神经营养生长因子的制作方法

专利名称：神经营养生长因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经营养生长因子，特别涉及在本文中被称为“enovin”(EVN)的神经营养生长因子的GDNF家族的新成员的克隆和表达。
前言神经营养生长因子参与神经元分化、发育和维持。这种蛋白能预防不同类型神经元细胞的变性，并促进其存活，因此是治疗神经变性疾病的潜在治疗剂。胶质细胞系衍生的神经营养生长因子(GDNF)是在结构上不同于神经营养蛋白的神经营养因子的日益增长的亚家族的第一个成员。GDNF是以在氨基酸序列中有7个高度保守的半胱氨酸残基的特殊形式为特征的生长因子的转化生长因子β(TGF-β)超家族的一员(Kingsley，1994)。GDNF最初是用一种分析方法根据其在体外维持胚性前侧小脑多巴胺能的神经元的存活和功能的能力纯化的(Lin等，1993)。中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)中的其他类型的神经元细胞也能对GDNF的存活作用产生应答(Henderson等，1994，Buj-Bello等，1995，Mount等，1995，Oppenheim等，1995)。GDNF是由细胞以无活性的前体形式产生的，该前体在RXXR弗林蛋白酶识别位点被专一性裂解产生活性的(成熟的)GDNF(Lin等，1993)。外源服用GDNF在帕金森病的动物模型上具有有效的神经保护作用，这种病是一种以在大脑的黑质中丧失了多达70％的多巴胺能的细胞为特征的常见的神经变性疾病(Beck等，1995，Tomac等，1995，Gash等，1996，Choi-Lundberg等，1997，Bilang-Bleuel等，1997)。
最近，业已发现了GDNF家族的其他神经营养因子。Neurturin(NTN)是从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的环条件培养基中纯化的，是用一种方法根据其促进交感神经元在培养物中的存活能力纯化的(Kotzbauer等，1996)。成熟的NTN蛋白与成熟的GDNF具有57％的相似性。Persephin(PSP)是通过以基因组DNA为模板用简并引物PCR克隆发现的。成熟的PSP与成熟的GDNF类似，能促进培养物中前侧小脑多巴胺能神经元和运动神经元的存活(Milbrandt等，1998)。成熟的PSP蛋白与成熟的GDNF和NTN的相似性大约为50％。Artemin(ARTN)是通过DNA数据库检索发现的，并且是培养物中传感和交感神经元的存活因子(Baloh等，1998b)。
为了完成下游胞内信号传导，GDNF、NTN、PSP和ARTN需要一种异源二聚体受体复合体。GDNF结合于GDNF家族受体α1(GFRα-1；GFRα命名协会，1997)亚基上，它是一种糖基磷脂酰-肌醇(糖基PtdIns)锚定的膜蛋白(Jing等，1996，Treanor等，1996，Sanicola等，1997)。GDNF/GFRα-1复合体随后结合并激活一种膜结合酪氨酸激酶---cRET原癌基因(Durbec等，1996，Trupp等，1996)，导致cRET中的酪氨酸残基的磷酸化，并随后激活下游信号传导途径(Worby等，1996)。业已鉴定了配体结合受体的GFRα家族的若干其他成员(Baloh等，1997，Sanicor等，1997，Klein等，1997，Buj-Bello等，1997，Suvanto等，1997)。GFRα-2和GFRα-3(Jing等，1997，Masure等，1998，Woby等，1998，Naveilham等，1998，Baloh等，1998a)业已由若干不同的研究小组所鉴定。GFRα-1和GFRα-2几乎在所有的组织中广泛表达，并且其表达是受发育调控的(Sanicola等，1997，Widenfalk等，1997)。
