的径向常数和介电常数可以是相同的或不同的值，选择每一种常数以提供期望的电阻和超过试验信号频率范围的要求的测定灵敏度。在一个可替换的实施方案中，MBL515位于接近外导体550。在该实施方案中，第二绝缘体530b包括使MBL形成接近外导体的腔，并且第一绝缘体完全外接中心导体320。此外，MBL515和溶液可以位于外导体550的外部。
所述生物电界面可以根据应用制成各种各样的形状，例如方形，椭圆面，三角形，圆形或者其中一部分，或者不规则几何形状，例如适合装进皮下注射针管的腔中。所述生物电界面的大小将根据应用而变化，具有10m2，1m2，10-1m2，10-2m2，10-3m2，10-4m2，10-5m2，10-6m2，10-7m2，10-8m2，10-9m2，10-10m2，10-11m2，10-12m2数量级的大小，或者在其间范围的任何大小。所述生物电界面可以制备成安装到针管腔这样小的物件中。或者界面可以改变以适应其它诊断应用，例如蛋白质芯片。所述生物电界面的大小或形状只需要这样，使得沿着它的信号传导和分子结合是可能的。
V．测定方法A．综述本发明的测定方法应用了根据它们的独特的电介质性质，包括扩散作用，谐振作用和对所述分子周围溶液的作用，大量分子彼此之间是可区分的这一发现。在本发明中，当一个试验信号与MBL连接时，MBL与试验信号的能量相互作用，产生独特的信号响应。然后可以用该独特的信号响应来检测和鉴定组成MBL的分子。
本领域技术人员明白大多数分子对于不同的频率表现出不同的电介质性质。例如，作为电磁谱一个区或几个区的频率的函数，分子的电介质性质可以表现出惊人的变化。分子表现出惊人的电介质性质变化的频率带经常被认为是分子的分散状态。在这些状态中，分子的介电常数，电容率，偶极矩和／或多极矩和灵敏度作为频率的函数而惊人地变化。这些量经常是复杂的，对于信号响应中发生的重大的和相位变化计算具有真实部分和想象部分。分散状态覆盖各种频率，包括RF，微波，毫米波，远红外和红外频率。
通过连接试验信号和分子并且观察得到的信号可以观察到分子的电介质性质。当试验信号以分子分散状态内的频率激发分子时，尤其是以共振频率，分子将强烈地与信号相互作用，得到的信号将在其测定的振幅和相位上表现出惊人的变化，从而产生独特的信号响应。该响应可以用来检测和鉴定结合的分子结构。另外，因为大多数分子将在相同的或不同的频率带表现出不同的分散性质，每一个产生独特的信号响应，其可以用来鉴定分子结构。
通过在分子水平检测和测定电介质性质可以完成分子结合作用的测定和鉴定。通过分子的多极矩可以确定分子水平的电介质性质，其势能可以以本领域公知的无穷级数代表Φ(x)=qr+p·xr3+12Σi,jQijxixjr5+…]]>无穷级数由多项组成，其中每一个描述在电场，磁场或电磁场存在下分子的电介质性质的不同程度。第一项指作为单极矩并且代表分子上总电荷产生的静电势能的无矢量量。第二项或“偶极矩”是一个矢量并且由三度自由度组成。第三项或“四极矩”是2-级张量，并且描述跨9度自由度的分子响应。一般情况下，Nth项是N-1级张量，有3N-1度的自由度，但是对称性可以减少自由度的总数。人们可以意识到较高级的矩提供更详细的关于分子电介质性质，因此给出更多的分子独特电介质特征。因为势能的梯度导致电场E=-_φ(x)较高级的矩的场强作为距离的函数而快速减少，因此难以测定它们的贡献。例如，二极矩的场随着r-3而减小，四极矩的场随着r-1而减小。因此，该项研究需要结合分子和试验信号线路的密切接近并且其中低信号损耗。因为经常是强信号吸收溶液例如全血样品或离子溶液中发生分子结合作用检测等等情况，因此结合作用和信号线路之间的信号损耗变得十分高，较高级的矩的测定非常困难。
另外，每一个多极项以不同的方式与电场耦合。这通过首先看给定静电系统的能量来证明W=∫ρ(x)Φ(x)d3x
展开Taylor Series的静电势给出Φ(x)=Φ(0)+x·▿Φ(0)+12ΣiΣjxixj∂3Φ(0)∂xi∂xj]]>由于E=-_Φ(x)，则Φ(x)=Φ(0)-x·E(0)-12ΣiΣjxixj∂Ej∂xi]]>此外，对于外场，_·E=0，因此，我们得到Φ(x)=Φ(0)-x·E(0)-16ΣiΣj(3xixj-r2δij)∂Ej∂xi]]>将其插回到上面给出的对于能量的等式中，得到W=qΦ(0)-p·E(0)-16ΣiΣjQij∂Ej∂xi]]>这给出了其中各个多极项与所研究的场的相互作用的方式总电荷q与势，二极p与电场，四极Qij与电场的梯度等等。这说明检测较高级多极矩的第二困难难以在大量样品中实现足够的场梯度来耦合较高级矩。
本发明通过补充所描述的生物电界面克服了上述阻碍。所述界面包括MBL，其沿着信号线路连接。所述MBL由非常薄而高不均匀性层(从电介质标准点)组成，这样提供了需要的接近电磁探测结构以及足够的场梯度来耦合较高级多极矩。这些性质能检测较高级矩，其提供了对分子电介质性质的大大增强的观察。所述MBL的位置接近信号和／或地平面，来将在其上传导的信号与变成吸附到溶液中的信号隔离，从而减少信号损耗并且能利用更高的试验频率更准确地检测和鉴定结合作用。在该方法中，本发明能更大程度上回收信号，或者信号响应包括分子二极矩和其它较高级多极矩的贡献。
使用所描述的本发明的生物测试装置，可以检测多种与MBL相关的性质。图6A图示说明该方法的一个实施方案。从602步开始，形成MBL并且沿着信号线路的一部分连接。如所描述的，MBL可以由一种配体，抗配体／配体复合体等等组成，并且直接或间接与信号线路物理接触或者电磁连接。所述信号线路可以由两个导体传导布局的信号平面或地平面组成。
下面在604步，试验信号沿着信号线路传导。所述试验信号可以是任何随时间变化的任何频率的信号，例如10MHz信号频率，或者45MHz至20MHz范围的频率。下面在606步，试验信号与MBL连接，并且对于连接发生信号响应。然后对于分子结合层的一种或多种分子回收信号响应并且提供信息。
该生物测试装置可以用来提供关于MBL多种性质的信息，例如对于MBL的电介质性质中的分子结合作用，配体浓度，电荷，检测的结合作用的类别等等。另外，该生物测试装置包括自身校正能力，其在定点应用性质控制和可靠性中是有用的。下面进一步描述这些方法的每一个和能力。以所描述的方法和结构为基础，改变和另外的用途对于本领域技术人员是显而易见的。
检测和测定溶液中分子二极，四极和更高级多极矩的能力从很多意义上来说代表显著的进步。首先，很多生物制药所感兴趣的分子，例如蛋白质，具有非常特殊的结构，因此具有非常特殊的多极矩。因此，鉴定给定分子的多极矩发现所述分子的性质，其是独特的，因此使得鉴定所述分子。其次，很多生物制药相关的分子例如蛋白质中结构和功能是密切相关的。因此，检测与所述分子功能直接相关的给定分子的性质的能力意味着可以对于活性的全过程监测函数性。第三，局部生理环境经常在给定分子的结构和功能中起重要作用，使得检测上述物理性质的能力意味着分子可以用作测定给定系统中的变化的目的的探测器和探针。因此，具有将关于分子和细胞系统的复杂的和信息化性质翻译成可检测的电子数据版本的能力，这里讨论该领域所潜在的全部新的可能性。
B．检测结合的分子结构这里所描述的生物测试装置能检测沿着信号线路发生的分子结合作用。可检测的分子结合作用包括一级，二级和更高级结合作用。例如，在没有预先存在的MBL的两个导体生物电界面中，导电层的分子将形成结合配体的抗配体，所述配体形成MBL。在另一个实施方案中，抗配体和配体两者都包括在MBL内。在该实施方案中，MBL通过连接体，基质分子，绝缘层或者它们的组合，如图1D所示，与信号线路接触。
图6A图示说明该方法的一个实施方案。首先在602步，由一种材料形成信号线路，该材料能支持信号以期望的操作频率传导。所述信号线路可以由这里所描述的生物测试装置的一个中的信号口线路，两个口线路或者多个口线路组成。另外，所述信号线路可以作为传导线，共振腔或者作为波导结构实现。
下面在604步，提供含有所研究的分子或分子结构的溶液。在步骤606，由溶液形成配体组成的MBL并且在至少一部分信号线路和溶液之间连接。下面在608步，试验信号沿着信号线路传导。或者，试验信号可以在应用所述溶液期间发出以在真实时间发现作为结合作用结果而发生的信号响应。在610步，试验信号传导，连接MBL，并且发出信号响应表明配体的存在。下面在612和614步，回收试验信号，其响应表明检测到配体。
所述MBL的电介质性质可以来诱发很多信号响应，其每一个可以是分子结合的指征。例如，MBL的分散性质可以随着频率而惊人地变化。在这种情况下，当沿着结合表面发生分子结合作用时，试验信号响应将在振幅和／或相位方面随着频率表现出大的变化，从而提供检测沿着结合表面的分子结合作用的方法。
在另一个实施方案中，MBL的电介质衰减性质将作为输入信号的脉冲期的函数而变化。在这种情况下，试验信号响应将指示在特定脉冲期或者接近特定脉冲期吸附粉末的量的变化，或者试验信号的另一些参数如相位或振幅的变化。通过发现吸附的粉末或者其它参数的变化，可以检测沿着结合表面的结合作用。其它量，例如特征电阻，传导速度，振幅，相位，分散，损耗，电容率，灵敏度，频率和介电常数有可能是分子结合作用的指征。
