鉴定和证实天然组合物一致性生物功能度的方法

专利名称：鉴定和证实天然组合物一致性生物功能度的方法
本申请要求美国临时申请系列号60/092,686和美国临时申请系列号60/094,360的专利权益，前者于1998年7月14日提交，后者于1998年7月28日提交。
不同于药剂，对于天然组合物的评定和标准化常常是一个难题。其成分可能难以测定，并且常常是太多以至不能用统计学置信度使之标准化。此外，天然产品的化学组成成分还将取决于其材料在哪里及如何生长、收获和加工，以及环境条件如养料和病虫害。并且，这里活性成分可能是未知的，对于一种类型化合物的这种标准化处理还可能不利于其活性，或者对于推测有效的多种活性成分的适当比例也可能是未知的。
在基于标准化处理天然原料的传统定性分析确证技术的环境下，发展形成了天然产品和其它食物治疗补品市场。如上面所提到的，这种确保质量和一致性的策略并不保证通过在产品标签上声称而推销的这类产品具有一致的生物作用。例如，一种被称为贯叶金丝桃的流行产品，其暗示的质量是基于对单一化学物质(金丝桃素)的标准化，而这种化学物质可能并不引起导致贯叶金丝桃被销售的功效。
在美国，由于“食物疗法补品的卫生和教育条例”(DSHEA)的许可，消费者对天然产物的印象是营养供给和普遍保健作用的非特异性陈述，例如“抗氧化剂保持细胞的完整性”。这种类型的声明含意是告知消费者有关在保持正常的身体结构和功能中的潜在功效，而没有像需要在“联邦食品、药物和化妆品条例”(FFDCA)管制之下那样直接声明对特定健康问题的治疗。
因为对于这些产品的声明正在变得逐步升级，并相应地也受到消费者和管理机构更仔细的检查，所以越来越重要的是，建立质量确证的方法，以使这些声明具有充分依据，并把没有提供其声明功效的大众产品与这样做了的产品区分开。
在提供其声明的功效时，建立和使用为评估天然产品功效而设计的生物试验法，提供了一种评价一些材料质量和含量的方法，这种材料含有的化学组分数量在不同的制备物中可以有明显的改变。此外，与传统地被设计通过单一作用模式表现特异性和疗效的药剂不同，天然产品倾向于具有多个作用部位或多种作用模式，当将它们合并时，会产生预期的功效。
本发明的目的是致力于解决上述有关确保与天然产品功能作用相应的生物活性可靠水平的问题。
本发明是关于一种评价天然组合物或提取物生物功能性的方法，此方法包括使天然组合物经受模拟的消化，模拟的吸收，或者经受此二种作用，以便获得该天然组合物的一种制备物，然后确定该制备物中存在或者不存在一种或几种成分或者生物活性，以及使该制备物中存在或者不存在此一种或几种成分或者生物活性与该天然组合物或提取物的生物功能性相关联。模拟的消化和模拟的吸收可以是相继地进行或者同时进行。
模拟的消化可以是模拟的胃消化或模拟的肠消化，或者可以是二者的组合形式。模拟的消化在酸性胃液中进行，优选pH大约1.2，并且其中还可能含有在酸性条件下具有活性的消化酶，或者在中性肠液中进行，优选pH大约7.4，其中还可能含有在中性条件下有活性的消化酶。
模拟的吸收包括为了模拟生物有效度一些成分或生物活性的跨膜转运。在优选的实施方案中，此膜是单层的Caco-2细胞。本发明的一个目标是，为任何给定的天然组合物提供一种检测系统，其中此系统是为了评估那种组合物相关生物功能度而特制的。本发明提供了几种检测方法，用于评估天然组合物在体内预期的生物功能度，并因此可评估该天然组合物对治疗某一选择性病理状态的效用，或者作为对人消耗食物疗法补品，用于保持健康结构和功能的效用。有效的检测法还可以包括可明确或测定可能与天然组合物有关的不良作用的检测法。
本发明还进一步针对含有天然组合物的食物疗法补品，此补品具有基本上按批次的组成一致性，可通过一种方法评估所述组成一致性，此方法包括使该食物疗法补品或天然组合物的样品经受模拟的消化，模拟的吸收或者这二种作用，以便获得该样品的制备物，然后确定该制备物中存在一种或几种成分，以及使一种或几种成分的存在与组成一致性相关联。
所谓的组成一致性是指至少一种所需活性成分或生物活性的基本上一致的按批次生物功能度。
本发明的另一方面是一个测定系统，用于对天然组合物建立标准，以及用于确保天然食物疗法补品的品质和一致性。不是仅仅试图鉴定和定量测定被消耗的任何给定复杂天然组合物的活性成分，而是设计此检测系统以便评估被消耗的那种组合物的整体生物功能度，并且依赖于专门特制的检测法以便对相应的天然产品确保其功效和一致性。
本发明还进一步针对一种方法，用于制备包含具有基本上按批次一致性的天然组合物的食物疗法补品，可通过一种方法评估这种组成的一致性，此方法包括使该天然组合物的样品经受模拟的消化，模拟的吸收，或者这二种作用，以便获得该样品的制备物，然后确定在此制备物中存在或不存在某一种或几种成分，并选择含有该一种或几种成分的制备物。
本发明还涉及一种用于评价银杏组合物生物活性的新颖方法，包括在有该组合物存在时使一种神经细胞经受一种或几种有效降低该神经细胞活度的物质或条件，并测定此神经细胞的活度。
本发明的另一方面是一种用于评价锯齿棕组合物生物活性的新颖方法，包括通过提供一种含有该组合物、5-羟色胺，复合了HSP90的未被结合的雄性激素受体和雄性激素应答成分DNA的混合物，并检测雄性激素受体-雄性激素应答成分DNA复合物的形成，来检测对雄性激素应答受体转变成DNA结合形式的抑制作用。
图2显示紫松果菊参照品经受模拟消化的制备物对激活巨噬细胞能力的剂量-反应，数据代表三个重复培养孔的平均值。标准差小于5％。
图3显示在模拟消化之后，与二个参照标准品和一个安慰剂相比较，7个紫松果菊原料样品激活巨噬细胞的能力。数据代表三个重复培养孔的平均值±标准差。
图4显示模拟消化之后，与参照标准品相比较，11个紫松果菊产品样品激活巨噬细胞的能力(对安慰剂作了校准)。数据代表三个重复培养孔的平均值±标准差。
图5显示对于紫松果菊参照品和安慰剂样品测定功能性生物有效度的试验结果。在通过与Caco-2细胞单层温育作模拟吸收之前和之后测定激活巨噬细胞的活性。柱体代表三个重复试验孔的平均值±标准差。
图6显示5批紫松果菊参照品批次间的变异。数据代表三个重复测定孔的平均值±标准差。
发明详述现在将以本发明特定的代表性实施方案对本发明作详细地描述，应该理解的是，仅试图以这些实施方案作为说明性实施例，而本发明不受此限制。
对于在此特别公开的代表性实施方案，名词天然组合物被用于意指如在DSHEA中规定的被认为可用作食物疗法补品的组合物，用于为了全身健康，保持正常的结构和功能。天然组合物优选地是来源于植物，而更优选地是来源于草本植物，但是，也可以是非植物的来源，例如来自动物和其它非植物生物体的组合物，例如，藻类，真菌，细菌等。按其最终的加工形式，天然组合物包括其来源本身以及来源的选取部分。植物组合物和草本组合物可以包括例如茎，花，果实，根等。已被包装的完整的或被碾碎的植物叶，例如用于泡茶的就是天然组合物。天然组合物包括出自来源物的提取物，例如通过溶剂提取从来源物分离出的成分。溶剂可包括水、乙醇、甲醇、丙酮等。本领域的每一个普通技术人员都熟知用于制备提取物的其它溶剂的实例。天然组合物还可以包括来自已被修饰过的来源物的材料，可借助于其它加工过程，例如酶促的或化学的修饰或消化作用进行这种处理。天然组合物是包含一种植物、草本、动物或其它生命有机体的全部或一部分，并且可以是未经或经过以物理、酶促或化学方法加工处理的。天然组合物还包括已加入了其它物质的组合物。其它物质是例如被加入以保存或配制天然组合物的制备物，包括例如防腐剂，填充剂，粘合剂，润滑剂等。天然产品是由天然组合物组成，处于可立即使用或食用的形式。
与通常包含单一活性化合物的药物组合物不同，天然组合物由潜在活性物和相互作用成分的混合物组成。这样一种混合物可能只含有二种或三种已被鉴定是主要负责产生所需生物作用的成分，但是一般都含有许多种。此外，当作为来自天然存在的物质如在生命机体中发现的物质的提取物或提取物的混合物被制备时，天然组合物通常包含许多附加成分，它们可能以比较少量和不同量单独地存在，但是它们组合在一起可能构成整个天然组合物的相当部分。这些附加的次要成分可能在产生所需要的生物作用以及在防止不良副作用中，协同地贡献于主要要活性成分的效果。
虽然众所周知的是，可能被同时给药的其它物质可以引人注目地影响生物活性物质的生物有效度，而因此影响其效果，但是天然组合物不同于同时给药的药剂组合物，尤其是当天然组合物是以某种方式从天然存在的物质中被提取，并导致形成了既含有主要成分又含有次要成分混合物的组合物时。
如在此使用的生物功能度意指组合物引起生命有机体的状态或特征的整体改变的能力。对于天然来源的组合物，生物功能度意指当被作为药物或食物疗法补品食用时影响健康或舒适某些方面的能力。通常借助于临床试验确定天然组合物对健康和舒适的整个功效，试验中测定治疗健康相关的状态或疾病的声明用途的效果。对天然组合物所声明的效果可以包括，但不局限于，当处于高应激状态时增强免疫系统，并促进伤口愈合(紫松果菊)，保持前列腺健康(锯齿棕)，促进末梢和脑部血液循环而提高精神能力(银杏(Ginkgo biloba))，改善肝脏功能并防止肝脏损害(水飞蓟素(Silymarin))，以及循环刺激物和止吐剂(姜根(Ginger root))。通常没有按预期的方法做临床试验，因为费用太高。而且，对于天然组合物引起的一些效果如保持健康和舒适，以及防止疾病或不良状态，还不能借助于已有的临床试验进行测定。
组合物的生物活性意指在体外测定试验或对它进行测定的生化反应中，组合物影响一个细胞或一组细胞特定生物特征的能力。这种特征包括但不局限于，可见表型的改变，基因表达式样的改变(即特定mRNA及蛋白质或多肽水平的改变)，能够影响其它生理过程的分子分泌改变(例如细胞因子，白介素，组胺)，或者待测细胞对已知作用的化学剂敏感性的改变(即细胞对外部刺激的应答性)。为了达到所需的生物功能作用，对于特殊天然组合物的效果可以这样被评估，即通过测定那种特殊生物功能效果有关的某些特定的生物活性。
因为被摄取的天然组合物一般都包含潜在活性成分的混合物，并且因为取决于天然组合物每种成分的实际体内有效性(即生物有效度)，生物活性的范围可能有相当的改变，所以重要的是生物功能度的评估应包括一些可靠的预测试验，预测该天然组合物的什么生物活性将发生在体内。因此，本发明基于一旦此天然组合物经受了模拟的消化和/或吸收作用，在多种功能性试验中它如何表现，提供了一个用于可靠地预测天然组合物在体内效果的独特系统。以特定选择生物测定法的形式进行这些试验，在体外证明与体内生物功能效果密切相关的生物活性是由天然组合物引起的，并经常通过临床试验确定，随后进行力学研究。而且，为了提供可靠的结果，已证明这些检测法具有应答特异性和稳定的表现。
除了对给定的天然产品选择检测方法之外，还采用了几种样品制备方法，以便达到与人体内的活性最大可能的相互关联。这种样品制备法可能包括使用模拟的消化模型。模拟的消化可包括模拟的胃消化，模拟的肠消化，模拟的口腔消化，或者它们的组合形式。特别是为了评估天然组合物活性成分的生物有效度，本发明的检测方法可采用模拟天然组合物通过消化道各环节的样品制备法，从口腔延伸至结肠。
如在本文别处所指出的，通过消化道对于给定天然组合物的生物活性成分可能具有重要的作用。通过消化过程活性可能降低或被破坏。另一方面，那些过程可能引起来自天然组合物的无活性前体物的释放或激活。可以设计天然提取物的制剂，使之保护否则在胃中被消化破坏的一些成分。例如，制药领域所熟知的，可使用在胃的酸性环境中相对不溶解的，而在肠的中性环境中易于溶解的制剂。
因此模拟的消化意指一种方法，被设计模拟天然组合物通过消化道各个节段的情况。消化可以是胃消化，肠消化或二者结合。为了达到此目的，本发明一般采用模拟的胃液或模拟的肠液，或模拟的唾液。因此，使天然组合物的成分受到各种处理，包括通过降解失活，通过修饰激活和选择，从而某些成分可能被主动地吸收，而另一些成分被动地扩散或者完全不被吸收。
胃消化一般意指使将被测定的材料经受具有低于大约2.0pH液体的作用，此液体并含有在酸性pH有活性的消化酶如胃蛋白酶。胃消化作用还可以包括有助于液体与材料混合的搅动，这样可模拟发生在胃中的蠕动。优选的酸度范围是大约pH1.0-pH2.0，更优选的是大约pH1.2，本发明模拟的胃液可以含有胃酸，最优选的是胃蛋白酶。最优选的胃液是按照美国药典(USP)第23卷的方法所制备的，并含有胃蛋白酶。一般使天然组合物与这种胃液在约25～40℃相接触，优选地是在约37℃。胃消化持续一段可有效消化此天然组合物或提取物的时间。消化可以进行约2分钟-约10小时，较优选地是消化进行约30分钟-3小时。最优选地是消化持续2小时。
肠消化包括在混合物离开胃进入肠时中和被消化混合物的酸度。本发明模拟的肠液在大约pH6.0-pH8.0，优选地在大约pH6.5-pH7.5。这种液体还可以含有从胰或肠内壁分泌的消化酶。这种酶的实例有胰酶制剂、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶，弹性蛋白酶，脂酶和氨基肽酶。肠消化作用发生在中性pH，优选地还包括有助于液体和材料混合的搅动，以类似于在肠中发生的方式搅动。肠消化在大约pH6.5-pH8.0进行。较优选的肠消化是在pH7.2-pH7.6进行。最优选地，肠消化是在pH7.4进行。肠消化进行一段可有效地消化此天然组合物或提取物的时间。消化作用可以是大约2分钟-10小时。较优选地消化是约30分钟-3小时。最优选地消化是持续约2小时。