GFRα-3不在发育中的或成熟的中枢神经系统中表达，但在外周神经系统的若干发育中的和成熟的传感和交感神经节中高度表达(Widenfalk等，1998，Naveilhan等，1998，Baloh等，1998a)。第4个家族成员GFRα-4是由鸡cDNA克隆的(Thompson等，1998)。GFRα-1是GDNF的优选受体，而GFRα-2优选结合NTN(Jing等，1996，Treanor等，1996，Klein等，1997)。鸡GFRα-4与cRET一起构成PSP的功能性受体复合体(Enokido等，1998)。业已证实同时表达GFRα-3和cRET的细胞不能对GDNF、NTN或PSP应答(Worby等，1998，Baloh等，1998a)。最近，业已证实ART能用GFRα-3作为优选的配体结合受体通过cRET传导信号(Baloh等，1998b)。神经营养因子和GFRα受体之间在体外进行通讯是可能的，因为GDNF在存在cRET的条件下能结合于GFRα-2或GFRα-3上(Sanicola等，1997，Trupp等，1998)，并且NTN能以低亲合力结合于GFRα-1上(Klein等，1997)。总之，GDNF、NTN、PSP和ART是神经营养信号系统的一部分，因此不同的配体结合亚基(GFRα-1至-4)能与相同的酪氨酸激酶亚基(cRET)相互作用。这些体外发现的生理学关系最近已在基因剔除研究中显示(由Rosenthal做过综述，1999)，该研究清楚地表明，GDNF在体内能与GFRα-1相互作用，而NTN是GFRα-2的优选配体。
本发明人业已对GDNF家族的第4个成员enovin(EVN)进行了鉴定、克隆、表达、染色体定位和特征分析。由于不同的功能性和非功能性mRNA剪接变体的发现，加深了对成熟EVN蛋白的了解。而且，我们提供了表达数据、EVN与GFRα-3的结合数据和EVN对轴突派生的体外作用，以及在星形胞菌素分化的SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞培养物中对紫杉醇诱导的神经毒性的保护作用。
发明概述在本申请中，提供了一种编码新型人神经营养生长因子“enovin”的核酸分子，一种含有所述核酸分子的表达载体，一种用所述载体转化过的宿主细胞，一种由所述核酸分子编码的神经营养生长因子，分离的enovin，起着enovin的激动剂或拮抗剂作用的化合物，以及含有所述核酸或enovin蛋白或其激动剂或拮抗剂的药物组合物。发明详述根据本发明的第一方面，提供了一种编码具有图21所示的氨基酸序列、在本文中被称为enovin的人神经营养生长因子，或编码所述生长因子的功能性等同物、衍生物或生物前体的核酸分子。所述核酸分子优选为DNA，更优选为cDNA分子。
本发明的核酸优选包括

图1所示序列的从81到419号位置的序列，更优选从81到422号位置，更优选图1所示的完整序列。
从81到419号的核酸分子被认为编码成熟的enovin蛋白的序列，该成熟蛋白是在对所述enovin蛋白的稳定的前体上所存在的RXXR加工位点进行加工以后所得到的。
本发明还提供了一种能够在本领域技术人员众所周知的高严格条件下与本发明的任一种核酸序列杂交的反义分子。
本文所说的杂交的严格性是指能使核酸保持稳定的条件。杂合体的稳定性可以反映在杂合体的熔点温度(Tm)上。Tm大体上可以通过以下公式表达
81.5℃-16.6(log10[Na+]+0.41(％G&C)-600/l其中，1是杂合体的长度，以核苷酸数计。序列同源性每降低1％，Tm降低大约1-1.5℃。
理想的是，可以用合适的表达载体在宿主细胞或类似物中用本发明的核酸分子表达本发明人神经营养生长因子。
本发明的表达载体包括能够表达可操作地连接于能影响所述DNA片段表达的调控序列如启动子区的DNA的载体。
表达所需的调控元件包括结合RNA聚合酶的启动子序列和用于核糖体结合的转录起始序列。例如，细菌表达载体可以包括启动子如lac启动子和用于转录起始的SD序列，以及起始密码子AUG。类似地，真核表达载体可以包括RNA聚合酶II的异源或同源启动子，下游聚腺苷酸化信号，起始密码子AUG，用于解离核糖体的终止密码子。所述载体可以通过商业渠道获得，或者通过本领域众所周知的方法用公开的序列组装。
因此，表达载体是指重组DNA或RNA结构，如质粒、噬菌体、重组病毒或在导入合适的宿主细胞之后会导致所述DNA或RNA片段表达的其他载体。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知，并包括能在真核细胞和/或原核细胞中复制的载体，以及保持其游离体形式的载体或能整合到宿主细胞基因组上的载体。
可将能与本发明核酸杂交的反义分子用作探针或药物或用于药物组合物中。
可以沿反义方向将本发明的核酸分子插入所述载体中，以便能产生反义RNA。可以通过合成方法生产反义RNA或其他反义核酸。