上述方法可以用来检测沿着信号线路直接或间接地抗配体或配体的一级结合。类似地，图6A的方法也可以用来检测配体对抗配体的二级结合。图6A的方法不限于沿着信号线路发生的一级或二级结合作用的检测。事实上，使用该方法也可以检测沿着信号线路或者悬浮于溶液中所发生的三级和更高级结合作用。
图6B图示说明检测沿着信号线路发生的二级和更高级结合作用的第二种方法。首先在620步，检测一级结合作用并且测定信号响应，其中一个实施方案在步骤602-612中给出。接着在622步，保存了一级结合作用信号响应并且用作基线响应。下面在624步，向生物测试装置进入第二分子溶液并且使分布在结合表面。下面在626步，重复图6A的步骤608至612，以获得第二信号响应。下面在628步，比较第二信号响应和基线响应。极少或没有变化表明两个信号响应非常接近，表明该MBL的结构和电介质性质没有由于加入新溶液中的分子而改变。在这种情况下，二级结合没有发生至明显程度(步骤630)。如果比较结果变化超出预定范围，则MBL的结构和电介质性质改变了，由此表明二级结合作用(步骤632)。可以用来指示二级结合作用的参数也是上述参数，例如振幅，相位，频率，分散，损耗，电容率，灵敏度，电阻，传导速度和介电常数以及其它因素。使用该方法可以检测三级或更高级结合作用。
检测二级或更高级结合作用的一种可替换方法不需要先前具体一级结合作用的知识。在该实施方案中，以测试进展阶段设计生物测试装置，用已知参数操作，使得不管什么时候检测这些参数中的一个的预计的变化，例如在使用时，得知结合作用已经发生。在该实施方案中，不需要预先测定一级结合作用，因为最初的表征在制备或设计时就已经测定了。
通过测定一级结合的分子的结构变化也可以实现二级结合作用的测定。当分子被结合时，相对于其未结合态，其分子结构有了构象和其它变化。这些变化影响一级结合分子的电介质性质以及引发周围溶液中的变化，其变化可以使用图6B的步骤620-628来测定，如上所述。可以检测以指示一级结合的分子的电介质性质变化的参数包括上述参数，例如振幅，相位，频率，分散，损耗，电容率，灵敏度，电阻，传导速度和介电常数以及其它因素。
C．测定分子结合层的电介质性质的变化这里所描述的生物测试装置也可以用来测定作为温度，pH，离子强度等等变化结果的MBL电介质变化。
图6C图示说明该方法例示的实施方案。该方法与对于鉴定结合作用所公开的方法非常类似，除了该方法是测定和定量MBL的电介质性质的变化。
该方法从步骤641开始，当向所述生物测试装置加入具有初始电介质性质的溶液时，测定并记录信号响应。在一个实施方案中，根据步骤602-612进行该步骤。预定时间和操作后，进行第二次测定，并记录第二信号响应(步骤642)，又和在一个实施方案中步骤602-612一样。在步骤643，在第一和第二信号之间比较来测定两个信号是否在预定范围内相关联。如果是这样，则看来溶液的性质没有经历任何电介质变化(步骤644)。
如果信号响应在预计的范围内不相关联，则看来该溶液的一个或多个电介质性质经历了变化(步骤645)。任选地，电介质性质的变化可以以下面的方法定量。在步骤646，保存第二信号并且与已知的信号响应相关联。最相关的响应将鉴定溶液的电介质性质，第一信号响应可以与电介质性质的最初值相关联，其差别可以用来测定鉴定的电介质性质已经改变的量(步骤647)。
D．鉴定结合的分子结构使用所述生物测试装置，可以表征已知的配体并接着在具有未知配体构成的溶液中鉴定该配体。图6D图示说明该方法的一个实施方案。首先在652步，使用下面描述的一种或多种测试系统测定大量的分子结构并保存它们的响应。在一个实施方案中，根据步骤602-612进行该步骤。每一个保存的响应可以与溶液中存在的单一配体或者相同溶液中存在的多个配体相关联。接着在步骤654，对一种未知的溶液进行测定。在一个实施方案中，根据步骤602-612进行该步骤。下面在656步，将溶液的信号响应与保存的信号响应相比较以测定与其相关联的程度。在658步，通过选择与表现出与该未知响应最相关的保存的响应来鉴定未知分子结构。比较可以使用一个或多个数据点进行来测定一个或多个保存响应之间的相关性，并且可以包括使用模式识别软件或者测定相关性的类似方法。该方法可以用来鉴定一级，二级或更高级结合的分子结构。
E．鉴定结合的分子结构的类型也可以表征已知的分子的亚结构，例如与蛋白质或核酸中序列同源性相似类别相同的区或者其它结构同源性。在一个实施方案中，该方法如图6D所示进行，除了在步骤652中，测定N数量的分子亚结构并保存它们的响应。每一个保存的信号响应可以相应于一个或多个亚结构。该方法安装步骤654，656和658所述进行，直到检测并表征足够量或结构来鉴定未知的化合物。一旦存在足够量的相关性，则可以分类未知的分子结构。
图6E图示说明可以分类未知配体的另一种方法。该方法通过检测对未知化合物上的结构要素结合来鉴定未知配体。首先，在步骤660，提供了一种生物测试装置，其具有多个可寻址排列，每一个具有对于特定配体亚结构的抗配体。下面在步骤662，通过每一个与其各个抗配体结合来检测特殊亚结构的存在，并接着表征。在一个实施方案中，根据步骤602-612进行该步骤。接着在步骤664，通过定性鉴定例如亲和性，动力学和光谱响应来表征每一种结合作用。在步骤666，然后使已知和未知响应相关联。如果每一种未知响应与已知响应相关联，则该配体鉴定为相应于已知响应的配体。如果亚结构表现出相关联的和不相关联的响应，则相关联的响应可以用来构成更通常的未知配体的分类。该方法可以用来鉴定在相同种类中存在的或者具有重复存在的结构同系性的任何分子结构，例如蛋白质。
根据与已知结构相比较，给定的未知化合物的强度光谱分析可以了解结构和功能也是可能的，外推法将引出一定水平的分类。
A．特异性对非特异性结合通过结合作用的光谱指纹将特异性配体结合与非特异性结合区分开来。可以在只含有所感兴趣的配体和对所述MBL上所述配体特异性的抗配体的纯溶液中首先表征所感兴趣的给定的结合作用，例如结合抗原的抗体。然后进行宽谱研究来看一看什么时候在光谱中发现最强的响应。然后在典型地专有应用中的溶液中重复该测试，例如在全血中，以测定响应中什么影响非特异性结合。发现多个点是特异性结合的决定因素，发现另一组点是非特异性结合的决定因素，对于实际测试应用选择这些频率点的亚组。通过将由于特异性结合的响应和由于非特异性结合的响应可以测定特异性结合程度。
B．给定配体的表征经常期望测定给定分子的一些性质。例子包括测定一种蛋白质所属的类型，或者一种给定基因或者其它核酸序列的多态性类型。这可以以各种各样的方法进行。经常通过结构同源性的程度和类型来分类蛋白质，或者特别是在相同或相似类型蛋白质中发现的亚结构。例如，通常在细胞膜中发现G-蛋白质，其在胞外环境和胞内环境之间介导信号传导途径，并且总是具有穿过细胞膜7次的结构。这样一种结构对于G-蛋白质是十分明确的。其它类型的蛋白质具有类似的结构同源性，这样，以这些同源性为基础的能将蛋白质类型彼此区分的任何方法在很多生物制药研究领域具有经济应用价值。假设通过所述分子的电荷分布的几何状态完全测定给定分子的电介质性质，进一步设定大多数分子具有独特的结构和几何形状，则每一种蛋白质可以独特的通过测定该蛋白质的电介质性质而测定。这样，简单的电介质信号，例如本发明所产生的那些，可以用来独特地鉴定给定蛋白质，此外，可以将该蛋白质分类成一些预先已知的蛋白质类型。通过在生物测试装置上使用一组对给定蛋白质的特定亚结构是特异性的抗配体，可以进一步改进分类方法。例如，对于所述亚结构的存在或不存在的测定可以使用一组对于特殊亚结构例如功能域是特异性的抗体。因此，任何给定的蛋白质可以通过测定某些亚结构的存在或不存在以及蛋白质本身的电介质性质来表征。对于该分类方法的进一步改进可以包括对于上述性质观察温度，pH，离子强度以及其它环境因素作用。
核酸也可以通过下面类似的方法表征。例如，一种给定的基因可以已知具有某一碱基对序列。自然状态下该序列中常常有小的变化。例如，编码很多细胞膜中氯离子运输通道的基因中通常有单个碱基对突变或变化。这样的变化导致人的称之为囊纤维变性的疾病。因此表征具有小的变化的给定核酸序列在经济上是重要的。这样的变化通常称之为多态性，这样的多态性目前是通过对于每一种已知的多态性形成互补链来检测的。因为任何给定的基因可以形成成百甚至上千多态性的任何一种，因此对于每一种多态性产生互补链经常是艰难的任务。使用这里所描述的本发明，通过测定和上面描述的相同的物理性质的很多种可以检测并区分非互补结合或杂交可以表征杂交作用的电介质性质并且与已知的数据相关联，从而测定所发生的杂交的类型-或者是完全的或者是不完全的。因此用给定核酸序列组成的抗配体，可以通过表征结合作用而测定上百的不同的多态性(作为配体)。本领域技术人员将明白进一步的改进是可能的，例如改变严格条件来改变杂交过程，或者改变温度和测定熔点，其用作杂交方法的性质的另一种指示剂。