在本发明的另一个实施方案中，模拟的吸收包括跨越生物膜转运天然组合物的一种或几种成分。消化道的吸收作用发生在形成消化道内衬的上皮细胞层。例如，氨基酸和单糖通过主动转运被吸收跨过上皮膜进入毛细血管。上皮膜还允许借助于扩散作用通过某些物质，并且可以借助于类似的转运机制排除其它一些物质。消化道的吸收作用发生在其整个长度，包括肠道吸收，胃吸收，舌下吸收和口腔粘膜吸收。本发明可以采用一种模拟的吸收模型，它模拟从消化道环境转运天然组合物成分跨越位于消化道内壁的细胞，进入体液和组织。在本发明的一个代表性实施方案中，使用细胞单层模拟生理吸收。这种细胞单层被建立在一种可渗透性表面，以致使此单层的二个表面都可接触培养基，此细胞单层形成一个屏障，使此单层二侧的培养基被机械地隔开。此细胞单层实现转运功能，模拟消化道的吸收。因此，模拟的吸收包括从细胞单层的顶侧转运天然组合物的单个成分至细胞单层的基底侧。
在某些情况下，在此当本发明的一个实施方案包括使用与模拟的吸收相容的模拟消化作用时(例如，模拟消化的条件对用于模拟吸收的细胞单层或其它膜没有损害)，模拟的消化和模拟的吸收可以同时进行。在另一些情况下，当模拟消化的条件与模拟吸收的条件不相容，则需要按顺序步骤进行。同时进行的步骤意味着消化步骤和吸收步骤的进行中有某种程度的重叠。不需要一种成分的消化和吸收同时发生。
根据本发明为了模拟吸收作用可用于建立单层的代表性细胞包括Caco-2细胞。可使用的其它细胞包括，但不局限于HT29人结肠癌细胞和Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。当被覆盖在一种表面，使材料可能从顶侧流至基底侧，反之也一样，这种细胞可构成能用于模拟生理吸收作用和生物有效度的生物膜。所谓的生物膜意指一种结构，例如一种细胞单层，它形成一种物理性屏障，某些分子可以被转运跨越此屏障，取决于分子性质。细胞单层的替换物当然可能被用于模拟吸收。通常替换物含有能够主动转运的生物结构，替换物包括但不局限于从实验室动物获得的消化道器官，以及由种植在人工培养基中的细胞在体外产生的重新构成的器官或膜。模拟的消化作用包括模拟对不论是否被消化过程改变的天然组合物成分从消化道至体液和组织的生理吸收各环节的任何过程。对于一种制备物模拟吸收作用可能在很宽的时间范围内进行，并取决于制备物的性质，所测定的生物活性和生物成分跨越它而被吸收的膜。模拟的吸收可以持续约5分钟-48小时。较优选的实施方案包括持续15分钟-大约4小时的时间范围。在最优选的实施方案，模拟的吸收在大约2小时内完成。
按另一种方法，动物模型可被用于模拟对天然组合物的消化和吸收。给动物喂食天然组合物，然后通过试验确定生物有效度，例如测定血清或血液中存在或不存在某种成分或某种特定的生物活性。可通过监测生理或行为改变对动物查明这种生物活性。
为了测定天然组合物的活性，对于可用于本发明的体外测定方法的类型实际上没有任何限制。寻找这类测定法一般可从例如文献检索开始，寻找已证明对于被评价的天然产品有阳性临床作用的临床研究。然后还可检索描述与临床功效有关的生物机制的研究的文献。特别有用的研究是那些对于被成功地用于临床试验的天然产品的特定组合物弄明或暗示了作用机理的研究。然后再对每种作用机理仔细地评价天然产品功能度的范围。应用本领域已知的标准模型可确定功能度的适当范围。按下来可根据已确立的功能度范围，选择并评价天然产品的样品。可选择一种或几种体外生物测定法用于此天然组合物，可根据如下一个或几个标准选择这些生物测定法此生物测定法与在人所见到的临床作用的关系；重现性；费用-效果；和/或作为质量确证工具的效果。
用于确定天然组合物内是否存在某成分的其它方法包括，但不局限于，借助于物理，化学或免疫学测定法或试验的确定法。当此生物活性正是所需要的时，则情况可以是，在长时间显示出对某一活性成分的生物应答，或者在多次给予此制备物之后某一活性成分在生物系统内积累至有效的水平。在这种情况下，测定活性成分的替代方法特别有用。即使一种天然组合物的某一特殊成分已被鉴定，模拟消化和/或模拟吸收之后该成分的生物有效度也不需要借助于与此生物活性有关的测定法来确定。只要通过使此天然组合物经受模拟的消化作用和/或模拟的吸收作用，就可以使用任何一种简便的方法来确定它是否存在于制备物中。测定某一成分的存在可以同模拟的消化步骤和/或吸收步骤同时进行，或者在它们之后进行。同时测定意味着测定与消化或吸收步骤有某种程度的重叠，但是不需要同时发生。
在本发明的另一方面，提供了一种可用作食物疗法补品的天然产品，它包含从一批天然组合物获得的一种天然组合物，其中此批的代表性样品用一种方法评价其生物功能度。这种天然产品可区别于以往的天然产品，其中特别是当同以往的天然产品相比较，本发明的天然产品具有更强的生物功能或组成一致性。例如，通过收集本发明天然产品的许多分别包装的样品，将此收集品的生物功能一致性与许多以往的样品相比较，以致可进行统计学推论而确立了这种较大一致性的证据。
本发明可用于确定天然组合物的生物功能度，并且确保天然产品如食物疗法补品有一致的生物功能度。这包括例如，任何一种未加工或已加工的植物材料，以及各种标准化处理的提取物或提取物的组合物和整个草药的浓缩物，并且不局限于用作食物疗法补品的天然产品。由本发明方法提供的对质量和一致性的确证可同样用于原始的和被加工的天然组合物，例如那些用于生产食物疗法补品的原料组合物。因此，本发明包括具有基本上按批次一致性的天然产品，在此其一致性已通过上述任何一种方法进行了评估。
对于每种天然组合物，已确定了其独特的功能特征和为了任选地测定这些特征的测定法。在确认阶段，要以临床已证明的产品重复这些测定，以便确定可允许的生物功能度范围。一旦对于某一产品确定了其可允许的生物功能度范围，此测定法则可用于测定单独的各批次。这种测定的目标是确定每批都稳定地保持了所需的特征，如在起初的确认阶段所确定的特征。
本发明的分析方法运用于广泛多种的天然制备物。本发明的特征在于是根据生物机理选择用于测定生物活性的测定法，此生物机理很可能是该天然制备物生物功能度的原因。这通常可能意味着只选择二种或三种机理用于生物活性测定。
对于某些天然产品和组合物，所要求的是确保某种成分或生物活性的水平高于某一最小值。对于其它一些天然产品，可以要求确保某种成分或生物活性在某一范围之内。在一些情况下，法定的产品应在标准组合物或活性的大约50％以内。较优选地此产品应在标准组合物或活性的75％以内。最优选地，这些产品应在标准组合物或活性的90％以内。
对任何产品可用任何一种测定法测定和验证，取决于此产品被出售的用途。例如，可以按不同的方法或标准测定具有一种以上用途的草本产品，这取决于其预期的用途。类似地，理想的是通过相同的方法测定具有相同预期用途的不同产品。
本发明的另一个特征是，可以选择生物活性的范围，达到可已知产生所需生物功能度的范围，以致可能更简便地进行临床试验，花费更有效。在用于临床试验之前对材料作预筛选，使之可确立一个测定范围，在此范围可导致减少具有较高程度应答的分组数目。
在本发明的一个实施方案中，对含有紫松果菊或其提取物的天然组合物的生物功能度进行了评估。实验室研究已表明，紫松果菊的成分对鼠和人的单核细胞具有免疫刺激活性(Stimpel等，1984；Wagner等，1988；Luettig等，1988；Roesler等，1991；Burger等，1997；See等，1997)。紫松果菊-激活的巨噬细胞显示更强的增殖，细胞因子产量增加，吞噬细胞活性增强，并且杀灭肿瘤细胞及细菌和真菌病原体的能力增强(Stimpel等，1984；Coeugniet等，1987；Wagner等，1988；Leuttig等，1989)。当本发明的天然组合物含有紫松果菊或紫松果菊提取物，生物活性试验可包括测定制备物的免疫刺激活性。免疫刺激活性意指刺激免疫系统细胞活性的能力。这种细胞包括B细胞，T细胞和巨噬细胞等。一种类型的这类细胞可能被这种刺激激活，或者情况可以是，对一种类型细胞的刺激导致免疫细胞相互作用，从而又引起激活其它类型细胞。激活作用包括但不局限于，诱导细胞增殖，分泌细胞因子或其它信号传递分子，以及分泌携带氧的分子如氧化氮或过氧化物。在本发明的某些实施例中，免疫刺激活性包括对吞噬细胞如巨噬细胞提供刺激的能力。优选的巨噬细胞是RAW264.7，而对免疫刺激活性的优选测定标准是肿瘤坏死因子的产生。激活这类细胞还可以激活其它类型细胞。
根据本发明，对紫松果菊组合物活性或组成一致性的测定是通过首先使此天然组合物经受模拟的消化和/或模拟的吸收作用，随后对生成的制备物进行生物活性试验，测定它对淋巴细胞活性或细胞吞噬作用的影响。紫松果菊组合物的含量可有显著的改变，可借助于实施例1的方法对生物活性进行测定。例如，经受了模拟消化的紫松果菊的含量可以是大约10mg-5000mg。较优选的含量是100mg-2500mg，最优选的含量是大约750mg。在本发明此方面的一个实施方案中，是通过监测应答细胞因子的产生来测定紫松果菊组合物，提取物或制备物的免疫刺激活性。例如，通过测定TNF-α的产生来检测巨噬细胞的激活(Leutting等，1989)。用于刺激TNF-α产生的紫松果菊组合物的含量可以是大约0.1μg/ml-大约5μg/ml，较优选的是大约0.5μg/ml-2.5μg/ml，而最优选的是1μg/ml。其它的应答物质包括白介素-1，白介素-6，白介素-8，氧化氮，活性氧物质和花生四烯酸代谢产物。用于检测这些物质的商品试剂盒易于获得。对巨噬细胞可监测其细胞吞噬作用或对细菌的杀灭。此外，巨噬细胞激活和细胞因子产生促进形成其它的免疫细胞应答，如天然杀伤(NK)细胞活性和抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Delfino等，1991；See等，1997)。
按另一种方式，可通过检测细胞的增殖和活力来测定某组合物对免疫刺激活性的作用。巨噬细胞的激活和细胞因子的产生有助发展和激活其它类型的免疫细胞如NK细胞和淋巴细胞(See等，1997；Delfino等，1991)。紫松果菊-来源的多糖基本上不诱发离体淋巴细胞的增殖(Luettig等，1989)，但是，由于在体外(See等，1997)和体内(Coeugniet等，1987)刺激外周血液单核细胞(巨噬细胞，NK细胞，和淋巴细胞；PBMCs)，在体外确实发生了淋巴细胞增殖和NK细胞激活。在本发明的一个实施方案中，用已通过本发明的方法制备过的紫松果菊组合物处理PBMCs，并测定活细胞的数目。使用的紫松果菊制备物的最终浓度可以为大约0.1μg/ml-5μg/ml，较优选的是0.5μg/ml-大约2.5μg/ml，而最优选的是1μg/ml。为检测活细胞数目的优选并易于实施的方法包括监测代谢染料3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物(MTT)的转化。还可以应用熟知的其它代谢染料。测定活力的方法还包括，但不局限于，测定对标记核苷酸或氨基酸(例如3H-胸苷)的摄入以及借助于生发光法测定ATP水平(例如使用ViaLight试剂盒，LumiTech公司，Nottingham,U.K)。用于测定巨噬细胞刺激作用的方法不局限于检测TNF-α和测量细胞增殖。其它方法包括，但不局限于检测对前列腺素、其它细胞因子如IL-1β,IL-1α，氧化氮，以及氧基如超氧化物和过氧化物的合成。本领域熟知的是测定由培养细胞产生的细胞因子和生物活性。例如，测定细胞因子的ELISA试剂盒和细胞增殖检测试剂盒都易于获得。
在本发明的另一个实施方案中，测定了含有银杏或其提取物的天然组合物的生物功能度。最近的研究已描述了银杏提取物(GBE)对患有如下不同类型疾病病人的有益作用痴呆，情绪改变，与老化和衰老有关的识别功能障碍，以及注意力和记忆减退，精神错乱，抑郁和焦虑(Warot等，1991；Hofferberth,1989)。体内实验室研究也表明，给予银杏提取物的老化动物与对照小鼠相比较在海马内有较少的退化性结构改变(Barkats等，1994)。GBE通常含有四种不同的植物化学成分，包括黄酮苷，萜类化合物，荷花青素和有机酸。已表明类黄酮能清除自由基和起抗氧化剂作用。据认为自由基氧化反应与老化过程有关，并且推测是智力衰退的主要原因。在几种神经退化性障碍的致病原因中氧化紧张状态起作用。已显示银杏类黄酮可防止细胞脂质过氧化作用和细胞死亡(Joyeux等，1995；Robak等，1988)，防止由氧化紧张状态引发的神经细胞坏死和凋亡(Oyama等，1996；Ni等，1996)，并且可降低静止的和荷载钙离子的神经细胞中的氧化还原代谢作用(Oyama等，1994)。在本发明的一个实施方案中，是通过如下步骤测定银杏组合物的活性首先使此天然组合物经受模拟的消化和/或模拟的吸收，随后测定形成制备物的生物活性，以便确定它清除自由基的能力。根据实施例1的方法被消化的银杏含量可以在大约5mg-1000mg。更优选地此含量是25mg-500mg，最优选的此含量是大约180mg。在一个实施方案中，是通过监测自由基试剂的脱色来观测自由基的清除。很显然，本领域的每一个普通技术人员也可以使用许多其它的测定它们存在和失活的氧化剂和方法，来测定经模拟消化和/或吸收后的银杏组合物。通过将银杏组合物混和于含有自由基的溶液中可测定其清除自由基的能力。优选的自由基是可借助于例如吸光度检测的，通过溶液吸光度的改变来检测对它的清除。根据待淬灭的自由基，所需银杏的含量可以改变，银杏的浓度可以是大约1μg/ml-500μg/ml，较优选的是5μg/ml-200μg/ml，最优选的是10μg/ml-100μg/ml。