本发明的另一方面包括用本发明的表达载体转化、转染或感染过的宿主细胞，该细胞优选包括真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
对于本领域技术人员来说，将克隆的DNA整合到合适的表达载体上，并随后用于转化所述细胞，再随后筛选转化细胞是众所周知的，并且披露于Sambrook等(1989)《分子克隆，实验室手册》，冷泉港实验室出版社中。
本发明的另一方面包括具有本发明核酸分子的至少15个核苷酸的核酸分子，优选15-50个核苷酸。
所述序列可优选用作探针或启动复制的引物等。所述核酸分子可以用本领域公知的技术生产，如可以通过重组或合成方法。可将其用于诊断试剂盒或装置等中，用于检测本发明核酸的存在。所述检测通常包括让所述探针与一种样品在杂交条件下接触，并检测在所述探针和该样品中任何核酸之间所形成的任何双体的存在。
根据本发明，所述探针可以锚定在固体支持物上。优选将其排成阵列，以便多种探针可以同时与同一种生物学样品杂交。可将所述探针滴加到所述阵列上，或者在所述阵列上原位合成(参见Lockhart等，《自然生物技术》，14卷，1996年12月，“通过杂交到高密度寡核苷酸阵列中的监测表达”)。单独一个阵列可以在不同的位置含有超过100、500甚至超过1000种不同的探针。
本发明的核酸分子还可以用诸如重组或合成的方法生产，例如，使用PCR克隆原理，它总体上涉及生产一对引物，它可以是来自需要克隆的基因的大约10-50个核苷酸的片段，让所述引物与源于人细胞的mRNA、cDNA或基因组DNA接触，在能够扩增所述目标区的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的区或片段，并回收扩增的DNA。一般，本文中所述技术在本领域中是众所周知的，如由Sambrook等所披露(《分子克隆实验室手册》，1989)。
本发明的核酸或寡核苷酸可以携带一种显示标记。合适的标记包括放射性同位素如32P或35S、酶标记、或其他蛋白标记如生物素或荧光标记。所述标记可以添加到本发明的核酸或寡核苷酸上，并可以用本身已知的技术检测。
例如，优选可以通过探测来自诸如不同群体的多个个体的cDNA或基因组文库鉴定本发明DNA分子的人类等位变体或多态性。另外，本发明的核酸和探针可用于使用本领域已知的技术对来自患者的基因组DNA进行测序，如Sanger双脱氧链终止方法，该方法可优选用于在患者中确定与本发明的生长因子相关的某些疾病的任何诱因。
本发明还提供了含有能够表达本发明的人神经营养因子enovin的转基因的转基因细胞、组织或有机体。
本文所使用的术语“能够表达的转基因”是指能导致具有本发明的神经营养因子的相同功能和/或活性的神经营养因子表达的任何合适的核酸序列。例如，所述转基因可以包括从人细胞中分离的基因组核酸或合成的核酸，包括cDNA，它可整合在染色体中或者保持染色体外的状态。
所述转基因优选包括本发明的载体，该载体包括编码所述神经营养因子的核酸分子或所述核酸分子的功能性片段，所述核酸的“功能性片段”应当被理解成编码所述神经营养因子或其功能性等同物的基因或cDNA片段，该片段能够表达以便产生本发明的功能性神经营养生长因子。因此，例如，相当于能与相应的受体相互作用的特定氨基酸残基的本发明神经营养生长因子的片段也构成了本发明的一部分，并且该片段可用作激活本发明生长因子的相应受体的激动剂，以便诱导其对细胞的生长促进和存活维持作用。本发明的该方面还包括本发明核酸的差别剪接的同等型和转录起始物。
根据本发明，一种特定的核酸不仅包括相同的核酸，而且还包括任何小的碱基变化，特别包括会产生同义密码子(不同的密码子编码相同的氨基酸残基)的碱基取代，这种现象是由于在保守的氨基酸取代中的简并密码所产生的。术语“核酸分子”还包括产生有关碱基变化的任一种单链的互补序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种由本文所定义的核酸分子编码的分离的人神经营养生长因子。所述生长因子优选包括图1的氨基酸序列上从27-139号位置上的氨基酸序列或其功能性等同物、衍生物或生物前体。
本文所说的“功能性等同物”应当被理解为具有与生长因子enovin相关的所有生长特性和功能的生长因子。本文所定义的enovin的“衍生物”意在包括这样的多肽，其中，某些氨基酸业已改变或缺失或被其他氨基酸所取代，并且该多肽保留了enovin的生物学活性和/或该多肽能够与用本发明的enovin作为刺激抗原产生的抗体起反应。