在类似的方法中，可以表征药物-受体相互作用来测定给定结合作用导致受体的工作或不工作，或者变构作用的一些其它形式。例如，一种给定受体可以用作一种抗配体，一种已知的拮抗剂可以用作第一配体。然后根据电介质响应表征该相互作用，并且保存该响应。接着，就它们与所述受体的结合性质发现筛选候选药物的化合物。然后已知结合并得到相似电介质响应的分子和已知拮抗剂一样对于该受体具有相似的作用，因此将具有更大的可能性是一种拮抗剂。该方法可以用来表征基本上所感兴趣的任何类型的靶物-受体结合作用，并且代表超过现行的只是检测结合作用是否发生的检测方法的显著进步。本领域技术人员容易理解有很多其它类型的结合作用可以使用本发明。
可以在上述方法中使用的亚结构的例子包括蛋白质二级和三级结构，例如α-螺旋，β-平面，三股螺旋，功能域，圆筒结构，β-转角，和四级结构中发现的各种对称结构，例如C2对称，C3对称，C4对称，D2对称，立方体对称和二十面体对称[G．Rose(1979)，Heirarchic Organization of Domains in Globular Proteins，J．Mol．Biol，134447-470]。可以分析的核酸亚结构包括序列同源性和序列多态性，DNA的A，B和Z形式，单链和双链形式，超螺旋形式，反密码子环，D环和tRNA中的TΨC环，以及不同种类的tRNA分子[W．Saenger(1984)Princuiples of Nucleic Acid Structure．Springer-Verlag，纽约；和P．Schimmel，D．Soll，和J．Abelson(编著)(1979)Transfer RNA，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约]。
F．定量测定浓度这里所描述的生物测试装置也可以用来定量测定配体的浓度。图6F图示说明该方法的一个实施方案。在该装置没有预先校正的情况下(步骤679)，首先在步骤670，选择对于测定的分析物具有合适的结合性质例如结合亲和性或动力学的抗配体。选择这些性质使得抗配体的平衡常数接近其线性操作区的中心。对于其中对于使用单一抗配体浓度太宽的应用，可以使用具有不同亲和性和／或线性操作范围的几种抗配体，从而对于很宽范围的浓度获得一个值。
下面在步骤672和674，所述抗配体与生物测试装置或芯片接触，并且该装置与测定系统连接。在步骤674，决定该响应对于最大特异性是否需要表征。如果这样，进行光谱分析，其中测定分析物结合具有最大结合的频率(步骤675a)，测定其中非特异性结合具有最大作用的区(步骤675b)，并且测定由于分析物结合的独特响应(步骤675c)。如果不需要表征，或者如果这样，在其完成之后，校正该装置。在一个实施方案中，通过向生物测试装置加入已知浓度的配体并且测定得到的响应来进行该步骤(步骤676a)。或者，如果对于校正需要更多的数据点(步骤676b)，则可以选择具有不同浓度的样品(步骤676c)，并且可以测定对于该浓度的响应(步骤676a)。在一个实施方案中，根据步骤602-612进行测定。接着在步骤677，通过记录来自上述响应的校正点产生推断的规则系统。下面在步骤678，测定未知配体浓度的样品。通过将未知样品加入生物测试装置，使该响应与滴定法规则系统相关联并且从配体浓度测定，来完成该步骤。
在给定生物测试装置是预先校正的或者设计校正的情况下，需要的唯一步骤是将配体或分析物施用给表面并且测定响应。这样一种生物测试装置可以以多种不同的方法实现。例如，当结合作用发生时，可以设计一些电路参数，如响应电路的电阻或者特征频率，来以预定的方法改变，可以进一步设计参数变化的量来获得量-响应。这样，所述电路参数的测定当通过合适的规则系统分析时将会立刻得到给定分析物或配体的浓度的定量值。
G．生物测试装置自校正所描述的生物测试装置具有自身诊断能力，因此有了定点应用的定量控制和保证。对于给定的专有应用，一种特定的抗配体(一级结合种类)将作为溶液中所感兴趣的一些配体(第二结合种类)的抗配体起作用。该一级结合种类可以在制备时连接，第二结合种类可以在使用时连接。因此，制备中的变化-尤其是一级种类连接-将引起该装置结合其特异配体的能力的变化。但是，配体结合的量将与结合的抗配体的量成正比，因此两者的比例性测定是可能的。
图6G图示说明该方法的一个实施方案。首先在步骤680，通过以各种浓度结合合适的抗体并且对于这些浓度的每一个表征得到的响应，对于每一个浓度得到一些值“x”，沿着该信号线路形成分子结合表面。下面在步骤682，通过对于几种不同浓度的配体测定抗体、配体结合响应，对于该配体产生相似的滴定度曲线，并且预先测定一种配体滴定度曲线。下面在步骤684，通过获得抗体结合对配体结合的响应的比例产生比例系数A。在使用时，首先探测没有校正的测试(步骤686)来测定结合的抗体的量“x”和从中得到的比例系数“y”。然后用该配体进行测试并且测定响应(步骤689)，通过比例系数“y”标度响应和预测滴定度曲线(步骤690)来测定未知浓度。
图6F的方法可以改变使定量测定溶液中配体的量。在该改变中，生物测试装置的结合表面包括具有预定亲和性和配体特异性的抗配体。接着将溶液施用给该装置并且测定响应。信号响应将与结合的配体的量成正比。因此任何给定配体的滴定可以通过选择具有合适的线性操作范围的抗配体来进行-该范围内平衡常数是在要测定的浓度的期望范围的对数单位矩内。可以使用如上所述相同的比例分析来得到完全精确的定量分析，为了保证可靠性需要内标和校正。
所描述的每一个方法可以以多种不同的方法(即软件，硬件或者两者的组合)和在各种各样的系统中实施。在一个实施方案中，所描述的方法可以改进为软件程序。
图7A图示说明执行为进行所描述的每一个方法所设计的软件程序的计算机系统710的实施例。计算机系统710包括显示器714，显示屏712，机壳718和键盘734。还可以包括鼠标(没有给出)，光笔，或者其它I／O界面，例如虚拟实际界面，来提供I／O命令。机壳718中有CD-ROM光驱716，硬驱(没有给出)或者可以用来保存和检索数字数据和插入该方法的软件程序的其它存储数据介体等等。尽管CD-ROM716显示是可移动介体，也可以使用其它可移动明确的介体包括软盘，磁盘和快速存储器。机壳718中还有常用的计算机构件(没有给出)例如信息处理器，存储器等等。
图7B图示说明用来执行插入上述方法中的软件程序的典型计算机系统710的简化的系统设置示意图。如图7A所示，计算机系统710包括任选地与I／O控制器724相互作用的显示器714。计算机系统710进一步包括次系统，例如系统存储器726，中心处理器728，扬声器730，可取出板732，键盘734，固定板736和网络界面738。适合用所述方法使用的其它计算机系统可以包括另外的或者少的次系统。例如，另一种计算机系统可以包括一个以上的处理器728(即多处理器系统)用于处理数字数据。箭头例如740代表计算机系统710的系统总线构造。但是这些箭头740图示说明了用来连接次系统的所有相互连接方案。例如，局部总线可以用来连接中心处理器和系统存贮器726。图7B所示的计算机系统710只是适合本发明使用的计算机系统的一个例子。适合本发明使用的次系统的其它构造对于本领域技术人员是显而易见的。V．测定系统各种各样的系统可以用来进行上述方法。图8-10图示说明可能的测定系统的3个例子频率范畴试验系统，时间范畴试验系统和电介质松弛测定系统。
A．频率测定系统图8A图示说明根据本发明的频率测定系统的一个实施方案。该系统800包括与该生物测试装置输入口852连接的信号源810和与该生物测试装置输出口858连接的信号检测器890。任选地，附加的信号源可以连接该生物测试装置输出口858，附加的信号检测器连接试验电路输入口852，以提供完全的两口测定能力。该系统可以改变为一口测试系统，其中信号检测器连接用于接受反射信号的信号线路。在一个具体实施方案中，上述频率测定系统由网络分析器例如购自Hewlett-Packard公司的8510C型分析器组成。可以替换使用其它高频率测定系统，例如以传导和反射信号为基础提供信号信息的无矢量网络分析器。
根据上述方法进行测定。首先，关联信号860向试验电路发送，接着分别回收传导和／或反射信号870和890。得到的信号响应会是独特频率响应或“光谱指纹”形式，两个实施例见图8B和8C。图8B图示说明其中响应在频率fres处发生的频率响应的一个类型。这里，响应870经历了深幅降低和回升，表明在该频率几乎没有或没有信号能量达到输出口。该共振由从频率f起始至f终止变化的MBL的电介质性质和电阻引起。不同的配体将在不同的频率点共振。另外，一些配体在测定带f起始至f终止可以表现出多个共振频率点。一旦配体表征为具有一个或多个独特发生的共振点，则该数据可以用来鉴定未知溶液中配体的存在。该特征可以从实验数据或者从多极矩和共振频率理论计算来确定。此外，当测定二级结合作用的存在时，该数据可以通过一个或多个独特共振点的变化指示什么时候分析物结合配体。
图8C图示说明频率响应的另一个类型，其可以用来检测或鉴定分子结构。在这种情况下，频率响应表现出一般性地单调地递增或递减趋势，伴随一定程度的振幅变化。响应的斜率和／或振幅变化可以用来检测和／或独特表征结合的分子。因此，在所描述的方法中，共振频率点，斜率，趋势和试验信号相位的变化可以用来独特地鉴定分子结合作用。频率响应可以在输入口852，输出口858或者在两个出口处测定以独特地鉴定结合的分子结构。