按本发明的另一方面，是以其抑制血小板激活因子(PAF)的能力来检测含有银杏或其提取物的天然组合物的生物功能度。银杏的萜类化合物组分含有银杏苦内酯，其中银杏苦内酯B是血小板激活因子(PAF)强有力的抑制剂(Nunez等，1986；Smith等，1996)。还已知PAF可激活参与炎症的细胞(Braquet等，1987)，调节细胞的免疫应答(Prescott等，1990)，改变血液流变学和血管通透性(Kinn等，1998)。对于神经学，PAF参与休克反应和局部缺血后的事件(Baker,1995),PAF还可减少大脑血流量(Kinn等，1998)，调节突触的活性(Bazan等，1995；Yue等，1994)，在脑发育中起重要的作用，并且与某些CNS障碍相关联(Hattori,1994；Smith等，1996)。在实验模型中已表明银杏苦内酯B可抑制PAF这些功能的绝大多数。在本发明的一个实施方案中，是通过在模拟的消化和/或吸收作用之后测定银杏组合物抑制血小板聚集作用来评估对血小板激活的抑制作用。本领域的每个技术人员都明了，还有许多其它的途径可评估与血小板相互作用有关的活性的抑制作用都可用于本发明。可以用一种聚集检测计测定血小板的激活及其抑制。制取富集血小板血浆的方法是本领域熟知的。提供一种包含血小板、诱发血小板激活的激动剂(血小板激活因子)和银杏组合物的混合物。激动剂可以是消旋的PAF。优选的激动剂是L-PAF。此激动剂的浓度可以是大约0.001μM-0.1μM，较优选地是0.003μM-0.05μM，而最优选的是大约0.006μM。对于被测定的银杏组合物可选择一个浓度范围。可以使用一个标准的Ginkgolide，与银杏组合物和制备物相比较对血小板激活的抑制作用。标准Ginkgolide的浓度可以在大约0.05μM-10μM，较优选的是0.25μM-2.5μM，最优选的是1.0μM。
还有在本发明的另一实施方案中，试验了银杏保护神经细胞免受与某些物质和生长条件有关的毒性的生物活性。基于对Alzheimer′s病发作和进行认识的最新进展以及据认为的银杏对年龄相关性识别力障碍的有益作用，我们建立了模拟神经退化过程各个步骤的检测法，并且这种检测法可以用于评估银杏组合物的生物活性。已知对神经细胞有毒性的物质和条件包括高浓度的兴奋性氨基酸(谷氨酸)和β-淀粉肽(Janssens等，1995；Behl等，1994)。血清饥饿也可促使培养的神经细胞凋亡。在本发明的一个实施方案中包括一种新颖的神经保护作用测定法，神经细胞被培养在已知的毒性条件下。在存在和不存在银杏时使神经细胞经受上述的条件或它们的组合形式。通过测定细胞的活力确定银杏组合物降低或防止毒性的能力。已证明银杏可防止的伤害包括如下多种(1)血清饥饿诱发的凋亡；(2)谷氨酸诱发的兴奋毒性；(3)模拟局部缺血的细胞毒性状态；(4)非聚合的β-淀粉肽的细胞毒性；(5)原纤维β-淀粉肽的细胞毒性；(6)高浓度谷氨酸存在时诱发的凋亡；(7)β-淀粉肽存在时诱发的凋亡；(8)模拟局部缺血后随之兴奋毒性损害状态的细胞毒性；(9)存在Fe离子时β-淀粉肽的细胞毒性；(10)高浓度谷氨酸存在时β-淀粉肽的细胞毒性；(11)存在β-淀粉肽和高浓度谷氨酸时诱发的凋亡。对神经细胞有毒性的其它条件和它们的组合形式对于本领域的普通技术人员是显而易见的，也可以被用于评估银杏组合物的生物活性。把本发明的一个神经保护作用试验中，提供了一种混合物，它包含神经细胞，一种细胞毒性物质，其含量足以降低此细胞的活力，以及银杏制备物。细胞毒性物质可以是谷氨酸，以大约1mM-50mM的浓度存在，较优选地是2.5mM-大约20mM，最优选的是10mM。细胞毒性物质还可以是β-淀粉肽，以大约0.05μM-10μM的浓度存在，较优选地是0.2μM-大约1.0μM，最优选地是0.5μM。试验提取物和组合物，确定它们抑制细胞毒性的程度。
本发明还可用于评估含有贯叶金丝桃或其提取物的组合物的生物功能度。已证明贯叶金丝桃对轻度至中度抑郁症有效(Chatterjee等，1998a；Laakmann等，1998)，并几乎没有副作用(Vorbach等，1997；Linde等，1996)。虽然其作用方式尚不知道，但体外生物测定法指示，对5-HT重摄入和多巴胺重摄入的抑制作用是主要的特异活性(Muller等，1997)。5-HT重摄入的抑制作用是许多合成抗-抑郁剂普遍确认的作用方式。
对于贯叶金丝桃，其它一些作用方式也是可能的。本发明的实施方案不限于测定5-HT重摄入的抑制作用，并可能包括例如，测定对单胺氧化酶的抑制作用(Bladt等，1994；Thiede等，1994)或对GABA结合于GABA受体的抑制作用(Baureithel等，1997；Cott,1997)。
在本发明的一个实施方案中，使含有贯叶金丝桃的组合物经受模拟的消化和/或模拟的吸收作用，并对形成的制备物测试5-HT重摄入的抑制活性。生物活性的试验可以包括提供一个含有贯叶金丝桃制备物，突触体制备物和选自多巴胺和5-HT的神经递质的混合物，并检测突触体制备物对神经递质的摄入。如在本文别处所述的，可通过例如在冰冷的0.32 M蔗糖液中匀浆化脑组织来制备突触体。在制备突触体的过程中，可近似地称量脑组织的重量，所加入蔗糖液的量可以是大约1倍体积-50倍体积，较优选地是大约5倍体积-15倍体积，而最优选地是大约9倍体积。用于测定培养中的突触体制备物的量可以是大约5μl-1ml，较优选地是20μl-250μl，而最优选的是50μl。神经递质可以是多巴胺或5-HT，在提取物中存在的浓度可以是大约2nM-500nM，较优选地是5nM-100nM，最优选地是大约50nM。可被用于通过实施例1的方法测定生物活性的贯叶金丝桃组合物的量可以有相当的改变。例如，经受模拟消化作用的贯叶金丝桃的量可以是大约10mg-5000mg。较优选的量是100mg-2500mg，最优选的量是大约900mg。测定摄入的简便方法可使用放射标记的神经递质。方便标记的神经递质的例子有14C-5-HT,3H-5-HT,3H-多巴胺。重摄入测定的时间可以是大约15秒-15分钟，较优选的是1-10分钟，最优选的是5分钟。
在此发现，在模拟消化之后贯叶金丝桃制备物仍保持5-HT重摄入的抑制活性，尽管与开始的材料相比处于较低的水平。活性的丧失看来发生在胃消化过程中，而不是在肠吸收过程中。这点突出了本发明的一个重要特征，就是能够模拟来自某一天然产品不同制剂的生物有效度。例如，能阻止天然食物疗法补品溶解直至它通过胃环境进入肠环境的制剂，将明显地改善酸性不稳定活性成分的生物有效度。因此，在本发明的另一实施方案中，可以借助于模拟的消化和吸收作用来测定天然产品制剂生物活性的丧失，并根据这种活性的保存进行选择。
在另一实施方案中，本发明可用于评估含有锯齿棕或其提取物的组合物的活性。锯齿棕作为食物疗法补品最通常由来自美洲锯齿棕(Serenoarepens)的果实提取物组成。在欧洲，锯齿棕是一种被广泛接受和广泛临床研究用于与良性前列腺增生(BPH)有关症状的药物。尽管BPH的确切病因学尚未被充分阐明，但是，雄性激素类固醇的代谢和作用，以及通过5α-还原酶将睾丸酮转化成二氢睾丸酮(5-羟色胺)似乎与BPH的发展有很强的关系(Strauch等，1994；Isaacs等，1983)。使BPH加剧的附加因子，是一些由渗透的白细胞以及局部生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)产生的炎症介体如前列腺素和白三烯(Robinnette,1988；Theyer等，1992)。
为了阐明对BPH病人报导的临床效果，对锯齿棕所描述的体外活性包括对5α-还原酶的抑制作用(Strauch等，1994；Delos等，1994)，对雄性激素结合于雄性激素受体的抑制和激活雄性激素-应答性报导基因(Sultan等，1984；Ravenna等，1996)，抗雌性激素活性(Di Silverio等，1992)，阻碍催乳激素和成纤维细胞生长因子的信号转导作用(Vacher等，1995；Paubert-Braquet等，1998)，以及抑制产生炎症前列腺素和白三烯的酶(环加氧酶和脂氧合酶)(Paubert-Braquet等，1997)。在去势动物的体内实验已显示锯齿棕可阻止雄性激素介导的前列腺生长，药物动力学标记实验显示锯齿棕的主要成分(例如亚油酸，油酸)分布于前列腺(Chevalier等，1997；Paubert-Braquet等，1996)。
但是，这些研究并没有获得关于锯齿棕在体内可能作用机理的任何结论性资料。例如，Proscar显著地降低循环5-羟色胺的水平和前列腺特异性抗原(PSA)的水平，PSA是雄性激素调节的基因产物(Strauch等，1994；Rhodes等，1993)。在某些研究中，使用锯齿棕的病人一致地显示血清中这些物质的水平没有统计学显著性降低(Casarosa等，1988；Braeckman,1994)。相反，新近的一些研究显示给予锯齿棕的提取物确实降低了BPH病人前列腺内的5-羟色胺，暗示对前列腺中5α-还原酶的抑制是锯齿棕的作用机理(Di Silverio等，1998)。
在本发明的实施方案中，对含有锯齿棕及其提取物的组合物测定了它们抑制5α-还原酶的能力。在特定的实施方案，是通过测定一个混合物中一种或几种5α-还原酶底物(例如睾丸酮和/或黄体酮)代谢的抑制来评估生物活性，此混合物包含来自大鼠肝脏微粒体的5α-还原酶，NADPH和此5α-还原酶底物以及锯齿棕组合物。锯齿棕组合物的浓度是大约5μg/ml-500μg/ml，较优选地是在10μg/ml-100μg/ml，最优选地是大约50μg/ml。当以等体积制备微粒体时，如在实施例5中所给出的，存在于此测定试验中的微粒体的量可以是大约2μl/200μl，较优选地是5μl-50μl，最优选地是20μl。存在的5α-还原酶底物是大约5μg/ml-500μg/ml，较优选地是20μg/ml-200μg/ml。最优选地，睾丸酮的浓度是25μg/ml，黄体酮的浓度是20μg/ml。通过加入NADPH开始反应，所加入NADPH的最终浓度是大约20μg/ml-2mg/ml，较优选的是50μg/ml-1mg/ml，最优选的是490μg/ml。在大约30℃-40℃之下温育，较优选的是35℃-39℃，最优选的是在大约37℃，温育持续时间是大约5分钟-2小时，较优选地是30分钟-90分钟，最优选地是大约1小时。
如在此所论述的，可能的作用模式是通过SPE抑制雄性激素受体转变成DNA结合形式。已发现SPE抑制芳烃受体转变成DNA结合形式。根据目前SPE抑制芳烃受体转变的发现以及此文献批判性的评述，在此可认为，SPE是非竞争性的，非特异性的HSP90-结合激素受体转变的抑制剂。使用名词“非特异性的”是指SPE具有抑制芳烃受体、雄性激素受体，以及可能还有可以经受类似转变的其它受体蛋白转变成DNA结合形式的能力。尽管芳烃受体不是雄性激素或雌性激素受体家族的一部分，也不直接包含在激素信号转导作用中，但是所有的这些受体都使用类似的机制来保持未配位的能力并且用于激活成配位的DNA-结合形式，以及都具有它们与之结合的相应的确定DNA应答元件。已显示出SPE的抗雌性激素的作用，它可防止出现核雌性激素受体(Di Silverio等，9192；Bombardelli和Morazzoni，1997)。发现对于所测定的SPE IC50是20μg/ml。这与发现的SPE对酶抑制活性在相同的范围。
在这样一种测定试验中，在细胞溶质或核提取物中将雄性激素应答元件DNA稀释，结合于HSP90的未配位雄性激素受体来源于这种提取物，稀释至大约0.01nM-1000nM的浓度，较优选的是0.1nM-10nM，最优选的是大约1.0nM。取决于所采用的检测方法，可以将雄性激素应答元件生物素化。如上所述制备微粒体。在一次测定试验中所使用的量可以在大约30μl-3000μl之间，较优选地在100μl-1000μl，最优选地是大约500μl。存在的睾丸酮在大约0.5μg/ml-200μg/ml，较优选地在1μg/ml-100μg/ml，最优选地是大约50μg/ml。然后将锯齿棕材料和NADPH加入到此混合物中。每种的浓度可以是大约1.0μg/ml-1000μg/ml，较优选地是10.0μg/ml-200μg/ml，最优选地是大约100μg/ml。可采用对检测基于芳烃受体和应答元件类似的条件。用于检测复合物如雄性激素应答元件DNA和雄性激素受体之间复合物形成的方法是本领域熟知的。例如，这些方法可以是基于免疫学的，依赖于一种元素对固相载体结合的方法。