本发明的范围包括enovin的杂合体和修饰形式，包括融合蛋白及其片段。例如，所述杂合体和修饰形式包括在通过诸如点突变的方法对特定氨基酸进行某种修饰或取代时，所述修饰仍然能产生保留了本发明的enovin的生物学活性的蛋白。本领域技术人员可以对特定的核酸序列进行改变，以便产生具有与enovin相同或大体上相同的特征的生长因子。
正如本领域所熟知的，许多蛋白在体内产生时，在该蛋白的N-末端具有一个(前)信号序列。另外，所述蛋白可以包括一种进一步的原序列，它代表所述成熟蛋白的稳定的前体。通常，这种前序列和原序列不是生物学活性所必需的。本发明的enovin分子不仅包括图21所示的完整长度的序列，而且包括从27到139号位置的序列，在它后面是这种类型生长因子上所存在的RXXR蛋白裂解加工位点，并且它被认为是enovin的成熟序列。
本发明的特定的蛋白、多肽或氨基酸序列不仅包括相同的氨基酸序列，而且包括其异构体。另外，还包括在天然氨基酸序列基础上进行的小的氨基酸改变，包括保守性氨基酸取代(被与其侧链相关的氨基酸取代)。还包括与天然氨基酸不同的氨基酸序列，但所产生的多肽与由天然存在的序列所编码的多肽在免疫学上相同或相似。
本发明的蛋白和多肽还包括所述序列的变体，包括天然存在的等位变体(该变体与所述蛋白或多肽基本上同源)。在本文中，基本上同源被视为与由本发明的核酸分子所编码的蛋白或多肽具有至少70％、优选80％、90％或95％的氨基酸同源性的序列。
由本发明的宿主细胞表达的神经营养生长因子也包括在本发明的范围内。
本发明还涉及通过使用反义技术在体内抑制本发明的神经营养生长因子。反义技术可用于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA控制基因表达，这两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本发明的所述成熟蛋白的DNA序列的部分被用于设计一种长度为10-50bp的反义RNA寡核苷酸。将一种DNA寡核苷酸设计成与参与转录的基因的区域部分互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科学，241456(1998)；和Dervan等，科学，2511360(1990))，以便阻止enovin的转录和产生。所述反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并阻止mRNA分子翻译成enovin。
由于本文所披露的生长因子与以前鉴定的GDNF家族的生长因子的序列相似性，enovin还被认为能够促进细胞存活和生长，并用于治疗由于所述神经营养因子的功能或表达缺陷所导致的疾病。
因此，本发明的核酸分子或神经营养因子可优选用于治疗或预防患者的神经疾病，通过给所述患者服用足于减轻所述疾病的症状的浓度的量的本发明的核酸分子或生长因子。因此，本发明的核酸分子可用于促进神经元细胞的维持和存活，并用于治疗神经元疾病或神经变性症状，包括帕金森病、阿尔采默病、外周神经病、肌萎缩性侧索硬化、外周和中枢神经创伤或损伤，以及神经毒素中毒。
理想的是，业已观察到本发明的神经营养生长因子能够在神经元细胞或细胞群体，特别是已经诱导进行细胞程序死亡的神经元细胞或细胞群体上产生神经营养或神经保护作用。因此，本发明的核酸或enovin生长因子本身还可用于治疗神经变性疾病，如中风、亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、外周神经创伤、由于接触神经毒素所造成的损伤、多发性内分泌腺瘤形成、家族性先天性巨结肠、朊病毒相关疾病、Creutzfeld-Jacob病，通过给需要的患者服用足于减轻或预防本文所述神经疾病症状的浓度的量的所述核酸或enovin实现这一目的。
另外，正如在下面的实施例中更详细的披露的，业已证实enovin能加速诱导的传感缺陷的恢复，证实enovin是用于治疗或减轻由外周性或中枢神经发生成分、风湿病/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征的候选药物，通过给需要的患者服用足于减轻或预防所述疾病的症状的浓度的这种化合物。