图9图示说明根据本发明的频率测定系统的第二个例示的实施方案。试验920的生物测试装置由具有中心导体921，具有922a腔的第一绝缘体922，第二绝缘体923和外导电体924的共轴布局(图5G所示)组成。溶液926占据922a腔。当然，也可以试验其它电路布局的装置。
一旦将溶液926加入922a腔，则溶液926中的分子形成接近中心导体921的MBL921a。测定期间，信号源910将关联的试验信号912发送给中心导体921。MBL922a调控关联的试验信号912，反射的试验信号932提供独特的信号响应，其可以用来鉴定配体。可以实现一个出口的共轴线路接法，例如，作为皮下针头结构。
B．时间范畴测定系统图10图示说明根据本发明的时间范畴测定系统1000的一个实施方案。该系统包括脉冲源1002和与试验电路输入口1022连接的检测器1004。在一个可替换的实施方案中，另外一个脉冲源和检测器可以连接输出口1028，以提供完全两口测定能力。或者，该系统可以包括一口试验系统，其中信号检测器连接用于接收反射信号的信号线路。在一个具体实施方案中，时间范畴测定系统由时间范畴反射仪例如Tektronix Corporation制备的11801型组成。可以替换使用其它高频率测定系统，例如具有以传导和反射信号脉冲为基础的信号信息的时间范畴测定模式的网络分析器。
在时间范畴测定系统中，输入试验信号1060由时间范畴脉冲，随时间显示的反射部分组成。在该实施方案中，关联脉冲1060发送给传导线部分，所述传导线紧密连接测试表面。由于MBL的电介质性质，一部分关联脉冲1060向检测器1004反射。反射脉冲1070将表现出独特的形状和／或时间延迟，其是MBL电介质性质的特征，其又很大程度上由配体，抗配体和周围溶液的电介质性质决定。因此，反射脉冲1070的脉冲形状和延迟可以用来表征和鉴定配体。该时间范畴试验系统可以用来分别地或者与高频率试验系统结合来鉴定一种或多种未知配体。
C．电介质松弛测定系统如本领域所公知的，一种配体的电介质松弛频率是当对分子施用电场时分子水平的电介质性质改变的速度。如对于配体的电介质性质，电介质松弛频率基本上由对每一个分子独特的结构和结合几何学所决定。因此一旦测定，配体的电介质松弛频率可以用来决定它。
电介质松弛频率可以通过测定配体吸附粉末对频率的速度来定量测定。图11图示说明进行该项测定的系统1100的一个实施方案。测定系统1100类似于图10图示的时间范畴测定系统1000，并且包括脉冲源1102和与试验装置输入口1122连接的检测器1104。另外一个脉冲源和检测器可以连接输出口1128，以提供完全两口测定能力。在一个具体实施方案中，时间范畴测定系统由时间范畴反射仪例如Tektronix Corporation制备的11801型组成。可以替换使用其它高频率测定系统，例如具有以传导和反射信号脉冲为基础的信号信息的时间范畴测定模式的网络分析器。
输入试验信号1160由分开的脉冲组组成，每一组具有两个或多个关联脉冲和不同的脉冲间距。脉冲组1162和1164向紧密连接结合表面的传导线部分发送。如果1162脉冲组具有与电介质松弛周期(松弛频率的倒数)基本上相同的间距，则MBL在连续脉冲中将连续吸收少的能量。在输入口1122或输出口1128处在反射响应1170中可以测定信号吸收的减少。作为可替换的定量测定，在输入口1122或输出口1128处可以测定残留的信号能量。
变化发生时的信号吸收和脉冲间距的变化速度可以作图并且用来表征和鉴定未知的结合分子。可以独立地使用或者与上述时间和／或频率范畴试验系统结合使用该系统表征。
在所有上述系统中，本领域技术人员容易理解这样的系统可以减小至芯片水平，使用根据Microwave Monolithic Integrated Circuits(MMIC)和类似的技术。这样的缩小化的系统可以容易地扩大为能同时检测和测定成百上千或上万个化合物高度平行系统。该系统可以设计获得“逻辑门”，其通过结合作用本身接通，例如通过改变特征电阻和传导和／或反射系数，或者通过改变这样的电路的带通性质，并且使用其作为开／关门。VI．实施例A．实施例1配体结合表面的检测在如图2A所示的生物测试装置中证明了脲酶对于ITO表面的一级结合。该生物测试装置的结合表面包括通过化学气相沉积(CVD)沉积的ITO处理的玻璃盖。仔细检查ITO传导线以保证其中间不含有细微破裂或断裂。用带有TDR程序片的Tektronix11801信号分析器来测定传导线，并且发现具有32Ω宽带参照电阻。线长度大约是2．6毫微秒长度，发现结合表面具有。34Ω电阻，长度大约200皮秒。顶部和底板之间的距离是10密耳，腔长1／2”。没有使用侧墙；取而代之的是顶部和底板的毛细作用将溶液保留在原地。
下面，将d-PBS溶液装入该生物测试装置。装入该生物测试装置后，以45MHz-1GHz范围的试验频率测定基础传导损耗(S21)和回程损耗(S11)S-参数。使用购自Hewlett-Packard公司的HP8510B型网络分析器进行测定和保存。接着以10∶1体积过量加入脲酶。重复传导损耗和回程损耗S-参数并且与基础测定相比较。
下面的表1给出对于100MHz和1GHz的值，图12A和12B中给出了回程损耗和传导损耗测定响应。数据表明该生物测试装置在装有d-PBS的芯片和装有d-PBS+蛋白质的装置之间在100MHz和1GHz分别表现出-0．5dB和-0．42dB的回程损耗(S11)变化。该装置在100MHz和1GHz分别表现出+0．325dB和+0．450dB的传导损耗(S21)变化。
为了测定信号响应是否由于大分子作用(溶液中的蛋白质)或者由于蛋白质结合结合表面，记录每一种响应，并且用25∶1过量体积比的d-PBS(2ml d-PBS对0．075ml腔大小)快速冲洗蛋白质溶液。然后如上所述用该生物测试装置在45MHz-1GHz再次测定。
比较表1后两栏可以看出，从生物测试装置冲洗蛋白质的效果减小了对回程损耗和传导损耗测定的影响。这表明测定作用确实由于生物测试装置中脲酶结合结合表面。一般情况下，注意到用没有配体的相同的溶液代替含有配体的溶液引起非常小的或者没有响应变化。
表1脲酶一级结合的作用
B．实施例2通过一级结合鉴定胶原酶和溶菌酶使用类似于上述实施例1中的一个生物测试装置，并且以相似的方法制备和表征，我们进行了一系列试验来检查1-10GHz频率范围不同的蛋白质的不同响应。对于每一个试验使用相同的装置(以消除一个装置和另一个装置制备中的小的差别)，但是每一种蛋白质应用之间用SDS充分洗涤。图12C和12D分别图示说明1GHz-10GHz范围试验频率下胶原酶和溶菌酶样品一级结合作用的传导损耗测定。在两种情况下，信号响应表现出峰和谷图形，其可以用来独特地检测和鉴定配体。特别地，胶原酶样品的频率响应在接近5GHz处表现出强的正峰。溶菌酶样品的响应表明在接近5GHz处是相对平的响应和在接近8GHz处是强的正峰。对于所检查的其它多种蛋白质的每一种，响应对于每一种蛋白质是独特的，容易鉴定该组中的未知蛋白质。当然，也可以比较和分析另外的光谱点来区分这些和其它分子物质。响应可以保存之后在调出来鉴定未知样品。另外可以总地检查较不明显的峰来确定特殊配体的模式。
C．实施例3检测二级结合刀豆素A对葡聚糖该应用提供了二级结合检测的实施例，使用类似于上述实施例1中的一个生物测试装置，并且以相似的方法制备和表征。刀豆素A(con-A)是可以在jack豆中发现的葡萄糖结合蛋白质，并且可以用作一级结合抗配体。这里所使用的刀豆素A从Sigma化学公司购得。然后使用葡聚糖，一种葡萄糖多糖，作为结合刀豆素A的配体，用葡萄糖作为逆反葡聚糖结合的竞争方法来证明特异性。(葡聚糖和葡萄糖也从Sigma化学公司购得)。
传导线和实施例1中所讨论的相同，标准32欧姆参照电阻，ITO玻璃盖80欧姆DC电阻和标准TDR34欧姆电阻。大约15μM溶液浓度的刀豆素A直接放到该生物测试装置中，并且使达到平衡。蒸发损耗到小室没有干，这一点用目测检查。冲洗系统并且稳定化后，加入葡聚糖结合刀豆素A。检测信号变化后，用10毫克／毫升d-PBS冲洗小室并且第二次测定信号响应。1GHz下该作用在图12E中给出。未结合的响应用作基础响应。如图所示，结合的响应表现出比未结合响应较少损耗0．25dB。通过用葡萄糖竞争掉葡聚糖，接着用d-PBS冲洗使葡萄糖游离，来证实结合特异性。后一步骤使信号回到葡聚糖加到该装置之前获得的基线，因此证明结合作用的特异性。
D．实施例4检测小分子结合使用类似于上述实施例1中的一个生物测试装置，并且以相似的方法制备和表征。安装该生物测试装置和网络分析器用来证明小分子对于大分子结合也可以用本发明检测。为了在较高频率下探测生物测试装置，将该装置可重复地和小心地放置在Faraday箱中以使其屏蔽不受外界影响。这使得在最大20GHz频率下探测该装置。首先向该生物测试装置加入刀豆素A，并且使结合生物电界面。进行传导损耗测定，保存，并且用作基线响应1252，如图12F所示。
接着，向该生物测试装置中加入10毫克／毫升浓度的葡萄糖并且用来结合刀豆素A抗配体。测定传导损耗并且相对于基线响应1252作图来测定由于小分子结合的信号响应。