因此，本发明试验锯齿棕组合物或提取物的实施方案包括提供一种混合液和检测雄性激素受体-雄性应答元件复合物的形成，此混合液包含锯齿棕制备物，5α-还原酶，辅因子NADPH，睾丸酮，与HSP90复合的未配位雄性激素受体，以及雄性激素应答元件DNA。按另一种方式，此试验可包括提供一种混合液和检测芳烃受体-芳烃应答元件DNA复合物的形成，此混合液包含锯齿棕制备物，与HSP90复合的未配位芳烃受体，以及芳烃应答元件DNA。
本发明的另一方面，提供了一种新型的测试方法，能够监测雄性激素受体转变的SPE对抗-雄性激素的抑制作用。这种测试法提供了同时测定由于5α-还原酶抑制5-羟色胺形成对抗-雄性激素活性的贡献。
本新型测试法特别有用的方面在于它提供了对锯齿棕提取物和商品以及通过本发明的模拟消化作用和吸收作用制备的含锯齿棕的组合物生物活性的一种测量。
经常伴随BPH存在的是激素诱发的慢性炎症，这种炎症是由于炎症巨噬细胞和嗜中性细胞浸润进入前列腺而引起(Theyer等，1992)。已知前列腺素如前列腺素E2(PGE2)和白三烯(白三烯B4,LTB4)的产生是由这些细胞产生的炎症介体(Robinette,1988；Theyer等，1992)。以前的研究已报导，锯齿棕提取物在体外抑制环加氧酶(COX)，并且报导，集中在前列腺的锯齿棕提取物成分也抑制这类酶(Pubert-Braquet等，1997；Chaudry等，1994)。此外，一个研究已表明，尿中PGE2浓度降低与尿流改善相关联(Rolland等，1981)。因此，本发明的实施方案包括评估锯齿棕组合物或提取物抗-炎症活性的实施方案。以前涉及炎症免疫细胞浸润的研究暗示，炎症介体(例如环加氧酶和巨噬细胞衍生细胞因子)的分泌在锯齿棕使之改善的疾病中起主要作用。并且，有药物动力学资料表明了锯齿棕在体内靶部位的生物有效度，也支持锯齿棕的抗-炎症作用机理(Chaudry等，1994；Plosker等，1996)。如上面所论述的，可以用多种途径测定巨噬细胞的激活。在优选的实施方案中，是通过测定前列腺素E2(PGF2)产生的抑制来评估锯齿棕组合物或提取物的生物活性水平。
在本发明的一个实施方案，对人参组合物或提取物的生物活性和组成一致性进行了评价。人参在传统的中药中已被使用了约2000年，用于增强耐力和改善对疲劳和应急状态的应答。虽然对其作用机理仍然不清楚，但是已观察了其作用，涉及中枢神经系统(记忆力，学习和行为，D′Angelo等，1986)，神经内分泌功能(Hiai等，1979)，免疫功能(Scaglione等，1996)，抗氧化作用(Kim等，1996)，碳水化合物和脂质代谢(Wink等，1993)，以及心血管系统(Rimar等，1996；Fukuda等，1995)。
认为人参作用于下丘脑，引起释放促肾上腺皮质素，它又作用于垂体而释放ACTH,ACTH作用于肾上腺而释放皮质类固醇。皮质类固醇(Corticotrosteroids)和促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放作用于脑和身体，引起对应激状态的适应(Fulder,1980；Fulder,1981)。人参还通过结合和激活糖皮质激素受体，盐皮质激素受体和黄体酮受体而表现出潜在的协同作用(Pearce等，1982；Lee等，1997)。
与人参有关的活性被认为是由于人参皂甙，已显示它可结合和激活糖皮质激素受体，以及结合于盐皮质激素和黄体酮受体。最普遍研究的糖皮质激素的活性包括调节氧化氮合酮同工酶，特别是抑制可诱导性氧化氮合酶(iNOS)(Di Rosa等，1990；Park等，1996)。在应激/炎症状态下糖皮质激素受体介导的iNOS表达的抑制，对血流，维持心肌收缩力和有益的免疫活性都具有促进作用，并可使T和B淋巴细胞扩充，上调免疫细胞上的细胞因子受体(Radomski等，1990；Hawrylowicz等，1994)。
本发明的实施方案能够评价人参提取物和组合物刺激皮质类固醇的诱导和抑制氧化氮产生的生物活性。在优选的实施方案中，将人参提取物对动物给药并测定血浆中皮质酮的水平。在另一个实施方案中，对用IFN-γ激活的培育巨噬细胞，试验人参提取物抑制氧化氮产生的能力。
以下实施例详细描述本发明，显示某些特殊代表性实施方案如何进行，其材料，仪器设备和方法步骤，它们应被理解为仅仅是说明性的。特别是不打算将本发明限制于在此特别列举的方法，材料，条件，过程参数和仪器设备等。
本申请全文中引用了各种出版物，专利和专利申请。这些出版物，专利和专利申请的教导和公开内容特被全部引入此申请作为参考，以便更充分地描述与本发明有关领域的状况。
可以理解和预料，本领域的技术人员可能对在此公开的发明原理作一些改变，因此这些修改形式将包括在本发明的范围之内。本发明的实施例在这种温育之后，通过加入0.5ml 2.2N的NaOH溶液将所形成的混合物调节至大约pH7.4，然后加入等体积(15.5ml)含有2倍稀释胰酶的2倍浓缩的模拟肠液。在37℃以250RPM振摇培养瓶2小时。这样形成的溶液类似于含有胰酶的生理肠液，通过口腔食用的待测材料被暴露于其中。然后将此混合物快速冷冻，贮存于-80℃待进一步试验。模拟的吸收和生物有效度的评估除了通过上述过程可能被模拟的消化环境的作用之外，组合物的功能度还取决于它退出消化道进入循环达到作用部位的能力。应用结肠癌细胞系Caco-2已证明是在体外评定吸收作用和生物有效度的良好方法，此细胞系当以高密度涂敷时可分化形成肠上皮样的单层(S.Yee,1997)。在平板上的一层分化的Caco-2细胞可允许材料从顶侧流到基底侧，相反也一样，可用于测试对待测材料的吸收和生物有效度。已很好地描述了这种模式系统的特征并表明与对动物和人进行的体内生物有效度研究一致(Yee,1997；Taylor等，1997)。
将购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockviie,MD)的Caco-2细胞保存在装有Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基(DMEM,Gilbco,Grand Island,NY)的T-75培养瓶内，此培养基含有10％胎牛血清(Gemini Bio-Products,Calabasas,CA)和100单位/ml的青霉素-链霉素溶液(Sigma,St.Louis,MO)。为了进行生物有效度评估，将细胞涂敷在Transwell滤膜(Corning-Costar,Cambridge,MA)上，一旦汇合后，再保持大约21天待其分化形成肠上皮样单层。
Caco-2细胞的方便替代品是BIOCOAT肠环境系统(BectonDickenson,Franklin Lakes,NJ)。此试剂盒可在大约3天内提供一个汇合的细胞层。
待测材料可被溶解在DMSO或50％乙醇中，或者可能包含等分量来自模拟消化方案(见上面)的样品。将来自消化方案的样品稀释，或者在50℃温育以便加热灭活胰酶。此步骤被用于除去胰酶，此酶可能毒害细胞，并因此可能破坏Caco-22单层的完整性。然后将待测样品加至细胞的顶侧，再在37℃温育。温育的温度可以较低。BIOCOAT系统可使检测在室温下进行，并且温育时间可以从大约10分钟-2小时或更长些。在以待测材料给药之后的30,60和90分钟，从顶侧和基底侧室采集等分量样品用于生物功能度测定。当使用能够生长在与培养Caco-2单层同样的培养基中的细胞系进行生物功能测定时，则可使用在此单层的基底侧含有靶待测细胞系的细胞培养孔进行此程序。一旦吸收作用完成，可除去此转移孔和支持的Caco-2细胞单层。对模拟消化方案的确认为了确认上面描述的模拟消化程序，实施了二种类型的分析试验。第一种分析试验确定了模拟消化程序的一致性。表1显示对于在不同的三天进行的实验，对不同的植物材料模拟消化完成后的pH。在第二种分析试验(表2)，使用来自对相同批量的起始材料至少三种不同消化作用的材料用于评估二种不同植物材料的生物活性。应用紫松果菊巨噬细胞激活试验(实施例2)或银杏自由基清除试验(实施例3)评估活性。列举在表1和表2中的数据显示了相对标准差(CV)，指示变异性，表明模拟消化作用和生物功能活性CV小于10％。
实施例2对紫松果菊制备物生物活性的体外测定法基于它们刺激巨噬细胞产生TNF-α以及刺激PBMCs的细胞增殖的能力，以体外试验评价了应用上述模拟消化和吸收模型制备的紫松果菊提取物和组合物。巨噬细胞产生TNF-α的测定法以1×106个细胞/ml的密度将RAW 264.7巨噬细胞置于24-或96-孔的培养板中，温育24小时。虽然发现该巨噬细胞系在置于培养板时会产生少量TNF-α，但在24小时的温育过程中培养基中的TNF-α含量会减少。将不同浓度的紫松果菊组合物加到RAW264.7细胞中，测定TNF-α的浓度。紫松果菊组合物是溶解的标准品，产品和通过模拟消化或模拟消化和模拟吸收制备的制备物。使用小鼠TNF-αELISA试剂盒(Endogen,Woburn,MA)通过ELISA测定TNF-α的水平，并通过与重组TNF-α标准品比较进行定量。产量比较模拟消化作用的一个主要优点是对天然组合物模拟消化作用。第二个优点是保存有关成分的生物活性。通过以普通的溶剂(二甲基亚砜或50％乙醇)萃取过夜和通过模拟消化作用对含有粉末状紫松果菊产品的胶囊内容物进行了制备。

图1显示由安慰剂和紫松果菊粉末产品的不同制备物诱发的巨噬细胞产生TNF-α的比较。通过模拟消化作用制备的紫松果菊产品保持了显著大量的TNF-α刺激活性，而通过二种普通提取方法制备的产品证明没有高于安慰剂的活性。并且如图2中显示的，巨噬细胞激活能力是剂量依赖性的，表明作用的特异性。紫松果菊原料和产品的比较在模拟消化之后测定多种紫松果菊原料和产品的巨噬细胞激活活性。如在图3中所显示，当同一个标准材料和安慰剂对照相比较，7批原料中只有2批证明能够显著地诱导巨噬细胞产生TNF-α。对可获得的紫松果菊产品样品的比较显示在图4中。在11个被测试的产品中，只有3个与标准材料比较证明能够激活巨噬细胞。生物有效度将已经受模拟消化的标准产品和安慰剂施加于Caco-2细胞单层的顶侧。2小时之后，从此单层的顶侧和基底侧取出样品，稀释10倍，测定TNF-α的功能活性。图5显示对标准产品和安慰剂样品在模拟吸收之前和模拟吸收之后测定的活性。柱体代表三个重复测定孔的平均值±标准差。
为了评估Caco-2单层的渗透性，测定了t=0时在顶侧基质中和t=2小时时在基底侧基质中TNF-α的含量。通过从对标准产品得到的数值扣除安慰剂的数值，除去了由Caco-2细胞产生细胞因子的任何作用。已将38,945单位TNF加到此单层的顶端侧。温育2小时之后，在基底侧测定到30,720单位TNF。然后通过Yee(1997)的如下计算评定近似的渗透度(Papp)∶Papp=(F*VD)/(SA*MD)，在此F=活性单位/每秒(4.27),VD=顶侧体积(0.5ml),SA=膜表面积(1.13cm2)，以及MD=顶侧体积中的总单位数。根据另一些研究，此计算值，Papp=48×10-6，相当于对此材料预测吸收的大约70％或更高些(Yee,1997)。对产品的确认通过模拟的消化作用测定5批紫松果菊产品批与批间的一致性。图6中描述的4批在可比较的范围内诱导巨噬细胞中产生TNF-α。第5批诱导显著较少的活性。为了试验确证，将这些比较试验法与其它研究相结合，以便确立一个可确认的批次产品必须适合的生物功能度要求范围。用如此确证的试验法测定批次样品，以便保证质量。只有适合于生物功能度适当范围的产品才被确认。对细胞增殖的诱导作用以通过模拟的胃和肠消化作用制备的紫松果菊样品处理外周血单核细胞(PBMCs,Clonetics,San Diego CA)。融化一小瓶细胞(约5×107个细胞)，并悬浮于预热至37℃的淋巴细胞生长培养基(LGM-3，Clonetics)中。将100μl细胞悬液分配到96孔微量组织培养板的每个孔中。将待测样品，消化的安慰剂胶囊，紫松果菊标准材料和伴刀豆球蛋白A(Con A，阳性对照)在LGM-3培养基中制备成10倍浓度，并对孔内加入各自的待测材料10μl。将细胞温育大约72小时，应用细胞滴定TM增殖测定试剂盒(Promega,Madison,WI)通过代谢染料MTT的转化评估细胞的增殖/活力。将提供的1ml MTT染料液加到5ml LGM-3液中，对每孔加入50μl MTT/LGM-3培养基。在37℃温育2小时后，加入100μl终止/增溶液，用BioTEK ELISA培养板测定仪在570nm测定光密度。表3显示紫松果菊浓度与细胞增殖之间的剂量反应关系。表4显示阳性对照化合物Con A与细胞增殖之间的剂量反应关系。紫松果菊或Con A每个浓度的数值代表8个孔的平均值。用单尾Student′S T-测验(one-tailed Student′s T-test)对安慰剂胶囊反应计算统计学显著性(P)。细胞增殖顶点在大约1μg/ml消化的紫松果菊浓度。Con A也产生了剂量依赖性反应，在1μg/ml也产生了高水平的刺激作用，因此被选择作为以后实验的剂量。