用于治疗上述神经疾病的另一种方法包括在患者体内移植能表达本发明的人神经营养生长因子的细胞，如本文所述的转基因细胞。
还可将本发明的核酸分子和神经营养生长因子与可以药用的载体、稀释剂或其赋形剂同时加入药物组合物中。
本发明神经营养因子的抗体可优选通过本领域公知的技术制备。例如，多克隆抗体可以通过用所述生长因子或其表位接种诸如小鼠的宿主动物，并从免疫血清中回收制备。单克隆抗体可以按照已知技术，如由Kohler R.和Milstein C.披露的方法(自然，1975，256，495-497)制备。
本发明的抗体可优选用于检测本发明生长因子存在的方法中，该方法包括让所述抗体与一种样品反应，并鉴定结合于所述抗体上的任何蛋白。还提供了一种完成所述方法的试剂盒，该试剂盒包括本发明的抗体，以及让该抗体与所述样品反应的装置。
本发明还提供了一种用于检测本发明的神经营养生长因子在一种样品中存在的试剂盒或装置，包括一种上述抗体以及用于让所述抗体与所述样品起反应的装置。
可以通过使用分子生物学家所熟知的双杂交载体系统研究蛋白-蛋白相互作用来鉴定能与本发明的神经营养生长因子相互作用的蛋白，如其相应的细胞受体(Fields&Song，自然340245，1989)。该技术基于一种转录因子的体内功能重建，它能激活一种受体基因。更具体地讲，该技术包括提供一种合适的宿主细胞，该细胞具有一种DNA结构，该结构包括一个受一种启动子控制的报导基因，该启动子由一种具有DNA结合域和活化域的转录因子调控，在所述宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，该序列编码本发明核酸序列的一个片段或全部与所述转录因子的DNA结合域或活化域的第一融合体，在所述宿主中至少表达第二种杂合DNA序列，如一种文库等，它编码要与所述转录因子的DNA结合或活化域一起研究的推测的结合蛋白，该蛋白没有结合到所述第一种融合体中；通过检测所述宿主细胞中任何报导基因产物的出现，检测要研究的蛋白与本发明蛋白的所有结合；可选地分离编码所述结合蛋白的第二种杂合DNA序列。
所述技术的一种例子使用酵母中的GAL4蛋白。GAL4是酵母半乳糖代谢的转录激活物，并具有一个独立的结构域用于结合在半乳糖代谢基因上游的激活物上，以及一个蛋白结合域。可以构建核苷酸载体，所述载体之一包括编码所述GAL4 DNA结合域的核苷酸残基。所述结合域残基可以与已知的蛋白编码序列融合，如本发明的核酸。其他载体包括编码GAL4蛋白结合域的残基。所述残基与编码测试蛋白的残基融合，所述测试蛋白优选来自相关脊椎动物的信号传导途径。由本发明的核酸编码的神经营养生长因子与待测试的蛋白之间的任何相互作用都会在转入了载体的GAL-4转录缺陷型酵母细胞中导致报导分子的转录激活。优选的情况是，在恢复了酵母半乳糖代谢基因的转录后，一种报导分子如β-半乳糖苷酶被激活。
由本发明人鉴定的enovin的受体是GFRα3。因此可以进行分析，以便鉴定enovin的激活剂或拮抗化合物。该分析还可用于与其他神经营养生长因子及其相应的受体结合。所鉴定的化合物可用于治疗或预防疾病，如帕金森病、阿尔采默病、与扩增的聚谷氨酰胺序列相关的神经元疾病，如亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、外周神经创伤或由神经毒素造成的损伤、多发性内分泌腺瘤形成和家族性先天性巨结肠、朊病毒相关疾病、Creutzfeld-Jacob病、中风、主要由外周性或中枢神经发生成分、风湿病/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征，通过给患者服用足于预防或治疗所述神经疾病的浓度的量的所述激活剂或拮抗剂而进行所述治疗。所述化合物还可以与可以药用的载体、稀释剂或其赋形剂一起加入药物组合物中。
在一种实施方案中，可以通过如下方式鉴定一种生长因子(如enovin)的激活剂或拮抗剂在存在所述生长因子的条件下让能表达一种合适的受体和cRET的细胞组织或生物与候选化合物接触，并将所述细胞、组织或生物中的RET激活水平与未接触过所述候选化合物的对照进行比较。
本发明的另一种实施方案包括一种鉴定神经营养生长因子的激活剂或拮抗剂的方法，该方法包括在存在生长因子的条件下，让能表达所述生长因子和cRET合适受体的细胞组织或生物与候选化合物接触，测定包括所述合适的受体作为其一种成分的信号转导途径上的信号激酶的激活水平，然后加入对所述与一种报导分子接合的信号激酶专一的抗体，并与未接触过所述化合物的细胞组织或生物进行比较。