从图12F可以看出，相应于葡萄糖对刀豆素A结合的结合响应1254与基线测定1252区别开来。特别地，结合响应1254在基线响应1252中没有发现的16-20GHz之间表现出两个大的峰。测定的信号响应1252和1254的不同为当葡萄糖结合了刀豆素A抗配体时的检测提供了基础。接着只是用d-PBS缓冲液冲洗，该响应反向为从刀豆素A解离的结合的葡萄糖。研究葡萄糖对裸芯片(即没有刀豆素A作为抗配体)的作用的分立实验表明单独的葡萄糖如果对在上述频率谱内电磁询问响应由影响的话是极小的，因此表明所示的结果完全是由于葡萄糖结合刀豆素A的作用。
对于生物素结合抗生物素蛋白重复该实验。向该生物测试装置加入抗生物素蛋白作为抗配体，测定传导损耗，保存并且用作基线响应1262。接着，加入1μM浓度的生物素，并且相对于基线测定进行传导损耗测定。结果见图12G所示。
相应于生物素结合抗生物素蛋白的结合响应1264指示14和16GHz之间深度零位和接近20GHz处的一个大的峰。基线响应(指示未结合的抗生物素蛋白)和结合响应1264(指示结合的抗生物素蛋白)之间的差别很大，可以用来检测结合的抗生物素蛋白分子。
E．实施例5定量滴定这些实验证明对于配体结合抗配体的信号变化的大小是占据的位点数目的函数。该试验系统使用类似于上述实施例1中的一个生物测试装置，并且以相似的方法制备和表征，使用葡聚糖结合刀豆素A，用葡萄糖作为竞争抑制剂。围绕刀豆素A的结合常数为这些制备系列稀释。作为抗配体的葡聚糖结合刀豆素A，使得100％结合。使用一系列竞争葡萄糖浓度竞争掉葡聚糖，使得分子结合表面上葡聚糖的浓度相应地降低。
使用上面所讨论的标准传导线连接方法。刀豆素A与分子结合层结合并且稳定该系统。然后用d-PBS冲洗该生物测试装置并且在1GHz获得数据。该竞争滴定的结果在图12H中给出。结果表明葡萄糖浓度从0mg／dl增加到15mg／dl时信号怎样变化。刀豆素A的信号随着葡聚糖的释放而变化，并且葡萄糖被结合(这实际上测定葡聚糖的亲合力)。通过葡萄糖对葡聚糖结合作用的反转也证明了特异性。
表2证明传导损耗变化的大小作为一些选择浓度的葡萄糖浓度的函数。
表2
在刀豆素A的谱中的共振点也进行了简单的葡萄糖滴定。图12I显示回程损耗作为该共振点处葡萄糖浓度的函数的变化，证明两个作用首先，葡萄糖作为一种配体具有剂量-响应作用，其以其对抗配体的作用为基础(在这种情况下是刀豆素A)。其次，光谱是有一些区显示关于配体／抗配体结合作用比其它区灵敏得多。
连续稀释葡聚糖溶液，其浓度低于1皮摩尔(10-15摩尔)表明甚至在这样低的浓度下，明显的信号响应指示发生结合。信号蓄积所需要的时间范围是几分钟至10分钟，但是响应是较高浓度下葡聚糖测定的特征。
F．实施例6检测核酸为了证实检测核酸的能力，制备了用聚赖氨酸作为与金表面连接的抗配体的生物测试装置。使用类似于上述实施例1中的一个生物测试装置，除了金表面，并且以相似的方法制备和表征，在d-PBS缓冲液中制备小牛胸腺DNA的高浓度溶液(大约20μM)聚赖氨酸放在生物测试装置上，并且测定传导损耗响应。检查响应对时间的稳定性并保存。然后用所述缓冲液冲洗小室，然后再一次对响应检查对冲洗和稳定性的变化，并且将响应保存为基线响应。
然后将含有所述DNA的溶液放在所述生物测试装置中，并且通过从基线响应减去得到的响应来测定响应变化，并且观察稳定性。用缓冲液冲洗该生物测试装置以去除大量的DNA，在生物测试装置表面只留下DNA／聚赖氨酸复合体。结果变化如图12J所示。
G．实施例7pH和盐浓度的影响在两个不同的实验中测定pH和盐浓度对信号的影响。为了研究pH的影响，测定一系列缓冲液或者3．94-9．80范围的pH。对于每一种缓冲液测定60Hz导电性来校正游离离子的变化。接着，测定100MHz，1GHz和10GHz下传导损耗响应。结果在图12K中给出。
进行类似的实验测定溶液离子浓度变化的影响。用简单的d-PBS开始制备几种溶液，并且加入不同量的氯化钠。然后测定60Hz导电性并记录，样品依次放在生物测试装置中，并且在100MHz，1GHz和10GHz下测定传导响应。结果在图12L中制图。
如这两个图所示，一些环境变化导致测定的参数的变化。
H．实施例8在全血中测定进行完全的未经处理的人血中肌钙蛋白-I(TN-I)的测定来证实在不清洁环境下检测的能力。用柠檬酸钠处理未经处理的人血以抗凝结。为了校正目的使用对应于TN-I的表位的抗-TN-I抗体。用抗-TN-Iab(抗配体)包被生物测试装置的界面传导线。血样导入10ng／ml浓度的TN-I中，第二个相同的血样没有导入，作为对照。
实验包括抗-TN-IAb抗配体连接装置，然后第一轮没有导入的样品通过该装置；冲洗样品小室几次看一看交换的干扰是什么；接着导入样品，其也被置换几次以确立干扰平台。在每一种情况下，测定传导损耗变化。检查时，从该装置中取出抗-TN-IAb抗配体。接着重复实验作为对照来确定是否是两个血样(假设除了TN-I导入外是相同的)的任何其它性质是变化的原因。下面的表给出了该项实验在1GHz下探测信号的结果。对照Anti-TN-1
在第二系列实验中，从临床实验室获得10个不同的血样，除了用肝素抗凝结外没有处理。一个样品分为两部分，一部分如上面所述导入TN-I抗原。然后用表面上抗-TN-I抗体制备生物测试装置。然后将每一个样品依次通过生物测试装置，最后保留导入的样品。和前面实验一样在1GHz下探测这些样品的每一个的响应，在图12M中给出。导入的样品清楚地与未导入的剩余样品区分开来。
I．实施例9测定分子的四极矩研究抗生物素蛋白与金表面结合的作用来确定分子四极矩的可检测性。抗生物素蛋白是一种四聚体，其由于未结合状态下分子的对称性而在未结合状态中具有非常小的二极矩。图N给出如图所示的具有特征峰的抗生物素蛋白结合的结果。注意，如图12G所示，这些峰比由于生物素的结合而产生的峰小得多。VII．应用本发明的方法和系统可以在各种各样的应用中使用，这里描述其实施例。
本发明可以用来定量测定配体和抗配体之间的结合水平，从而用来测定其它分子对酶活性的作用。例如，溶液中其它分子可以提高或降低结合水平，因此可以测定酶抑制剂或诱导剂的特征。
通过监测抗配体与病原体，肿瘤细胞或者病原体或肿瘤成分，例如蛋白质，细胞膜，细胞抽提物，肿瘤标记物，例如CEA或PSA，或者其它抗原表位等等，的结合，可以测定感染病原体(病毒，细菌，真菌等)或癌的存在。例如，本发明通过在生物测试装置上检测患者血液中的病原体或肿瘤标记物与抗体的结合就能检测病原体或肿瘤。另外，例如，来自患者血液的抗体与病毒蛋白质例如HIV蛋白的结合是监测患者感染病毒的一般试验。另一个常见的实施例是作为前列腺癌恶化标记物的患者血液中前列腺特异性抗原(PSA)的定性测定。
另外，药物受体相互作用，包括膜和非膜两种受体和作为药物结合结果的受体构象变化可以用本发明测定。另一方面，本发明可以用来提供脂质相互作用的信息，例如脂蛋白与脂质结合，和脂质体与脂质的相互作用。
在另外的实施方案中，本发明的技术可以用来提供筛选核酸样品的基因芯片和分类和描述蛋白质的蛋白芯片。这样的芯片使用了本发明独特的能力来同时测定每一结合作用的亲和性，动力学和独特的电介质信号；和以芯片上可寻址测试位点的多重性进行这些测定。地址的精确性质将取决于应用，但是一般的策略如下用变量Keq，kA和ω=(ω1，ω2，ω3，…)确定矢量空间，其中这些变量代表平衡常数，动力学常数和一套基础N频率，在该频率下测定电介质性质。这样确定N+2维空间，在其中可以将每一个结合作用图示出。接着选择一组参照分子，其代表所感兴趣的结合谱，例如一组具有不同核酸序列的寡核苷酸或者选择抗体，其对于蛋白质功能域或者蛋白质的其它亚结构是特异性的，将它们与芯片上可寻址点连接。向芯片加入特定的分子种类或者一组种类，然后对于每一个地址探测上面确定的矢量空间(或者其合适的亚结构)中每一个点的值。然后可以用矢量空间中的一个地址代表每一个种类。该系统的复杂性将取决于矢量空间的大小和表面上不同的固定的配体的总数目。
按照上面的实施例，认为简单的系统由两个不同的核酸探针组成，这些探针在4个不同的频率下分析；此外，每一个频率可以分析成10个不同的振幅。这样一种系统可以具有10亿个可能的地址(对于第一多态性是104，对于第二多态性是104)。该系统中放置的未知物将由该形式的独特地址代表[(1，5，3，7)(4，8，6，7)]，其中头4个数代表第一探针在4个选择的频率下的光谱响应，后4个数代表第二探针在4个选择的频率下的光谱响应。因此，只用两个探针和4个频率，可以产生10亿各特征地址。
在针管腔中提供最小生物测试装置的“Smart Needle”IV测试也可以使用本发明的方法。该实施方案可以用来提供在急诊室和其它护理环境等中使用的低成本且安全的医疗诊断装置。应用的例子包括诊断急性症状，例如心脏病发作，传染病例如细菌性脑膜炎或者新生期／产期Group B Step感染，凝血病，加强护理期胎儿和新生儿充氧；护理点环境下诊断慢性疾病，例如健康护理办公室和偏远地区。
所述生物测试装置具有多个生物结合配偶体，允许同时测定样品中分析物的多样性。另外，单一分析物对于多种不同种类生物结合配偶体的结合的测定为非特异性结合提供了对照。试验样品中不同分析物的结合的程度的比较使评价不同分析物的相对增加或减少。