表5显示使用来自同一供者的细胞作PBMC增殖测定，试验间的变异度和紫松果菊标准品批次间的重复性。表6证明来自三名不同供者的PBMCs都有显著的增殖反应。对于每组试验，使用1μg/ml经消化的紫松果菊或Con A在3天或更多的时间测定重复的8个孔。所有批次的紫松果菊和Con A与安慰剂相比较都有统计学差异(P＜0.01)。
实施例3对银杏制备物生物活性的体外测定法为银杏建立的试验法测定了这种草药产品的直接抗氧化剂活性，抑制血小板激活因子结合于其受体的能力，以及在线粒体伤害或暴露于β-淀粉样蛋白肽之后银杏阻止神经细胞死亡的能力。检测自由基清除活性的体外测定法将167mg二苯苦基偕腙肼(DPPH,Sigma,St.Louis,MO)溶解于500ml乙醇中，按等分量贮存于-80℃。通过将20ml 1M Tris-HCl(pH7.4)混合进入880ml of 50％乙醇/水溶液，制备测定缓冲液(BS)。试验在96孔微量滴定板中进行，首先将待测定样品在BS缓冲液中稀释至最高测试浓度，随后在BS内将此样品作2倍系列稀释。然后对每个孔加入100μlDPPH溶液，将此滴定板在室温下温育30分钟。在540nm测定光密度。
表7显示不同浓度银杏组合物清除自由基的平均百分率。该组合物包括标准化的未消化处理的银杏提取物，经受了模拟消化作用的相同标准化的提取物，以及也经受了模拟消化作用的三个不同的银杏产品。结果表明，银杏的自由基清除活性受消化作用的影响。此外，根据计算的EC。值，显然，三个掺入了银杏的“等效”标准化提取物(24％类黄酮，6％萜类化合物)的不同商标的银杏产品具有显著不同的抗氧化剂效力。
对血小板激活因子抑制的体外测定法从禁食的家兔耳动脉采血，此家兔至少二周内未用过药物和免疫接种。用蝶形阀导管(21号×3/4英寸针头，3英寸导管)作静脉穿刺。抽1ml血弃去，然后抽30ml全血直接进入含有3ml 3.2％柠檬酸钠的注射器中。翻转注射器几次轻轻地使血液混匀。显示出溶血或血纤维蛋白形成征兆的血液样品弃去。当举起对着光线轻轻摇动确定没有出现“涡流”，显示出血小板激活迹象(形态改变)的富含血小板的血浆(PRP)也被弃去。PRP的制备将30ml抗凝血转移至二支15ml的无菌塑料离心管内，通过在室温，以650×g在30分钟内连续离心3次分离出PRP，每次离心间隔2-3分钟。将每次离心后得到的PRP转移至15ml的无菌塑料管中，加盖在室温下放置30分钟，然后分析血小板功能。评估PRP是否激活(见上面)，如果被激活了则弃去。含血小板少的血浆(PPP)通过在室温下2000×g 10分钟离心剩余的细胞沉淀组分获得。将PPP转移至另一支无菌塑料管内。
从PRP中取出10μl等分量作血小板计数。先在20ml等渗的细胞计数液内稀释此等分量PRP，然后计数。用自体的含血小板少的血浆(PPP)调节PRP中血小板的数目至3000,000/μl。血小板聚集的测定用Chrono-Log血小板聚集计，在37℃并以850 rpm的速度搅拌下进行血小板聚集光学测定。每次测定时，取450μl PRP加到带有Teflon搅拌棒的聚集小杯中，将小杯放入聚集计的测定室中。将含有450μl自体PPP，搅拌棒和50μl 0.15M NaCl(预热至37℃)的小杯放入聚集计参照室的位置。应用基线设定模式确定基线。在图表上记录距相对于PRP的PPP基线的最大笔偏转度(距离mm)。在37℃搅拌下将PRP预热1分钟，随后用Hamilton微量注射器加入溶于DMSO的5μl抑制剂或提取物，或者加入其它的赋形剂，使之与血小板反应1分钟，然后加入5μl血小板激动剂。在加入激动剂或对照物之后，记录聚集反应曲线3分钟。优选的激动剂是L-α-磷脂酰胆碱，β-乙酰-γ-O-十六烷基(L-PAF,Sigma)，发现它比DL-α-磷脂酰胆碱，β-乙酰-γ-O-十六烷基(外消旋PAF)具有显著较高的活性。按如下测定血小板的聚集作用加入饱和水平PAF后PRP液的光透射代表100％血小板聚集作用。加入赋形剂(例如DMSO)后对照PPP液的光透射代表0％血小板聚集作用。对于其它溶液成分的作用，通过对相似处理的PPP溶液进行平行光透射测定来矫正光透射值。为了确定此测试法的线性范围，进行了含有不同浓度L-PAF的测定反应。为了测定银杏提取物的抑制作用，选择了处于本试验线性范围内的L-PAF浓度。按照如下等式确定血小板的聚集作用血小板聚集作用的百分数=100×To/Tmax，在此To是一个测定反应中光透射的增加值，Tmax是不含银杏提取物的对照反应的光透射增加值。
发现在L-PAF低剂量(＜0.1μM)下，L-PAF的浓度与血小板聚集作用之间存在线性关系。高于0.1μM的浓度诱发了最大的血小板聚集作用。表8显示，对于L-PAF，使用不同的血小板制备物获得的线性剂量-反应和EC50值是高度可重复的。
为了确认此测试方法，以银杏苦内酯B和未消化处理的银杏对照材料获得了测定结果。表9显示银杏苦内酯B对L-PAF诱发的血小板聚集抑制作用的剂量-反应分析。在代表血小板激活作用不同水平(最大反应的百分数)的4个不同的PAF浓度制作了剂量-反应曲线。如对PAF-诱发聚集作用的竞争性抑制剂所预料的，对于银杏苦内酯B，其IC50是取决于血小板激活的程度。对于直线回归系数所获得的数据表明，在0.02μM和高于此浓度的PAF，存在血小板聚集抑制作用的线性反应(基于相关系数r)。因此，将此PAF浓度(0.02μM)用于进一步试验，以便获得具有线性反应的最高灵敏度。
表10显示对于银杏苦内酯B IC50测定的可重复性，是对所选择的0.02μM L-PAF浓度在不同的三天测定的。对于不同天内测定的IC50，r值接近于完全拟合(r=1)。这证明，对于同样的血小板制备物，可以高精确度地确定抑制剂的活性。
虽然当使用不同的血小板制备物时相同的PAF浓度不一定导致相同水平的血小板聚集作用，但是，当以银杏标准品活性为参照物进行测定时，改善了获得的精确度和可靠性。以所选择的PAF浓度，对三个无关的血小板制备物测定了银杏参照材料和银杏苦内酯B标准品的IC50值。在所测定的范围内发现银杏浓度与血小板聚集抑制之间有线性关系(r＞0.99，资料未列出)。而且，银杏相对于银杏苦内酯B的活性(银杏苦内酯B IC50/银杏IC50)在所选择的PAF浓度与血小板制备物无关。因此，可以将相对活性(银杏待测材料的IC50/银杏标准品的IC50)用于比较银杏制备物对血小板聚集作用的功能性抑制活性。表12显示在同一批次的不同制备物之间以及不同批次的参照材料之间可达到的重复性。产品的确认为了产品确认所需的最小活性取决于被用于测定活性的测试法的准确性和精确度，来自相同参照材料不同制备物的数据可重复性，以及不同批次参照材料之间的变异性。在对于相同参照材料测定相对活性中本测试法显示的标准差较低(2.7％，表11)。如在表12中显示的，在相同批次内由样品制备物引起的变异性以及批次间的变异性也较低。这些考虑使之有可能选择一个必定满足于某一产品达到确认的活性水平。一旦被确定，此测试法可用于测定已通过模拟消化和/或吸收作用制备的银杏组合物和提取物。
神经保护作用的体外测定法使神经元前体细胞(人或非人类的)经受模拟体内神经变性过程的条件。使这些条件最佳化，以便证明参照品银杏材料的保护作用。在存在和不存在参照品草药材料时将被处理细胞的代谢活性与未被处理细胞的代谢活性相比较。
β-淀粉样肽(25-35)是从Bachem Bioscience公司购得。将此肽溶解于DMSO，成1mM的最终浓度，在N2气中分装成等分量，保存在-30℃。每次实验使用一个新鲜的等分量，并在刚要使用之前用培养基稀释成所需的浓度。谷氨酸购自Sigma(St.Louis,MO)。在18MΩ的纯水中制成10mM的贮备液，并过滤除菌。以等分量保存在-30℃，在使用之前用培养基稀释。
从ATCC(Rockville,MD)获得了PC-12前体神经细胞系(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)，培养在含有10％胎牛血清(FBS)和5％热灭活马血清，并存在1％青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基内。热灭活的马血清是购自Sigma(St.Louis,MO)。其它组织培养试剂购自Gibco。使细胞在胶原包被的组织培养物表面生长。按照制造商的说明制备原纤维形式的胶原(细胞原始胶原，Cohesion Technologies公司，Palo Alto,CA)，并用于包被组织培养瓶和96孔培养板，形成一个薄层。通过研磨将细胞从培养板上取下。用吹吸将细胞团块打碎，通过细胞滤器过滤此细胞悬液，以便获得均匀的细胞数量，在实验之前24小时以104/孔的细胞密度种植细胞。用参照品银杏材料预处理细胞，此材料以10mg/ml的浓度溶解于DMSO中，在刚要使用之前以培养基稀释成所需的浓度。
表13显示谷氨酸，β-淀粉样肽和二者的组合对PC12细胞的细胞毒性。活度(残活细胞的百分数)最显著的下降发生在48-72小时。到96小时，由于剩下的活细胞繁殖复制，使细胞数目开始增加。
表14显示被加入到培养基中的参照品银杏材料的剂量-反应关系，以及导致的谷氨酸，β-淀粉样肽和此二者组合物的细胞毒性降低。在处理后48小时(表14)和处理后72小时(表15)测定细胞活度。在所有的情况下，加入参照品材料都引起了活度增加。
还研究了参照品银品材料保护受β-淀粉样肽刺激的血清饥饿细胞的能力。表16显示以β-淀粉样肽二个浓度培养的细胞由血清饥饿引起的活度进一步降低。参照品银杏材料的保护作用可延伸到血清饥饿的细胞。此测试法被用于由模拟消化和/或吸收作用形成的银杏制备物，测定其神经保护效果。
实施例4贯叶金丝桃制备物生物活性的体外测定法应用上述模拟的消化方式制备贯叶金丝桃(Hypericum perforatum)的提取物和组合物。为了减少活性成分的降解，胃消化和肠消化作用各处理1小时。体外实验评价所形成的制备物抑制3H-多巴胺和3H-5-HT(5-羟色胺)在大鼠皮层突触体内重摄取的能力。这种例证性测试法通常与抗-抑郁剂作用模式有关，并且与贯叶金丝桃制剂可能的作用机制有关。突触体制备按照Gray和Whittaker(1962)的方法从纹状体制备大鼠脑突触体用于3H-多巴胺摄取测定，或者从去掉小脑的全脑制备用于3H-5-HT摄取测定。简单地说，将雄性Sprague-Dawley大鼠断头处死，迅速取出大脑。将纹状体或去掉小脑的全脑称重，用Potter-Elvejhem匀浆器在9倍体积冰冷的0.32M蔗糖液中做成匀浆。将此匀浆在0-4℃以1000g离心10分钟。倾倒出上清液用于摄取实验。3H-多巴胺和3H-5-HT的摄取按Bonnet等(1986)所述的方法测定摄取。在1-2.5ml温育培养基中37℃温育50μl等分量粗制突触体制备物，温育培养基的组成如下109mM NaCl,3.55mM KCl,2.4mM CaCl2,0.61mM MgSO4,1.1mM KH2PO4,25mM NaHCO3,5.4mM葡萄糖，0.025mM丙酰苄胺异烟肼，pH7.4，并含有20nM3H-多巴胺或20nM3H-5-HT(使用前30分钟以95％O2,5％CO2对此培养基通气)。采用5分钟的温育时间。通过以1.5ml冰冷的培养基稀释而终止摄取，随之立即通过Whatman GF/B玻璃纤维滤器真空减压过滤。用3ml冰冷的培养基洗此滤器2次，在室温干燥过夜。在对此滤器连续加入0.5ml蒸馏水持续30分钟，3ml 1,2-乙二醇和5ml Ready Safe(Beckman)闪烁液鸡尾酒之后，用LS 6500 TA闪烁计数器(Beckman)测定3H-放射活性。3H-多巴胺和3H-5-HT的比摄取被定义为在37℃的总摄取与在4℃摄取之差。用GBR 12783和丙咪嗪分别作为3H-多巴胺和3H-5-HT摄取试验的参照化合物。将在DMSO中制备的贮备液(10mg/ml)以17000g离心10分钟，其上清液用于试验。样品在琥珀色瓶内4℃最多贮存约5天。在温育培养基内作了进一步稀释。
表17显示参照品贯叶金丝桃组合物以及已经受单纯胃消化或经受胃和肠消化作用的组合物，对5-HT重摄取的抑制作用。数据表示每个样品4份重复读数的放射活性计数平均值，以及对比所匹配的对照显著性活性的Student′s T-检验统计学分析(P)。证明所有的贯叶金丝桃样品具有显著的5-HT重摄取抑制作用。但是，与溶解于DMSO中的参照贯叶金丝桃产品相比较，已经受模拟胃消化作用的贯叶金丝桃产品，其抑制作用显著地降低了。模拟的肠消化作用并不进一步显著地降低抑制活性。
表18显示被消化处理的贯叶金丝桃参照品与5-HT重摄取降低的剂量-反应关系。数据表示每个样品4份重复读数的放射活性计数平均值，以及对所匹配的对照显著性活性的Student′s T-检验统计学分析(P)。也可进行对多巴胺重摄取抑制作用的类似试验。