本发明的另一方面包括将所鉴定的化合物作为本发明的拮抗剂用于生产用来治疗胃肠道疾病或由肠蠕动增强所介导的症状的药物。
在本发明的试验中所鉴定的化合物可优选用于增强胃肠运动，因此可用于治疗与有障碍的或受到损伤的胃肠转运相关的症状。
因此，所述化合物可用于治疗患有与有障碍的或受到损伤的胃排空相关的症状或者更常见的是患有与有障碍的或受到损伤的胃肠转运相关的症状的包括人类在内的温血动物。因此提供了一种用于缓解患者症状的治疗方法，所述症状如胃食管回流、消化不良、胃轻瘫、手术后肠闭塞、和假性肠梗阻。
消化不良是一种消化功能损伤，它可以作为初期胃肠机能障碍，特别是与较强的肌肉紧张相关的胃肠机能障碍的症状或作为诸如盲肠炎、galbladder紊乱或营养不良的其他疾病的并发症出现。消化不良症状是诸如缺乏食欲、感觉饱胀、提前饱满、恶心、呕吐和腹胀。
胃轻瘫可以由胃的异常引起或者作为诸如糖尿病、进行性系统硬化、厌食、神经质和肌肉紧张性营养不良的疾病的并发症出现。
手术后肠闭塞是在手术之后破坏了肌肉的紧张所造成的肠道的障碍或动力损伤。
假性肠梗阻是一种以便秘、腹痛和呕吐为特征的疾病，但没有物理损伤的症状。
因此，本发明的化合物可用于消除所述疾病的实际诱因或者减轻所述疾病的症状。
另外，某些作为结肠的动力学活性刺激物的化合物可用于校正或改善患有与紊乱性运动性相关症状的患者的肠道转运，所述症状如单独的小肠和大肠蠕动减弱或与胃排空延迟的组合。
对于本发明化合物的结肠动力学用途来说，提供了一种治疗包括人在内的温血动物的方法，所述动物患有肠道系统能动性疾病，例如，便秘、假性梗塞、肠无力、手术后肠无力、过敏性腹部综合征(IBS)，以及药物诱导的转运延迟。
按照本发明试验方法所鉴定的拮抗剂化合物还可用于治疗或预防由于肠道蠕动加强所导致的胃肠道疾病，如腹泻(包括分泌性腹泻、细菌诱导的腹泻、胆性腹泻、旅行者腹泻和精神性腹泻)、Crohn’s病、痉挛性结肠、过敏性腹部综合征(IBS)、主要表现为腹泻的过敏性腹部胃肠道过敏。
对于本发明化合物的用途来说，本发明接着又提供了一种治疗包括人在内的温血动物的方法，所述动物患有诸如过敏性腹部综合征(IBS)，特别是IBS腹泻的胃肠道疾病。因此，提供了一种治疗方法，用于减轻患有诸如过敏性腹部综合征(IBS)、腹泻流行过敏性腹部综合征(IBS)、腹部过敏性的患者的症状，或者减轻与胃肠过敏性相关的痛苦。
本发明的化合物还可用于诸如与上腹部能动性相关的其他胃肠道疾病，并用作用于治疗呕吐、和细胞毒性药物和辐射诱导的呕吐的止吐药。
例如，炎性腹部疾病包括溃疡性肠炎、Crohn’s病等。
本发明的另一方面还包括一种治疗由本发明的enovin表达所介导的疾病的方法，通过给患者服用足于缓解或减轻所述疾病症状的浓度的量的本发明的反义分子或其拮抗剂而实现。
由enovin表达的失活或抑制所介导的疾病，还可以通过给患者服用足于减轻或抑制该疾病症状的浓度的被鉴定为enovin的激活剂的化合物来进行治疗。
另一方面，本发明提供了一种用于制备用来治疗与人神经营养生长因子enovin相关的疾病的药用制剂，所述方法包括选择一种被确定为本发明enovin的激活剂或拮抗剂的候选化合物，批量生产所述化合物，并将所生产的该化合物配制到可以药用的载体中。
通过下面的实施例可以更清楚地了解到enovin业已成功地减轻了紫杉醇诱导的传感缺陷。因此，enovin可能在主要由外周和中枢神经发生成分、风湿疾病所引起的痛苦综合征以及传导紊乱中起作用，并且可能在经过表皮、局部、局部中枢(如硬膜外、鞘内、ICV、丛内、神经内)经口腔、直肠和系统服用后在传感过程中起调节作用。因此，由enovin所介导的其他疾病可以用本文所述的相同方法减轻或预防，这一目的是通过服用足于减轻或预防所述疾病症状浓度的量的本发明的反义分子、核酸、enovin蛋白、药物组合物、或被确定为激活剂或拮抗剂的化合物来实现。
本发明的治疗或药物组合物可以通过本领域所公知的任何合适的途径服用，包括例如，静脉内、皮下、肌内、经皮、鞘内或颅内服用或者在来自体内的治疗方案中施加在细胞上。服用方式可以是快速的，如注射，或者需要一段时间，如通过缓慢输液或服用缓释剂。为了治疗中枢神经系统中的组织，可以通过向脑脊液(CSF)中注射或输液服用。