本发明的生物测试装置可以用来体内或离体检测几乎任何分析物。尽管在一个优选的实施方案中分析物可能是一种生物分子，但是不必须受此限制，只要特异性结合配偶体是可获得的或者在这里所描述的本发明的一些实施方案中可以测定分析物的一些其它性质。合适的分析物实际上包括生物材料或者从其中处理出的材料中发现的任何分析物。实际上使用本发明方法可以检测优选可以悬浮于或溶解于水溶液中的任何分析物。所感兴趣的分析物的实施例包括1)抗体，例如HIV2)抗体，helicobacter pylori，肝炎(例如甲肝，乙肝和丙肝)，麻疹，流行性腮腺炎和风疹；2)滥用药物和它们的代谢副产物，例如可替宁，可卡因，苯甲酰芽子碱，benzoizazpine，四氢大麻酚，烟碱，乙醇；3)治疗药物，包括茶碱，苯妥英，对乙酰氨基酚，锂，地西泮，去甲替林，司可巴比妥，苯巴比妥等等；4)激素和生长因子，例如睾酮，雌二醇，17-羟基孕甾酮，孕甾酮，甲状腺素，促甲状腺激素，促卵泡激素，促黄体素，α转化生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子I和II，生长激素释放抑制因子，和性激素结合球蛋白；和5)其它分析物，包括葡萄糖，胆甾醇，咖啡因，皮质类固醇结合球蛋白，DHEA结合糖蛋白等等。
上面提到的合适的分析物包括但不限于蛋白质，糖蛋白，抗原，抗体，核酸，糖，碳水化合物，凝集素等等。但是用本发明方法也可以检测和／或定性较大的，多分子，实体，例如细胞，细胞膜和其它细胞组成。因此，可以检测和／或定性例如具有特征表面标记(例如受体，凝集素等等)的微生物(例如细菌，真菌，藻类等等)(例如在来自动物或植物的生物样品中)。类似地，可以检测和／或定性具有特征标记(例如肿瘤细胞超表达IL-13受体(参见例如美国专利5614191))的细胞类型(例如具体组织的细胞特征)。因此可以检测和／或定性特殊病理，分化的特殊状态(或者没有)或者特殊组织类型的细胞特征。生物结合配偶体(配体或抗配体)效应分子“芯片”表面的接合在一个实施方案中，生物结合配偶体(配体或抗配体)与隐伏表面(例如生物电界面)化学接合。化学结合的方法对于本领域技术人员是公知的(参见，例如单克隆抗体原理与应用，第4章，Birch和Lennox编著，John Wiley ＆ Sons，Inc．N．Y．(1995)，其描述了抗体与抗癌药物的结合，标记包括放射标记，酶等)。
结合配偶体(例如蛋白质，抗体，糖蛋白，核酸，凝集素，糖，碳水化合物等等)与表面的连接的方法将根据结合配偶体的化学结构而不同。多肽一般包含多种官能团，例如羧酸(COOH)或者游离胺(-NH2)基团，它们适合它们所键合的表面或连接体上有合适的官能团的反应。类似地，其它生物分子，例如核酸，糖，碳水化合物，都包含是适合的键连位点的各种各样的官能团(例如OH，NH2，COOH，-S等)。
或者，瞄靶分子和／或效应分子可以被衍生物化以获得或连接另外的反应官能团。衍生物化作用可以包括连接任何数目的连接体分子，例如从Pierce Chemical Company，Rockford Illinois可购得的那些。
这里所使用的“连接体”是一种分子，其可以用来连接生物结合配偶体(例如配体或抗配体)与隐伏表面(例如仪器或装置)。该连接体能对生物结合配偶体和对潜伏表面两者形成共价键。合适的连接体是本领域技术人员公知的，包括但不限于直链或支链的碳连接体，杂环碳连接体或者肽连接体。
可以使用具有与表面上一个基团反应的官能团和与结合配偶体反应的另一个基团的双功能连接体来形成期望的结合。或者，衍生物化作用可以包括化学处理结合配偶体和／或基质。例如，可以对二氧化硅或玻璃基质硅烷化产生官能团。类似地，可以将蛋白质或糖蛋白衍生物化，例如通过用高碘酸将与蛋白质抗体连接的糖基部分乙二醇裂解产生自由醛基。抗体或蛋白质或糖蛋白上的自由醛基可以与表面上自由胺或肼基反应，结合结合配偶体(参见美国专利4671958)。在多肽例如抗体或抗体片段上产生自由巯基的方法也是公知的(参见美国专利4659839)。
各种各样的生物分子与各种各样的金属，玻璃，塑料等等连接的很多方法和连接体是本领域技术人员公知的。参见，例如，欧洲专利申请188256；美国专利4671958，4659839，4414148，4699784，4680338，4569789，和4589071；Borlinghaus等(1987)癌症研究474071-4075。连接免疫毒素中丰富的抗体，蛋白质和糖蛋白的方法，文献可以参见，例如“Monoclonal Antibody-Toxin ConjugateAimingthe Magic Bullet”，Thorpe等，临床医学中的单克隆抗体，科学出版社，pp．168-190(1982)，Waldmann，科学，2521657(1991)，美国专利4545985和4894443。核酸结合配偶体的应用当结合配偶体是核酸(例如DNA，RNA，肽核酸等)时，在“严格”条件下优选实现特异性结合，条件越严格，杂交的特异性越高。
本领域技术人员常规完成对于任何探针／靶物结合的严格条件的选择。此外，可以通过逐渐增加条件的严格性(例如渐增的盐度，渐增温度等等)直到获得期望水平的特异性来凭经验确定严格性。
严格条件的“起始点”是公知的。例如，期望的核酸在42℃50％甲酰胺的杂交和冲洗条件下与互补核酸杂交。也可以选择其它严格杂交条件。一般情况下，在确定离子强度和pH下，选择比具体序列热溶解温度(Tm)低大约5℃的严格条件。Tm是50％靶序列与完全匹配探针杂交时的温度(在确定离子强度和pH下)。一般情况下，严格条件是pH7下盐浓度是至少大约0．02摩尔和温度是至少大约60℃下的那些条件。因为其它因素可以明显影响杂交的严格性，所述其它因素包括互补链的碱基组成和大小，有机溶剂的存在和碱基错配的程度，参数的组合比任何一个参数的绝对测定都更重要。核酸杂交的大量指导参见Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology current Protocols，a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc and John Wiley and Sons，Inc．(1998年增刊)。
用作结合配偶体的寡核苷酸是化学合成的，例如根据Beaucage，S．L．和Carruthers，M．H．1981，四面体快讯，22(20)1859-1862首次描述的固相亚氨基磷酸三酯方法，使用自动合成仪，根据Needham-VanDevanter，D．R．，等，1984，核酸研究，126159-6168所述。根据Peatson，J．D．和Regniier，F．E．(1983)，J．Chrom．255137-149所述，或者通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或者通过阴离子交换HPLC来纯化寡核苷酸。可以使用Methods Enzymol，65499-560中的Maxam，A．M．和Gilbert，W．(1980)的化学降解方法证明合成的寡核苷酸序列。
该生物测试装置有多种用途，例如包括对大量的分子筛选生物活性或者对生物样品筛选存在或不存在一定浓度的一种特定成分或几种成分。例如为了筛选生物活性，该结合层暴露给一种或多种受体，例如抗体或全细胞。通过测定结合层抗配体和配体之间的相互作用，可以确定其存在和浓度。该项技术的特别优点是检测该相互作用时不需要标记。使用各分子的固有性质来检测它们的存在和量，不存在，或者与其它分子的相互作用。
生物测试装置或芯片的其它可能的应用包括诊断，其中特殊受体的各种抗体用来形成结合层，例如对血液筛选免疫缺陷。任意地制备该生物测试装置使其适合皮下注射针头孔。只需要极少血样来检测结合层上预先放置的抗配体。可以进行诊断测试对来自病原体例如病毒或细菌的临床相关分析物的全部范围测定代谢活性，例如葡萄糖浓度或者脂质水平，对肝酶，电电解质，凝结因子，特异性抗体例如ANA(在风湿病中使用)和变应性反应抗体，动脉血充氧，滥用药物等等进行常规系列测试。
该领域使用的生物测试装置可以是价廉可随意使用的芯片，因为它们容易制备并且不限于半导体加工。例如，任意地在廉价材料例如塑料或玻璃基质上制备芯片。任何任意地将芯片置于下面所描述的装置中，信号沿着该生物测试装置传导来测定由于血液中的配体的结合相互作用。事实上，可以制备含有对于多种不使用标记的检测的生物应用和化学应用的不同结合层的很多不同形状和大小的生物测试装置。
通过测定对未知蛋白质上结构部位的结合可以分类和／或鉴定未知的和未表征的蛋白质。例如，相同或相似类别的蛋白质具有结构同源性；也就是说给定类别蛋白质中再现功能域这样的亚结构。通过用多个可寻址阵列制备芯片，每一个具有对于同源性亚结构的抗配体，可以如下分类和／或鉴定未知分子种类通过每一个与其各自抗配体的结合检测特定亚结构的存在。然后通过例如亲和性，动力学和光谱响应这样的定性来表征各亚结构结合作用。然后在未知分子种类的响应和从已知蛋白质获得的数据之间进行相关性研究。没有发现精确吻合的情况下，可以以和对于有机分子的核磁共振谱相同的方式将未知化合物的详细结构的大部分联合起来。