实施例5对锯齿棕制备物生物活性的体外测定法5α-还原酶或环加氧酶抑制测定法可用于测定用上述模拟消化和吸收方式制备的锯齿棕组合物以及其它锯齿棕提取物和商品的活性。制备大鼠肝微粒体和5α-还原酶用CO2气麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(Hilltop动物实验室，Scottdale,PA)。除去包裹肝脏的结缔组织，用HEDG灌注缓冲液(HepespH7.2,1.5mM EDTA,1.0mM DTT和10％甘油)灌流肝脏2次。然后取出肝脏，在HEDG缓冲液中作肝匀浆(每克肝脏湿重5ml缓冲液)。将此匀浆在4℃以9000×g离心20分钟。然后将形成的上清液在4℃以100000×g离心1小时。将获得的微粒体沉淀再悬浮于HEDG中并使之均匀(以100rpm的速度敲击3次)，等量分装，快速冷冻并贮存于-80℃。通过检测雄性激素代谢的5α-还原酶活性抑制测定法对于待测的每个锯齿棕样品，在20mM pH7.2的磷酸钾缓冲液中将此材料稀释至所需的浓度(50μg/ml锯齿棕提取物)。相继加入20μl微粒体(酶)，睾丸酮(25μg/ml最终浓度)和黄体酮(20μg/ml，最终浓度)。然后对反应混合物加入5α-还原酶底物。通过加入NADPH(490μg/ml最终浓度)启动酶促反应，在37℃温育1小时。然后通过乙醚提取底物制备样品用于HPLC分析。将睾丸酮和黄体酮的峰面积积分，与睾丸酮和黄体酮的标准品相比较，根据剩余未代谢底物的含量计算抑制作用。
开始发现，5α-还原酶活性很大程度地受消化缓冲液和安慰剂胶囊的抑制。但是，如表19中所示，将消化产品煮沸2分钟或者至50℃加热5分钟，有效地降低了那些成分对5α-还原酶的非特异性抑制作用，而包含在锯齿棕制备物中的抑制作用保持未受影响。表19中的数据表示存在50μg/ml锯齿棕制备物与5α-还原酶共温育时对睾丸酮代谢抑制的平均百分数。
这些数据表明，在模拟消化之后，甚至在通过煮沸或加热使肠酶失活之后锯齿棕材料仍有活性。通过0.2μ注射器滤器过滤的样品丧失了活性(数据未列出)。
通过检测5-羟色胺生成和雄性激素受体的转变对5α-还原酶抑制的测定法单一的多位点测定法能够在体外模拟5-羟色胺生成抑制和5-羟色胺转变雄性激素受体抑制之间的协同活性。将如下混合物用于测定生物活性重组5α-还原酶或包含5α-还原酶的微粒体，辅因子NADPH，限定浓度的底物睾丸酮，包含结合于HSP90的未配位雄性激素受体成分的脑液或核提取物，以及限定浓度的生物素化雄性激素应答元件DNA。需要时可对上面列举的成分加入其它的成分。
加入锯齿棕组合物，包含缺少锯齿棕组合物的类似制备样品的阳性对照，和既缺少睾丸酮又缺少锯齿棕组合物的阴性对照刺激等分量的这种混合液[锯齿棕组合物是…]。此测定法可检测对由5α-还原酶催化的从睾丸酮生成5-羟色胺的抑制作用。5-羟色胺结合于雄性激素受体，并转变此受体，致使雄性激素受体可以结合于雄性激素应答元件DNA。因此，通过抑制5-羟色胺生成，锯齿棕可抑制雄性激素受体转变成为能够结合于雄性激素应答元件DNA的形式。为了检测雄性激素受体是否已被转变，使此混合液与结合于ELISA检测板的中性亲和素，亲和素或链亲和素接触，从而使此混合液中生物素化的雄性激素应答元件DNA被固定化。此混合液中的雄性激素受体如果被5-羟色胺转变了，则可与雄性激素应答元件DNA形成复合物而因此被固定化。洗去未结合的材料。使此ELISA检测板与抗-雄性激素受体抗体接触，致使此抗体结合于检测板上的雄性激素应答元件-雄性激素受体复合物。应用本领域已知的多种技术可检测此抗体和复合物。例如，可用酶或荧光标记物，或者其它可检测的部分标记此抗体。按优选的方法，是使第二抗体即偶联于碱性磷酸酶的抗-抗体结合于连接在检测板上的抗体和复合物。使用对硝基苯磷酸盐(PNPP)检测碱性磷酸酶的酶催化作用，并在ELISA检测板测定仪中作比色测定。含有锯齿棕的反应扣除阴性对照的活性，除以阳性对照扣除阴性对照的活性，得到锯齿棕提取物抑制作用的百分数，以在此测定法范围内的几个剂量用于评估IC50。对PGF2产生抑制作用的测定法测定锯齿棕组合物抑制由以γ-干扰素(IFN-γ)刺激的巨噬细胞产生前列腺素E2(PGE2)的能力。
在补充有2mM L-谷氨酰胺(Gibco),10％胎牛血清(Gemini,Carlsbad,CA)和1％青霉素/链霉素液的DMEM(Gibco,Long Island,NY)中培殖RAW 264.7巨噬细胞(ATCC,Rockville,MD)。在细胞密度为106个细胞/ml时使细胞传代，以此相同的细胞数目用于所有的实验。将RAW264.7细胞接种进入24孔组织培养板(1ml/孔)。在加入和不加入通过如实施例1中模拟消化作用制备的锯齿棕制备物时孵育待测细胞，并同时加入10单位/ml IFN-γ(Gibco)刺激诱导PGE2产生。已知的合成环加氧酶抑制剂吲哚甲霉素(Indomethacin,Sigma,St.Louis,MO)被用作此方法的阳性对照。通过使用PGE2定量ELISA试剂盒(OxfordBiomedical Research,Oxford,MI)，结合由稀释进入组织培养基的已知浓度PGE2制作的标准曲线，测定组织培养基中PGE2水平来定量测定所产生的PGE2量。
表20显示三个浓度被消化处理的锯齿棕参照品材料或吲哚甲霉素与由用IFN-γ刺激的RAW 264.7巨噬细胞产生PGE2的剂量-反应关系。接下来我们评估了锯齿棕标准品批次间的可重复性。使三批相同的20μg/ml锯齿棕标准品经受模拟的消化作用，并在同一天进行测定(表21)。
实施例6对人参制备物生物活性的体外测定法对生物活性的测定法是基于对皮质类固醇的诱导作用和糖皮质激素对氧化氮合成酶同工酶的调节作用。对皮质酮诱导作用的测定法将由Hilltop Lab Animal(Scottdale,PA)供给的Swiss小鼠(20-25克)喂养在具有刨花垫底的聚碳酸酯笼中，72℃,12小时光照/黑暗循环。对动物供给啮齿动物饲料，任意饮水。皮质酮I125放射免疫测定(RIA)试剂盒由ICN Biomedicals(Costa Mesa,CA)提供，按照制造商的说明使用。用于建立和确认本测定方法的人参制剂是包含已临床测定和证明的人参提取物(G115)的产品。
在磷酸缓冲盐水(PBS)中制备待测样品至60mg/ml的浓度，或者经受如实施例1中所述的模拟消化方案的处理，不同的是所使用的人参待测材料的含量产生了最终浓度50mg/ml的人参提取物。每个处理组5只动物，以每100克动物体重50mg人参提取物的剂量，通过腹膜内注射给予待测材料或PBS赋形剂对照。给药后1小时采取血浆，应用定量RIA法测定皮质酮的水平。以Students T-检验作统计学分析。表22显示按照这些程序获得的典型结果。统计学显著性(P)是以盐水对照为基准。此数据证明，其皮质酮活性经受得住模拟的消化作用，在体内具有功能。
抑制氧化氮产生的测定法将RAW264.7巨噬细胞(ATCC,Rockville,MD)在DMEM(Gibco,Long Island,NY)中培养，此DMEM中补充有2mM L-谷氨酰胺(Gibco),10％胎牛血清(Gemini,Carlsbad,CA)和1％青霉素/链霉素液。使细胞超过106个细胞/ml的细胞密度，以此相同的细胞数目用于所有的实验。将RAW264.7细胞接种进入96孔组织培养板(100μl/孔)。在加入和不加入通过如实施例1中模拟消化作用制备的人参制备物时培育待测细胞，并同时加入10单位/ml IFN-γ[来源 ]刺激诱导氧化氮产生。黄体酮(Sigma,St.Louis,MO)被用作阳性对照。(Miller等，1996)。通过使用Griess试剂(Sigma,St.Louis,MO)(Miller等，1996)，结合由在组织培养基中含有已知μM量亚硝酸盐制作的标准曲线，测定组织培养基中氧化氮的副产品亚硝酸盐来定量测定产生的氧化氮量。
表23显示三个不同剂量的被消化处理的人参材料或者黄体酮对照与氧化氮产生抑制作用之间的剂量-反应关系。为了证实这种活性不是由于直接的自由基清除，还通过实施例3中描述的方法测定了经消化处理的人参制备物。高达400μg/ml的剂量显示出没有直接的自由基清除活性，表明氧化氮水平的降低非常可能是由于对氧化氮产生的抑制作用。
表24显示对于200μg/ml设定浓度的被消化处理的人参参照品材料，对氧化氮产生抑制作用的批次间可重复性。所测定的5批表现出了某些活性的变异性，但是总体上这种变异性小于10％(基于相对的标准差，％CV)。
参考文献Baker,R.R.(1995)，脑中血小板激活因子合成的酶。神经化学研究，20:1345-1351。
Barkats,M.et al(1995)，以EGb 761长期处理对三只纯系小鼠海马中年龄相关性结构改变的影响。生命科学，56:213-222。
Baureithel,K.H.et al(1997)，在体外各种金丝桃属种的一个成分阿曼托黄素对苯并二氮杂草结合的抑制作用。Pharm.Acta Helv.72:153-157。
Bazan,N.G.et al(1995)，血小板激活因子是神经系统中突触的信使和基因表达的调节剂。国际神经化学，26:435-441。
Behl,C.et al(1994),β-淀粉样肽诱导坏死而不是凋亡。脑研究，645:253-264。
Bladt,S.et al(1994)，金丝桃提取物的组分和成分对MAO的抑制作用。Geriatr精神病神经学杂志，7，增刊1:S57-9。
Bombardelli,et al(1997)，锯齿棕(Serenoa repens)(Bartram)J.K.Small.Fitotherapia 68:99-113。
Bonnet,J.J.et al(1986)，强有力的选择性多巴胺抑制剂GBR 12783:体内和体外生物化学研究。欧洲药学杂志，121:199-209。
Braeckman,J.(1994)，锯齿棕提取物用于治疗良性前列腺增生的治疗多中心开放研究(现代治疗研究)，Curr.Ther.Res.55:776-785。
Braquet,P.et al(1987)，血小板激活因子和细胞免疫应答。今日免疫学，8:345-352。
Burger,R.A.et al(1997)，紫松果菊诱导的人巨噬细胞产生细胞因子。国际免疫药学杂志，19:371-379。
Casarosa,C.et al(1988)，锯齿棕的Iyposterolic提取物缺乏对睾酮血浆水平，促卵泡激素和促黄体生成激素的作用。临床治疗，10:585-588。
Chaudry,A.A.et al(1994)，在体外良性和恶性前列腺组织中花生四烯酸的代谢脂肪酸和环加氧酶抑制剂的作用。国际癌症杂志，57:176-180。
Chevalier,G.et al(1997)，大鼠口服补充有[1-14C]-月桂酸，[1-14C]-油酸或者[4-14C]-β谷甾醇的锯齿棕的脂醇/甾醇提取物(Permixon)后，放射治疗分布的研究。欧洲药物代谢药物动力学杂志，22:73-83。
Chaterjee et al在体外Hyperforin抑制突触体摄入神经递度，并在体内显示抗抑郁活性。(1998a)Pgarmazie 53:9。
Coeugniet,E.G.et al(1987),Viscum album和紫松果菊提取物的免疫调节作用。Onkologie 10(增刊3):27-33。
Cott,J.M(1997)，贯叶连翘提取物在体外的受体结合和酶抑制作用。药物性精神病学30增刊2:108-112。
D′Angelo,L.et al(1986)，标准化的人参提取物对健康态敏态精神运动表现影响的双盲法安慰剂对照临床研究。人种药学杂志，16:15-22。
Delfino,D.et al(1991)，在体外培养来自骨髓的鼠天然杀伤细胞TNF-α和IFN-γ的作用。国际免疫药理学杂志，13:943-954。
Delos,S.et al(1994)，对在DU 145细胞检测的和在昆虫细胞中表达的“碱性”5α-还原酶(1型)活性的抑制。类固醇生物化学分子生物学杂志，84:347-352。
Di Rosa,M.et al(1990)，糖皮质激素抑制巨噬细胞内氧化氮合酶的诱导。生物化学生物物理研究通讯，172:1246-1252。
Di Silverio,F.et al(1992)，锯齿棕提取物在良性前列腺增生病人的前列腺组织中表现出抗雌激素活性。Eur.Urol.21:309-314。
Fukuda,K.et al(1995)，通过以黄芪根，人参根和黄芩根水提取物处理，血管平滑肌细胞中氮氧化酶和环GMP的增加。传统医学杂志，12:38-44。
Fulder,S.J.(1980)，人参，皮质类固醇和应急反应。第二届国际人参专题讨论会会刊，25-27。
Fulder,S.J.(1981)，人参和应急状态的下丘脑-垂体控制。美国中医杂志，9:112-118。
Gray,E.G.et al(1962)，从脑中分离神经末稍对通过匀浆化和离心得到的细胞组分的电子显微镜研究。解剖学杂志，96:79-87。