Enovin还可以与能提供所需的药理学或药效特性的试剂连接或接合。例如，可将其连接于本领域已知的能促进穿透或通过血脑屏障转运的任何物质，如运铁蛋白受体抗体，并通过静脉内注射服用。
本发明的enovin、反义分子或被确定为enovin的激活剂或拮抗剂的化合物可以药物组合物形式使用，该组合物可以用本领域公知的方法制备。优选的组合物包括可以药用的载体或稀释剂或赋形剂，如生理盐溶液。其他可以药用的载体包括其他无毒盐、无菌水或类似物质也可以使用。还可以存在一种合适的缓冲剂，以便可以将该组合物冻干并以无菌状态保存，或通过添加无菌水进行重配，以便随后使用。还可以将enovin掺入固体或半固体生物学上兼容的基质中，可将其置入需要治疗的组织中。
所述载体还可以含有其他可以药用的赋形剂，以便调节诸如pH、渗透压、粘度、无菌性、亲脂性、溶解度之类的其他条件。还可以包括能够在服用之后持续或延迟释放的可以药用的赋形剂。
本发明的enovin蛋白或核酸分子或化合物可以口服。在这种实施方案中，可将其胶囊化并与合适的载体以固体剂型组合，这些技术是本领域技术人员所熟知的。
正如本领域技术人员所熟知的，特定的剂量方案可以按照患者的身体表面积或身体所占的空间体积，根据将要使用的服用途径进行计算。不过，实际服用的组合物量是由医生根据与要治疗的疾病相关的情况确定的，如症状的严重程度，要服用的组合物，患者的体重和反应以及所选择的服用途径。
通过下面的实施例可以更清楚地理解本发明，这些实施例纯粹是解释性的，并结合附图进行说明，其中图1是被称为enovin的本发明的神经营养因子的部分cDNA序列。共有序列是通过用位于不同cDNA和基因组DNA上的引物PNHsp3和PNHap1通过PCR扩增，随后进行克隆和序列分析，并比较所获得的序列而获得的。推测的氨基酸的单字母密码表示在DNA序列上方。核苷酸残基数表示在DNA序列的右侧，而氨基酸残基数表示在翻译的蛋白序列的右侧。前结构域的推测的RXXR裂解位点用黑体表示，并在下面划线。成熟蛋白推测的起点用箭头表示。TGF-β家族的所有成员特有的7个保守的半胱氨酸残基用黑体表示。在潜在的N-糖基化位点下面加双划线，图2是人GDNF、NTN、PSP和EVN的推测的成熟蛋白序列的排比。用ClustalW排比程序排列所述序列。将在所有三种蛋白中保守的氨基酸圈在黑色区域中。将在两种或三种序列之间保守的残基涂成灰色。TGF-β家族成员特有的7个保守的半胱氨酸残基用星号在序列上方标出。氨基酸残基数在右侧标出。短线表示为了优化该排比而引入所述序列中的缺口，图3是enovin的部分cDNA序列。共有序列是通过对不同的cDNA进行PCR扩增(初级PCR使用引物PNHsp1和PNHap1，而巢式PCR用引物PNHsp2和PNHap2)，然后进行克隆和序列分析，并比较所获得的序列而获得的。核苷酸30-284(读框A)的翻译的氨基酸序列的单字母密码表示在该序列的上方，并在右侧进行编号(A1至A85)。该读框包括一个推测的ATG翻译起始密码子。核苷酸334-810(读框B)的翻译的氨基酸序列的单字母密码表示在该序列的上方，并在右侧进行编号(B1至B159)。该读框包括与GDNF、NTN和PSP同源的区域。核苷酸残基数表示在DNA序列的右侧。前结构域的推测的RXXR裂解位点用黑体表示，并在下面划线。推测的成熟蛋白的起点用箭头标出。TGF-β家族的所有成员特有的7个保守的半胱氨酸残基用黑体表示。在潜在的N-糖基化位点下面加双划线。
图4是人enovin染色体定位的说明。(A)enovin FISH作图结果的示意图。每一个点表示在人1号染色体的p31.3-p32区域检测到的双FISH信号。(B)enovin FISH作图的例子。左侧的照片表示1号染色体上的FISH信号。右侧照片表示用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色的相同的有丝分裂图象，以便确定1号染色体，图5表示enovin在不同人组织中的表达。(A)、(B)、(C)是enovin的组织表达的Northern印迹分析。用一种相当于enovin的编码区部分的探2针(包括编码成熟enovin蛋白的区域)分析人富含poly(A)的RNA的印迹，以便评价enovin mRNA在不同人组织中的表达。(A)多种组织Northern(MTN)印迹；(B)MTN印迹II；(C)胎儿MTN印迹II。