在另一个实施方案中，该项技术可以用来开发用于核酸检测的基因芯片。基因芯片是用于样品中互补核酸检测的核酸阵列。根据通过基因芯片上不同的DNA分子结合测定，存在互补DNA是期望的结果。在不发生互补结合的情况下，可以通过测定物理定性如亲和性，熔点或者其它严格条件，和信号的直接光谱响应并与先前测定的数据相关联来测定和表征部分杂交。用这种方法，不需要分离各多态性序列就可以在多态性全范围内检测核酸序列形式的单一抗配体。例如，只有几百个不同的核酸序列的芯片可以检测成千上万个不同的多态性。
可以为了鉴定药物靶物，细菌鉴定，基因型和其它诊断需要设计基因芯片。该项技术需要将必要的核酸，一般是探针，连接到底物上，并且需要一种方法来测定互补核酸与那种底物的结合。通常情况下，需要标记样品的核酸，最常用荧光探针。本项技术消除了对于标记样品DNA的需要和相应的问题。可以为了药物靶物鉴定，分子诊断和生物竞争试剂的检测和鉴定中的特殊需要开发基因芯片。可以制备和使用的其它类型的装置是免疫测定装置，药物研究装置和毒性测定装置，分析装置等等。
这里所描述的本发明也可以用于新药研究的很多方面，从最初的筛选过程至临床试验治疗检测整个过程。在发现药物的最初阶段，使用本发明可以有利于靶物鉴定，证实和高产率筛选(HTS)。靶物受体可以是生物测试装置上的抗配体，通过鉴定已知的激动剂，拮抗剂或者别构剂的作用，可以快速鉴定和证实用于高产率筛选的初始靶物。在HTS方法中，检测成千上万种化合物以确定它们中哪一个可以结合靶物。这里所描述的本发明可以最小化，使得实现高度平行的实现平台；所述平台能够同时筛选成千上万种3化合物，并且同时测定结合作用(例如激动剂或拮抗剂)，亲和性，动力学等等。另外，这样的小化系统需要非常少量的化合物，因此从供应商购买这些化合物时大大节约了成本。通过使用该生物测试装置形成的检测系统提供了高产率测定系统，因为检测任意地在真实时间发生，而且可以快速分析很多样品。任意地在纳秒时标检测响应周期。一旦分子相互结合就发生检测。任意地需要更长时间来测定低浓度或者低结合亲和性分子之间的结合作用。实际时间任意地被扩散速度限制。除了这些潜在的限制外，例如在一个小时内，上千种化合物任意地非常快地通过该系统。例如，使用芯片制备技术，10000道装置(使用一些微液引出技术)是可能的，使用小体积和短的扩散时间，只是在反应开始时进行动力学测定，任意地每小时测定一千万个样品。对于已知浓度，任意地单从动力学计算出结合亲和性，可以在非常快的时标探测该装置，并且从动力学曲线的斜率计算和／或估计亲和性。动力学和亲和性的参考可以参见所有的标准生物化学或化学教科书，例如Mathews and vanHolde，生物化学，Benjamin Cummings，纽约，1990。
本发明可以容易地扩展到细胞基础测定，因为检测不需要样品纯化和扩增。在这些类别的应用中，可以通过检测外表达或者通过溶解细胞以释放胞质成分对细胞系统监测各种变化和检测所感兴趣的一种或多种分析物的存在。
本发明也适合“芯片试验”应用。因为容易缩小化，可以实现其中包含上千种或者成千上万可寻址生物测试装置的非常小的芯片。检测器可以制成一种“逻辑门”，其中特定配体或分析物的存在对开启该门或者关闭该门有影响，这一点适合给定应用。可以以多种方法实现这样一种门，其将结合作用翻译成电磁信号，所述信号可以设计成两个可能状态中的一个相应于关和开，1或0，等等。两个状态可以是相应于结合和未结合的不同频率的共振腔或波导，或者是相应于结合和未结合的传导线或波导中振幅变化，或者特定电路带通变化，等等。
上面只是本发明可能的实施方案的详细描述，可以使用各种替换，改变和等价物。例如本领域技术人员将理解上述生物测试装置的信号线路不局限于传导线。也可以替换使用其它传导介体，例如导体或电介质波导。此外，本申请中引述的所有公开物和专利文献其所有目的全文引作参考，其程度和各个公开物和专利文献各个公开的一样。上述描述只是本发明的例示的实施方案，所附的权利要求书恰当地定义了本发明范围。
权利要求
1．一种检测与分子结合层相关的一种或多种性质的方法，所述方法包括下面的步骤提供沿着信号线路的表面连接的分子结合层；以及沿着所述信号线路传导试验信号，其中所述试验信号与所述分子结合层连接，并且相应地，表现出信号响应。
2．根据权利要求1所述的方法，其进一步包括测定所述信号响应的步骤。
3．根据权利要求1所述的方法，其中所述信号线路的所述表面是衍生物化的。
4．根据权利要求1所述的方法，其中所述分子结合层包括与配体结合的抗配体。
5．根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将一种分析物加入所述分子结合层的步骤，其中所述加入的分析物与所述分子结合层相互作用。
6．根据权利要求1所述的方法，其中所述加入步骤发生在所述传导所述试验信号步骤之前。
7．根据权利要求6所述的方法，其中分析物在一种溶液中。
8．根据权利要求7所述的方法，其中所述溶液包括体液样品。
9．根据权利要求1所述的方法，其中所述信号线路包括第二电磁耦合的源线路。
10．一种检测配体和抗配体之间的一种或多种分子结合作用的方法，所述方法包括下面步骤信号线路的一部分暴露给含有第一配体的第一溶液，所述暴露的信号线路部分包括第一分子结合层，其中所述暴露的信号线路部分包括连续传导线；和沿着所述信号线路传导第一试验信号，其中所述试验信号连接所述分子结合层并且表现出指示所述第一配体和所述抗配体之间的所述结合作用的检测的第一信号响应。
11．根据权利要求10所述的方法，其进一步包括以下步骤将所述信号线路部分暴露给含有第二配体的第二溶液；和沿着所述信号线路传导第二试验信号，其中所述试验信号连接所述分子结合层并且表现出指示所述第二配体和所述抗配体之间的所述结合作用的检测的第二信号响应。
12．根据权利要求10所述的方法，其中抗配体是抗体。
13．一种检测与分子结合层相关的一种或多种性质的方法，所述方法包括下面步骤提供沿着信号线路分表面连接的分子结合层；和所述试验信号沿着所述信号线路传导，其中所述信号线路的所述表面的切线与所述试验信号的信号传导的方面不是垂直的，其中所述试验信号与所述分子结合层连接，相应地表现出信号响应。
14．一种检测与分子结合层相关的一种或多种性质的仪器，所述仪器包括具有一个信号输入口，一个信号输出口和其中连续的导电区的信号线路；和所述分子结合层连接所述信号线路。
15．根据权利要求14所述的仪器，其中所述信号输入口和信号输出口包括相同的口。
16．根据权利要求14所述的仪器，其中所述信号输入口和信号输出口包括两个物理分开的口。
17．根据权利要求14所述的仪器，其中所述分子结合层包括配体／抗配体复合体。
18．根据权利要求14所述的仪器，其中所述分子结合层包括衍生物化的导电层。
19．根据权利要求14所述的仪器，进一步包括沿着所述信号线路的留下的溶液的剩下的结构。
20．根据权利要求14所述的仪器，其中所述试验信号在大于1MHz的频率下传导。
21．根据权利要求14所述的仪器，其中所述信号线路包括传导线结构。
22．根据权利要求14所述的仪器，其中所述信号线路包括共振腔。
23．一种检测配体和抗配体之间的一种或多种分子结合作用的方法，所述方法包括下面步骤对信号线路一部分施加第一溶液和第一配体，其中沿着所述信号线路的所述部分的表面预先形成了包括所述抗配体的第一分子结合层，所述分子结合层位于比所述溶液更接近所述信号线路；和沿着所述信号线路传导试验信号，所述信号线路包括连续沿着所述表面的线路，其中所述试验信号连接包括配体／抗配体复合体的所述分子结合层并且表现出第一信号响应。
24．一种检测配体和抗配体之间的一种或多种分子结合作用的方法，所述方法包括下面步骤对信号线路施加一种溶液和一种配体，其中沿着所述信号线路的至少部分的至少表面预先形成了包括所述抗配体的分子结合层；和沿着所述信号线路传导试验信号，所述信号线路包括相对于所述表面的不垂直的线路，其中所述试验信号连接包括配体／抗配体复合体的所述分子结合层并且表现出第一信号响应。
25．根据权利要求24所述的方法，进一步包括下面的步骤保存所述信号第一信号响应；对所述信号线路的所述部分施加含有一种配体或抗配体的第二溶液；沿着所述信号线路形成第二分子结合层，所述第二分子结合层包括所述配体和所述抗配体，沿着所述导电表面传导第二试验信号，其中所述第二试验信号连接所述分子结合层并且相应地表现出第二信号响应，所述第二信号响应不与所述第一信号响应相关联。
26．根据权利要求24所述的方法，进一步包括下面的步骤沿着所述信号线路传导第二试验信号；比较所述第一和第二信号响应；和如果所述第二信号响应不与预定范围内的所述第一信号响应相关联，则测定变化的所述溶液的电介质性质。
27．根据权利要求26所述的方法，进一步包括下面的步骤所述第一信号响应与第一已知电介质性质相关联；所述第二信号响应与第二已知电介质性质相关联；从所述第二已知电介质性质的量去除所述第一电介质性质的量。