Hattori,M.et al(1994),Miller-Dieker Iissencephaly基因编码脑血小板激活因子乙酰水解酶的一个亚单位。自然，370:216-218。
Hawrylowica,C.M.et al(1994)，地塞米松对人单核细胞上调颗粒细胞-巨噬细胞集落激活因子受体的表达。免疫学杂志，83:274-280。
Hiai,S.et al(1979)，人参皂角苷对垂体-肾上腺皮质系统的刺激作用。Endocrinol.Jpn.26:661-665。
Hofferberth,B.(1989)，银杏提取物对患有精神病器质性脑综合症病人神精生物学和心理测验检测结果的影响。Arzneimittelforschung 139:918-922。
Iehle,C.et al(1995)，人前列腺类固醇5α-还原酶的异构形式-选择性抑制剂的比较研究。类固醇生物化学/分子生物学杂志，54:273-279。
Isaacs,J.T.et al(1983)，在人增生的前列腺中二氢睾酮代谢的改变。临床内分泌学与代谢杂志，56:139-146。
Janssens,D.et al(1995)，银杏提取物和白果内酯对内皮细胞中低氧诱发的ATP降低的保护作用。生物化学与药理学，50:991-999。
Joyeux,M.et al(1995)，来自银杏的萜类和二黄酮与某些类黄酮的抗过氧化，抗坏死和清除特性的比较。医学植物学，61:126-129。
Kim,Y.H.et al(1966)，从药用植物人参提取的人参皂甙通过AP2位点对Cu,Zn-超氧化物岐化酶基因转录的激活作用。生物化学杂志，271:24539-24543。
Kinn,J.W.et al(1998)，血小板激活对冠状侧支血流的作用。循环，98:1431-1437。
Laakmann,G.et al(1998)，贯叶金丝桃轻微地减轻抑郁症Hyperforin与临床效果的关系。精神病药学31，增刊1:54-59。
Lee,Y.J.et al(1997)，来自人参的一种主要活性分子，人参皂甙-Rg1，是糖皮质激素受体的功能性配体。分子细胞内分泌学，133:135-140。
Linde,K.et al(1996)，贯叶金丝桃与抑郁症-随机及临床试验的概述和总体分析。BMJ 313:253-258。
Luettig,B.et al(1989)，从紫松果菊的植物细胞培养物中分离的多糖阿拉伯半乳聚糖的巨噬细胞激活作用。国家癌症研究所杂志，81:669-75。
Miller,L.et al(1996)，黄体酮抑制鼠巨噬细胞中可诱导性氧化氮合酶基因表达和氧化氮产生。白细胞生物学杂志，59:442-450。
Muller,W.E.et al(1997)，在抗抑郁活性生物化学模型中金丝桃属植物提取物(LI160)的作用。精神病药物学，30:102-107。
Ni,Y.et al(1996)，银杏提取物对羟基诱发的大鼠小脑神经细胞凋亡的保护作用。神经科学通讯，214:115-118。
Nunez,D.et al(1986),BN 52021对PAF-acether-诱导的血小板激活的特异性抑制作用，以及用PAF-acether抑制剂南五味子酮和CV3988的比较。欧洲药学杂志，123:197-205。
Oyama,Y.et al(1994)，银杏提取物的类黄酮成分杨梅树皮素和芝香甙大大降低静止的和Ca(2+)-装载的脑神经细胞的氧化代谢。脑研究，635:125-129。
Oyama,Y.et al(1996)，银杏提取物保护脑神经细胞对抗过氧化氮诱发的氧化应急状态。脑研究，712:349-352。
Paubert-Braquet M.et al(1996)，锯齿棕提取物(Permixon)对雌二醇/睾酮诱导的大鼠实验性前列腺肿大的作用。药理学研究，34:171-179。
Paubert-Braquet M.et al(1997)，锯齿棕(Permixon)的脂类脂质甾醇提取物对从人多形核嗜中性白细胞离子载体A23187刺激的白三烯产生的作用。Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 57:299-304。
Paubert-Braquet M.et al(1998)，锯齿棕(Permixon)的脂质甾醇提取物和它的主要成分对碱性成纤维细胞生长因子诱导的人前列腺组织活检培养物增殖的作用。欧洲泌尿学，33:340-347。
Park Y.C.et al(1996)，人参皂甙-Rh1和Rh2抑制鼠腹膜巨噬细胞内氧化氮合成的诱导。国际生物化学分子生物学，40:751-757。
Pearce,P.T.et al(1982)，人参和Eleuthrococcus Senticosus提取物-关于结合于类固醇受体的体外研究。日本内分泌学，29:567-573。
Plosker,G.L.(1996)，锯齿棕(Permixon)，关于它对良性前列腺增生的药理学和治疗效果的述评。药物与衰老，9:379-395。
Prescott,S.M.et al(1990)，血小板激活因子。生物化学杂志，265:17381-17384。
Radomski,M.W.et al(1990)，糖皮质激素抑制血管内皮细胞中可诱导的但不是组成性的氧化氮合酶的表达。美国国家科学院院刊，87:10043-10047。
Ravenna,L.et al(1996)，锯齿棕(Permixon)的脂质甾醇提取物对人前列腺细胞系的作用。前列腺，29:219-230。
Rhodes,L.et al(1993)，在体外和体内比5α-还原酶抑制剂finasteride(Proscar)和多种商品植物提取物的5α-还原酶抑制作用。前列腺，22:43-51。
Rimar,S.et al(1996)，人工胃消化后的标准化人参制备物的肺保护作用和血管舒张作用。肺药理学，9:205-209。
Robak,J.et al(1988)。类黄酮是超氧化阴离子清除剂。生物化学与药理学，37:837-841。
Robinette,C.L.(1988)，在大鼠侧前列腺性激素诱发的炎症和肌纤维增生。前列腺，12:271-286。
Roesler,J.et al(1991)，将来自植物紫松果菊细胞培养物的纯化多糖应用于待测对象介导吞噬细胞系统的激活，国际免疫药学杂志，13:931-941。
Rolland,P.H.et al(1981)，人良性前列腺增生前列腺素E2的作用以及它与bromocriptine治疗的关系。欧洲泌尿学，7:41-45。
Scaglione,F.et al(1996)，标准化的人参提取物GI15对于增强抗流感综合症疫苗接种和对普通感冒的保护作用的效果和安全性。实验药物临床研究，22:65-72。
See,D.M.et al(1997)，在体外紫松果菊和人参对健康对象和慢性疲劳综合症或获得性免疫缺失综合症病人的自然杀伤细胞和抗体-依赖性细胞细胞毒性的作用。免疫药理学，35:229-235。
Smith,P.F.et al(1996)，银杏叶的神经保护特性与血小板激活因子(PAF)可能关系的述评。人种药物学杂志，50:131-139。
Stimpel,M.et al(1984)，来自植物紫松果菊的纯化多糖组分对巨噬细胞的激活作用和对巨噬细胞细胞毒性的诱导。感染与免疫，46:845-849。
Strauch,C.et al(1994)，比较finasteride(Proscar)和锯齿棕(Permixon)对健康的男性志愿者5α-还原酶的抑制作用。欧洲泌尿学，26:247-252。
Sultan,C.et al(1984)，在人前皮成纤维细胞，“锯齿棕B”的脂质甾醇提取物对雄性激素代谢和结合的抑制作用。类固醇生物化学杂志，20:515-519。
Taylor,E.W.et al(1997)，在Caco-2模型中对来自组合文库的混合物的肠吸收筛选。药学研究，14:572-577。
Theyer,G.et al(1992)，在良性前列腺增生中浸润白细胞的表型特征。实验研究，66:96-107。
Thiede,H.M.et al(1994)，金丝桃提取物和金丝桃素对MAO和COMT的抑制作用。Geriatr精神病神经学杂志7增刊1:S54-S56。
Vacher,P.et al(1995)，来自锯齿棕的脂质甾醇提取物干扰促乳素受体的信号转导。生物医学科学杂志，2:357-365。
Vorbach,E.U.et al(1997)，对根据ICD-10具有严重抑郁事件的病人，贯叶金丝桃提取物LI 160对比丙咪嗪的效果和耐受性。药物精神病学30增刊2:81-85。
Wagner,H.et al(1988)，紫松果菊细胞培养物中的免疫活性多糖。植物化学，27:119-126。
Wink,D.A.et al(1993)，氧化氮对抗来自活性氧分子的细胞损伤和细胞毒性。美国国家科学院学报，90:9813-9817。
Warot,D.et al(1991)，银杏提取物对健康对象精神活动表现和记忆的对比性作用。治疗，46:33-6。
Yee,S.(1997)，体外跨越Caco-2细胞(结肠)的渗透性可预测在人体内的(小肠)吸收-事实或虚构。药学研究，14:763-766。
Yue,T.L.et al(1994)，血小板激活因子在脑损伤的病理生理学中假定的神精调节剂和介导物。神经生理学评论，8:11-24。
权利要求
1．一种评估天然组合物或提取物生物功能度的方法，包括使该天然组合物经受模拟的消化作用，模拟的吸收作用或者此二种作用，以便获得该天然组合物的制备物；测定该制备物内是否存在某一种或几种成分或者生物活性；以及使该制备物中此一种或几种成分或者生物活性的存在或不存在与该天然组合物或提取物的生物功能度相关联。
2．一种评估天然组合物或提取物生物功能度的方法，包括使该天然组合物经受模拟的消化作用，模拟的吸收作用或者二者的作用，以便获得该天然组合物的制备物；测定该制备物内是否存在某一种或几种成分；以及使此一种或几种成分的存在或不存在与该天然组合物或提取物的生物功能度相关联。
3．一种评估天然组合物或提取物生物功能度的方法，包括使该天然组合物经受模拟的消化作用，模拟的吸收作用或者二者的作用，以便获得该天然组合物的制备物；测定在该制备物内是否存在某一种或几种生物活性；以及使该制备物内一种或几种生物活性的存在或不存在与该天然组合物或提取物的生物功能相关联。
4．权利要求1的方法，包括使所述天然组合物经受模拟的消化和模拟的吸收。
5．权利要求4的方法，其中模拟的消化和模拟的吸收是相继进行。
6．权利要求4的方法，其中模拟的消化和模拟的吸收是同时进行。
7．权利要求1的方法，其中模拟的消化包括胃消化或者肠消化。
8．权利要求1的方法，其中模拟的消化包括胃消化和肠消化。
9．权利要求7的方法，其中的胃消化包括使天然组合物经受模拟的胃液持续作用有效的一段时间，以便消化此天然组合物或提取物。
10．权利要求9的方法，其中的模拟胃液包含至少一种胃酶。
11．权利要求9的方法，其中的模拟胃液包含胃蛋白酶和具有大约1.0-2.0的pH。
12．权利要求9的方法，其中的模拟胃液包含胃蛋白酶和具有大约1.2的pH。
13．权利要求7的方法，其中的肠消化包括使天然组合物经受模拟的肠液持续作用有效的一段时间，以便消化此天然组合物或提取物。
14．权利要求13的方法，其中的模拟肠液包含至少一种选自胰酶制剂、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶的胰腺酶。
15．权利要求1的方法，其中的模拟吸收包括转运该组合物的一种或几种成分跨越一种生物膜。
16．权利要求1的方法，其中的模拟吸收包括将该组合物的一种或几种成分从一种细胞单层的顶侧转运至基底侧。
17．权利要求16的方法，其中的细胞单层包括Caco-2细胞。
18．权利要求1的方法，其中的天然组合物是从植物来源获得。
19．权利要求1的方法，其中的天然组合物是从草本植物来源获得。
20．权利要求1的方法，其中的天然组合物是从动物来源获得。
21．权利要求1的方法，其中的天然组合物包括紫松果菊或它的提取物。
22．权利要求21的方法，其中是通过测定该制备物的免疫刺激活性来确定是否存在生物活性。
23．权利要求22的方法，还进一步包括提供该制备物和T淋巴细胞的混合物；以及在预先确定的温育时间之后测定该混合物中存在的肿瘤坏死因子的含量。
24．权利要求22的方法，还进一步包括提供该制备物和一个巨噬细胞系的混合物，以及在预定的温育时间之后测定该混合物中存在的肿瘤坏死因子的含量。
25．权利要求24的方法，其中的巨噬细胞系是RAW264.7。
26．权利要求21的方法，其中是通过测定外周血单核细胞(PBMCs)的增殖来确定是否存在生物活性。
27．权利要求26的方法，其中对增殖的测定包括测定代谢染料MTT的转变。
28．权利要求1的方法，其中的天然组合物包括贯叶金丝桃或它的提取物。
29．权利要求28的方法，其中是通过如下步骤来测定是否存在生物活性提供一个包含该制备物、突触体制备物和选自多巴胺和5-羟色胺的神经递质的混合物；以及检测该混合物中的突触体制备物对此神经递质的摄取。
30．权利要求1的方法，其中的天然组合物包括锯齿棕或它的提取物。
31．权利要求30的方法，其中是通过如下步骤测定生物活性提供一个包含该制备物、微粒体、辅因子NADPH，和一种或几种底物的混合物；以及检测该一种或几种底物的代谢。
32．权利要求31的方法，其中的一种或几种5α-还原酶底物是睾酮和黄体酮。
33．权利要求30的方法，其中是通过如下步骤测定其生物活性提供一种包含该制备物、5α-还原酶、辅因子NADPH、睾酮、与HSP90复合的未配位雄性激素受体和雄性激素应答元件DNA的混合物；以及检测该混合物中雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物的形成。
34．权利要求33的方法，其中的雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物被固定化在一种固相载体上。
35．权利要求33的方法，其中是通过比色法或荧光检测该雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物。
36．权利要求30的方法，其中是通过如下步骤测定其生物活性提供一种包含该制备物、未配位的芳烃受体和芳烃应答元件DNA的混合物；以及检测该混合物中芳烃受体-芳烃应答元件DNA复合物的形成。
37．权利要求36的方法，其中的雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物被固定化在一种固相载体上。
38．权利要求36的方法，其中是通过比色法或荧光检测该雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物。
39．权利要求30的方法，其中是通过如下步骤测定生物活性提供一种包含该制备物、巨噬细胞和γ-干扰素(IFN-γ)的混合物；以及检测该巨噬细胞的激活。
40．权利要求39的方法，其中对该巨噬细胞激活的测定包括检测前列腺素E2(PGE2)或氧化氮的产生。
41．权利要求1的方法，其中的天然组合物包括银杏或它的提取物。
42．权利要求41的方法，其中是通过测定自由基清除活性来确定其生物活性。
43．权利要求41的方法，其中是通过测定对血小板激活因子抑制的量来确定生物活性。
44．权利要求41的方法，其中是通过测定对神经毒性的抑制作用来确定其生物活性。
45．权利要求44的方法，其中对神经毒性抑制作用的测定包括在存在该制备物时使神经细胞经受有效降低神经细胞活度的物质或条件的作用；以及测定该神经细胞的活度。
46．权利要求1的方法，其中的天然组合物包括人参或它的提取物。
47．权利要求46的方法，其中是通过如下步骤确定生物活性对试验对象给予该制备物；以及测定该试验对象中皮质酮产生的量。
48．权利要求46的方法，其中是通过如下步骤确定生物活性提供一个包含该制备物、巨噬细胞和γ-干扰素(IFN-γ)的混合物；以及测定对该巨噬细胞中氧化氮产生的抑制作用量。
49．一种包含具有基本上按批次的组成一致性的天然组合物的食物疗法补品，该组成一致性通过包括如下步骤的方法评估使该食物疗法补品或该天然组合物的样品经受模拟的消化，模拟的吸收或者这二种作用，以便获得该样品的制备物；确定该制备物中存在某一种或几种成分；以及使此一种或几种成分的存在与组成一致性相关连。
50．一种包含具有基本上按批次的组成一致性的天然组合物的食物疗法补品，该组成一致性通过包括如下步骤的方法评估使该食物疗法补品或该天然组合物的样品经受模拟的消化，模拟的吸收或者这二种作用，以便获该样品的制备物；确定该制备物中存在某一种或几种成分；以及使此一种或几种成分的存在与组成一致性相关连。
51．一种包含具有基本上按批次的组成一致性的天然组合物的食物疗法补品，该组成一致性通过包括如下步骤的方法评估使该食物疗法补品或天然组合物的样品经受模拟的消化，模拟的吸收或者这二种作用，以便获得该样品的制备物；确定该制备物中存在某一种或几种生物活性；以及使此一种或几种生物活性的存在与组成一致性相关连。
52．权利要求49的食物疗法补品，其中使该食物疗法补品或天然组合物经受模拟的消化和模拟的吸收。
53．权利要求52的食物疗法补品，其中模拟消化和模拟吸收是相继进行。
54．权利要求52的食物疗法补品，其中模拟的消化和模拟的吸收是同时进行。
55．权利要求49的食物疗法补品，其中的模拟消化包括胃消化或者肠消化。
56．权利要求49的食物疗法补品，其中的模拟消化包括胃消化和肠消化。
57．权利要求55的食物疗法补品，其中的胃消化包括使该食物疗法补品或天然组合物经受模拟胃液持续作用有效的一段时间，以便消化此天然组合物或提取物。
58．权利要求57的食物疗法补品，其中的模拟胃液包含胃酶。
59．权利要求57的食物疗法补品，其中的模拟胃液包含胃蛋白酶和具有大约1.0-2.0的pH。
60．权利要求57的食物疗法补品，其中的模拟胃液包含胃蛋白酶和具有大约1.2的pH。
61．权利要求55的食物疗法补品，其中的肠消化包括使该食物疗法补品或天然组合物经受模拟的肠液持续作用有效的一段时间，以便消化此天然组合物。
62．权利要求61的食物疗法补品，其中的模拟肠液包括至少一种选自胰酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶的胰腺酶。
63．权利要求49的食物疗法补品，其中的模拟吸收包括转运该组合物的一种或几种成分跨越一种生物膜。
64．权利要求49的食物疗法补品，其中的模拟吸收包括将该组合物的一种或几种成分从一种细胞单层的顶侧转运至基底侧。
65．权利要求64的食物疗法补品，其中的细胞单层包括Caco-2细胞。
66．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物是从植物来源获得。
67．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物是从草本植物来源获得。
68．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物是从动物来源获得。
69．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物包括紫松果菊或它的提取物。
70．权利要求69的食物疗法补品，其中该制备物被测定其免疫刺激活性。
71．权利要求70的食物疗法补品，其中是通过如下步骤来确定其组成一致性提供该制备物和T淋巴细胞的混合物；预定的温育时间之后测定该混合物中存在的肿瘤坏死因子的含量；以及将此肿瘤坏死因子的含量与组成一致性相关连。
72．权利要求70的食物疗法补品，其中是通过如下步骤来确定其组成一致性提供包含该制备物和巨噬细胞系的混合物；在预定的温育时间之后测定该混合物中存在的肿瘤坏死因子的含量；以及将此肿瘤坏死因子的含量与组成一致性相关连。
73．权利要求72的食物疗法补品，其中的巨噬细胞系是RAW264.7。
74．权利要求69的食物疗法补品，其中是通过如下步骤来确定其组成一致性提供包含该制备物和外周血单核细胞(PBMCs)的混合物；测定该混合物中此PBMCs的增殖；以及将该PBMCs的增殖与组成一致性相关连。
75．权利要求74的食物疗法补品，其中对增殖的测定包括测定代谢染料MTT的转变。
76．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物包括贯叶金丝桃或它的提取物。
77．权利要求76的食物疗法补品，其中是通过如下步骤来确定其组成一致性提供一个包含该制备物、突触体制备物和选自多巴胺和5-HT的神经递质的混合物；检测突触体制备物对此神经递质的摄取；以及将此摄取量与组成一致性相关连。
78．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物包括锯齿棕或它的提取物。
79．权利要求78的食物疗法补品，其中是通过如下步骤确定其组成一致性提供一个包含该制备物、微粒体、辅因子NADPH和一种或几种5α-还原酶底物的混合物；检测该一种或几种底物的代谢；以及将该底物的代谢与组成一致性相关连。
80．权利要求79的食物疗法补品，其中的一种或几种5α-还原酶底物是睾酮和黄体酮。
81．权利要求78的食物疗法补品，其中是通过如下步骤确定其组成一致性提供一种包含该制备物、5α-还原酶、辅因子NADPH、睾酮、与HSP90复合的未配位雄性激素受体和雄性激素应答元件DNA的混合物；检测雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物的形成；以及将该复合物的形成与组成一致性相关连。
82．权利要求81的食物疗法补品，其中的雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物被固定化在一种固相载体上。
83．权利要求81的食物疗法补品，其中是通过比色法或荧光检测该雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物。
84．权利要求78的食物疗法补品，其中是通过如下步骤来确定其组成一致性提供一种包含该制备物、未配位的芳烃受体和芳烃应答元件DNA的混合物；检测芳烃受体-芳烃应答元件DNA复合物的形成；以及将该复合物的形成与组成一致性相关连。
85．权利要求84的食物疗法补品，其中的雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物被固定化在一种固相载体上。
86．权利要求84的食物疗法补品，其中是通过比色法或荧光检测该雄性激素受体-雄性激素应答元件复合物。
87．权利要求78的食物疗法补品，其中是通过如下步骤确定其组成一致性提供一种包含该制备物、巨噬细胞和γ-干扰素(IFN-γ)的混合物；检测该巨噬细胞的激活；以及将该巨噬细胞的激活与组成一致性相关连。
88．权利要求87的方法，其中对该巨噬细胞激活的测定包括检测前列腺素E2或氧化氮的产生。
89．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物包括银杏或它的提取物。
90．权利要求89的食物疗法补品，其中是通过观测自由基的清除活性和将这种活性与组成一致性相关连来确定组成一致性。
91．权利要求89的食物疗法补品，其中是通过观测对血小板激活因子的抑制和将这咱抑制与组成一致性相关连来确定组成一致性。
92．权利要求89的食物疗法补品，其中是通过观测对神经毒性的抑制作用和将这种抑制作用与组成一致性相关连来确定组成一致性。
93．权利要求92的食物疗法补品，其中是通过如下步骤来确定组成一致性在有该制备物存在时使神经细胞经受有效降低神经细胞活度的物质或条件的作用；测定该神经细胞的活度；以及将神经细胞的活度与组成一致性相关连。
94．权利要求49的食物疗法补品，其中的天然组合物包括人参或它的提取物。
95．权利要求94的食物疗法补品，其中是通过如下步骤确定其组成一致性将该制备物对试验对象给药；测定该试验对象中皮质酮的产生；以及将皮质酮的产生与组成一致性相关连。
96．权利要求94的食物疗法补品，其中是通过如下步骤确定其组成一致性提供一个包含该制备物、巨噬细胞和γ-干扰素(IFN-γ)的混合物；以及测定对该巨噬细胞中氧化氮产生的抑制作用；以及将对氧化氮产生的抑制作用与组成一致性相关连。
97．一种制备包含天然组合物的食物疗法补品的方法，该食物疗法补品具有基本上按批次的一致性，该组成一致性通过包括如下步骤的方法评估使该天然组合物的样品经受模拟的消化，模拟的吸收或者这二种作用，以便获得该样品的制备物；确定该制备物中是否存在某一种或几种成分；以及选择包含该一种或几种成分的制备物。
98．评估银杏组合物生物活性的方法，包括在有该组合物存在时使神经细胞经受有效降低该神经细胞活度的一种或几种物质或条件的作用；以及测定该神经细胞的活度。
99．权利要求98的方法，其中的一种或几种物质是β-淀粉样肽或谷氨酸。
100．一种评估锯齿棕组合物生物活性的方法，包括检测对雄性激素应答受体转变成DNA结合形式的抑制作用，此检测法包括提供一个包含该组合物、5-羟色胺、与HSP90复合的未配位雄性激素受体和雄性激素应答元件DNA的混合物；以及检测雄性激素受体-雄性激素应答元件DNA复合物的形成。
全文摘要
本发明提供了用于评估天然产品生物功能度的方法。因为天然产品一般都包含多种已知的和未知的活性成分，并且通常是摄食给药，所以本发明的方法是模拟消化道的正常生理消化和吸收。公开了几种方法，用于对天然组合物如草药，草本植物提取物和从它们得到的制剂，提供生物功能度的评价和品质确认试验，尽管对它们的活性成分和特异活性可能还不清楚。
文档编号G01N33/80GK1317974SQ99810878
公开日2001年10月17日 申请日期1999年7月14日 优先权日1998年7月14日
发明者B·兰德斯, G·维洛克, J·A·里尼格尔, Z·弗兰克 申请人:帕拉塞尔斯安有限公司