28．确定一种未知配体分类的方法，该方法包括下面步骤提供连接第一分子结合层的信号线路，所述分子结合层包括N个用于与N个配体亚结构结合的抗配体；对所述分子结合层施加含有多个未知配体的溶液；相应地，沿着所述信号线路形成第二分子结合层，所述第二分子结合层包括N个抗配体；将N个试验信号传导给所述N个抗配体；提供N个已知信号响应，所述N个已知信号响应确定已知的配体分类；其中所述N个试验信号的每一个连接所述N个抗配体，并且相应地表现出N个指示所述N个亚结构的每一个存在的测定的响应；其中如果预定数目的所述N个已知信号响应在预定范围内与所述N个测定响应相关联，则测定所述未知配体在所述已知分类内。
29．一种鉴定未知分子结合作用的方法，所述方法包括下面步骤提供信号线路；对所述信号线路施加含有第一配体的第一溶液；相应地，沿着所述信号线路形成第一分子结合层，所述第一分子结合层包括所述第一配体，其中所述第一分子结合层连接信号线路的表面；沿着所述信号线路传导第一试验信号，其中所述第一试验信号连接所述分子结合层并且相应地表现出第一信号响应；提供相应于已知分子结合作用的已知信号响应；比较所述第一信号响应和所述已知信号响应，其中如果所述第一信号响应与预定范围内的所述已知信号响应相关联，则所述未知分子结合作用包括所述已知分子结合作用。
30．一种定量测定一种溶液中配体的未知浓度的方法，包括下面步骤提供连接第一分子结合层的信号线路，所述分子结合层包括至少一种抗配体；对所述分子结合层施加具有已知浓度配体的溶液以获得来自传导的试验信号的第一信号响应；以一种或多种不同的已知浓度重复所述施加步骤；信号与已知浓度相关联；对传导的试验信号测定第二信号响应；和第二信号响应与所述规则系统相关联。
31．一种用于检测一种配体或抗配体存在的仪器，包括包括连续导电区的信号线路；连接至少一部分所述连续导电区的分子结合层，所述分子结合层包括所述配体或抗配体；和连接所述分子结合层的溶液。
32．用于检测溶液中一种配体的存在的生物电界面，包括包括连续导电区的信号线路；提供所述配体的溶液；和连接所述信号线路和所述溶液的分子结合层，所述分子结合层包括所述配体。
33．根据权利要求32所述的生物电界面，进一步包括地平面；和在所述地平面和所述溶液直接连接的电介质层。
34．根据权利要求32所述的生物电界面，其中所述分子结合层作为所述传导线路和所述溶液之间连接的分路电路操作。
35．根据权利要求32所述的生物电界面，其中所述溶液操作所述分路MBL电路和所述地平面之间连接的分路电路。
36．根据权利要求35所述的生物电界面，其中所述分子结合层包括沿着所述信号线路连接的串联R-L电路的电学特征。
37．根据权利要求36所述的生物电界面，其中所述溶液包括沿着所述信号线路连接的串联R-L电路的电学特征。
38．根据权利要求32所述的生物电界面，进一步包括地平面；和在所述信号线路和所述地平面之间连接的电介质层。
39．根据权利要求38所述的生物电界面，其中所述分子结合层作为连接所述信号线路的分路电路操作。
40．根据权利要求39所述的生物电界面，其中所述溶液包括与所述分子结合层连接的并联L-R-C电路的电学特征。
41．根据权利要求32所述的生物电界面，其中所述分子结合层接近地平面。
42．根据权利要求32所述的生物电界面，其中所述分子结合层接近信号和地平面两者。
43．根据权利要求32所述的生物电界面，其中所述分子结合层接近波导的一部分。
44．根据权利要求32所述的生物电界面，其中所述分子结合层接近微芯片的一部分。
45．根据权利要求32所述的生物电界面其中所述分子结合层接近和插入在共振腔的一部分中。
46．根据权利要求32所述的生物电界面，其中信号线路包括输入源线路和输出信号线路。
47．一种使用试验信号检测配体的存在的仪器，该仪器包括包括连续导电区并且具有用于在其间传输所述试验信号的第一口和第二口的信号线路；连接所述信号线路的分子结合层，所述分子结合层包括所述配体；和用于将所述配体送递给所述分子结合层的连接所述分子结合层的溶液。
48．根据权利要求47所述的仪器，其中溶液是一种体液。
49．根据权利要求48所述的仪器，其中体液是一种血液。
50．一种检测分子结合作用的系统，包括用于发射试验信号的信号源；连接所述信号源的生物测试装置，包括包括连续导电区的信号线路；含有产生所述分子结合作用的配体的溶液；和包括所述配体的第一分子结合层；和连接所述信号线路的信号检测器，其中所述试验信号沿着所述信号线路传导并且连接包括该配体的所述分子结合层，并且相应地表现出信号响应，所述信号响应指示所述分子结合作用的存在。
51．根据权利要求50所述的试验系统，其中所述试验信号包括随着频率变化的信号并且其中所述信号响应包括所述试验信号的传导损耗S21频率响应。
52．根据权利要求50所述的试验系统，其中所述试验信号包括随着频率变化的信号并且其中所述信号响应包括所述试验信号的回程损耗S11频率响应。
53．根据权利要求51或52所述的试验系统，其中所述试验信号包括共振响应的频率、变化信号。
54．根据权利要求51或52所述的试验系统，其中所述试验信号包括非共振响应的频率、变化信号。
55．根据权利要求51或52所述的试验系统，其中所述试验信号包括纯频率或频率变化信号并且其中所述信号响应包括一个或多个所述频率的位移。
56．根据权利要求50所述的试验系统，其中所述试验信号包括时间范畴波形和所述信号响应包括发送的时间范畴响应。
57．根据权利要求50所述的试验系统，其中所述试验信号包括时间范畴波形和所述信号响应包括反射的时间范畴波形。
58．根据权利要求50所述的试验系统，其中所述试验信号包括变化脉冲间距的时间范畴波形和所述信号响应包括反射的时间范畴波形。
59．在用于生物测试装置的计算机控制分子结合作用检测系统中的用于检测与分子结合层相关的一种或多种性质的计算机程序产品，所述生物测试装置具有沿着信号连接的分子结合层，该计算机程序产品包括指导所述处理器指示所述系统沿着所述信号线路传导试验信号的程序，其中所述试验信号连接所述分子结合层，并且相应地，表现出信号响应；和用于保存所述程序的计算机可读保存介体。
60．根据权利要求59所述的计算机程序产品，进一步包括指导所述处理器指示所述系统测定信号响应。
61．在用于生物测试装置的计算机控制分子结合作用检测系统中的用于检测配体和抗配体之间的一种或多种分子结合作用的计算机程序产品，所述生物测试装置具有沿着信号连接的分子结合层，该计算机程序产品包括指导所述处理器指示系统将第一溶液施加给所述信号线路的一部分的程序；和指导所述处理器指示系统沿着所述信号线路传导第一试验信号的程序，其中所述试验信号连接所述分子结合层，并且表现出指示所述第一配体和所述抗配体之间的所述结合作用的检测的第一信号响应；和用于保存所述程序的计算机可读保存介体。
62．根据权利要求61所述的计算机程序产品，进一步包括指导所述处理器指示系统将信号线路的所述部分暴露给含有第二配体的第二溶液的程序；和指导所述处理器指示系统沿着所述信号线路传导第二试验信号的程序，其中所述试验信号连接所述分子结合层，并且表现出指示所述第二配体和所述抗配体之间的所述结合作用的检测的第二信号响应。
63．在用于生物测试装置的计算机控制分子结合作用检测系统中的用于确定溶液中所含有的未知配体的分类的计算机程序产品，所述生物测试装置具有连接包括N个结合N个配体亚结构的抗配体的分子结合层的连续导电区，该计算机程序产品包括指导所述处理器指示系统将第一溶液施加给所述信号线路的一部分的程序；和指导所述处理器指示所述系统对所述分子结合层施加含有多个未知配体的所述溶液，其中沿着所述信号线路形成第二分子结合层，所述第二分子结合层包括所述N个抗配体的程序；指导所述处理器指示所述系统将N个试验信号传导给所述N个抗配体的程序；指导所述处理器指示所述系统提供N个已知信号响应，所述N个已知信号响应确定已知配体分类，其中所述N个试验信号的每一个连接所述N个抗配体，并且相应地，表现出指示所述N个亚结构的存在的N个检测的响应的程序；指导所述处理器指示所述系统测定预定数目的所述N个已知信号响应是否在预定范围内与所述N个测定的响应相关联的程序；和用于保存所述程序的计算机可读保存介体。
64．在用于生物测试装置的计算机控制分子结合作用检测系统中的用于定量测定溶液中配体的未知浓度的计算机程序产品，所述生物测试装置具有沿着信号连接的分子结合层，该计算机程序产品包括指导所述处理器指示所述系统将具有已知浓度的配体的溶液施加给所述分子结合层以获得来自传导的试验信号的第一信号响应的程序；指导所述处理器指示所述系统以一种或多种已知浓度重复所述施加步骤的程序；指导所述处理器指示所述系统将信号与已知浓度相关联的程序；指导所述处理器指示所述系统测定对于传导的试验信号的第二信号响应的程序；指导所述处理器指示所述系统将第二信号响应与所述规则系统相关联的程序；和用于保存所述程序的计算机可读保存介体。
全文摘要
本发明涉及使用结合的分子结构独特的电介质性质检测分子结合作用和其它环境作用的系统和方法。分子结合层沿着信号线路表面连接。试验信号沿着该信号线路传导,从而试验信号与分子结合层连接,并且相应地,表现出信号响应。
文档编号G01N27/30GK1292087SQ99803583
公开日2001年4月18日 申请日期1999年2月1日 优先权日1998年2月2日
发明者约翰·赫夫蒂 申请人:西格雷特生物科学有限公司