图片(D)表示用相同的enovin cDNA片段探测的人RNA主印迹的放射性自显影。图片(E)表示人组织mRNA样品在来自(D)的RNA主印迹上的位置，图6是表示在用10-6M紫杉醇处理72小时之后SH-SY5-Y细胞的总的存活率以及提高enovin的剂量对该存活率的影响，对溶剂的条件进行规范化。在添加紫杉醇之前，用25nM星型孢菌素对SH-SY5-Y细胞进行5天分化。数据来自两个独立实验的6个重复。示出了平均值和标准误，图7是在提高enovin浓度48小时之后对星型孢菌素的轴突生长-分化的SH-SY5 Y细胞的影响的曲线图，相对溶剂的条件规范化。在开始所述48小时的实验之前，用25nM星型孢菌素对SH-SY5-Y细胞进行5天的分化。作为正对照，示出了25nM星型孢菌素的分化效果。根据至少5000个细胞计算轴突长度，所提供的数据来自重复进行的实验。示出了平均值和标准误。
图8-18是enovin对各种类型细胞增殖的影响的示意图，图19是enovin对用针刺试验进行的紫杉醇诱导的传感缺陷的影响的示意图。给出的是在用紫杉醇处理之后用两种不同剂量的enovin(23或130微克/克；n＝10大鼠/组)或载剂/盐水(n＝20只大鼠)处理过的大鼠随时间累计的平均得分数(±1SEM)。将体积为75微升的enovin或盐水/媒介物注射到右侧后爪子的足底下面。
图20是enovin对用针刺试验进行的紫杉醇诱导的传感缺陷的影响的示意图。给出的是在用紫杉醇处理之前用两种不同剂量的enovin(23或130微克/克；n＝10大鼠/组)或媒介物/盐水(n＝20只大鼠)处理过的大鼠随时间累计的平均得分(±1SEM)。将体积为75微升的enovin或盐水/媒介物注射到右侧后爪子的足底下面。
图21是enovin的DNA序列。其共有序列是通过用引物PNHsp5和PNHap1对人前额皮质cDNA和人基因组DNA进行扩增，然后进行克隆、序列分析，并比较所得到的序列而获得的。仅将能在翻译后产生功能性的enovin蛋白的剪接变体的预测的氨基酸序列表示在DNA序列上方。核苷酸残基数显示在DNA序列的左侧，而氨基酸残基数显示在翻译的蛋白序列的右侧。通过比较测序的cDNA片段和基因组序列而检测出的5’和3’剪接位点，通过分别向左和向右弯曲的垂直的线条标出，并进行连续编号。前结构域的推测的RXXR弗林蛋白酶裂解位点用黑体表示，并在下面划线。成熟蛋白的推测起点用箭头表示。TGF-β家族所有成员特有的7个保守的半胱氨酸残基用黑体表示。在潜在的N-连接的糖基化位点下面划双线。对5’和3’剪接位点进行编号并将其用线条圈起来。
图22表示不同的enovin剪接变体在人组织中的表达。(A)通过RT-PCR实验鉴定的enovin剪接变体的示意图，该实验是用enovin专一性引物在源于不同人组织的RNA上进行的，然后对PCR产物进行克隆和序列分析。顶部的一条线表示刻度(以bp为单位)。第二条线表示enovin基因组序列。标出了翻译起点和终止密码子、成熟的enovin编码序列的起点位置以及5’和3’剪接位点的位置(参见图21)。该图的右部表示对卵巢和前额皮质RNA进行RT-PCR所获得的PCR产物，同时示出了100bp的DNA梯(ladder)。标出了不同mRNA变体的位置及其大小(从起始密码子到终止密码子)。将翻译的蛋白表示在左侧。用方框画出的部分表示cDNA。虚线表示剪接出的基因组DNA。阴影部分表示成熟的enovin编码序列。点划线表示成熟enovin编码序列的起点。能够产生功能性enovin蛋白的两种转录物用星号表示在左侧。(B)主要剪接变体的组织分布。照片表示用enovin专一性引物和不同的人cDNA通过RT-PCR获得的PCR片段。四种主要的剪接变体(A-D)在左侧用箭头标出。大小在右侧标出，这是根据凝胶上作为大小参照物的100bp DNA梯衡量的。
图23enovin的长剪接变体的预测蛋白序列，是通过剪接去掉图21所示DNA序列的两个内含子而获得的。剪接位点5’-1和3’-1被用于消除第一个内含子，剪接位点5’-2和3’-3被用于消除第二个内含子。由此所得到的cDNA序列具有编码在上方示出的具有228个氨基酸残基的蛋白的开放读框。
图24enovin的另一种(短的)剪接变体的预测的蛋白序列，是通过从图21所示的DNA序列上剪切掉两个内含子而获得的。剪接位点5’-1和3’-2被用于消除第一个内含子，剪接位点5’-2和3’-3被用于消除第二个内含子。由此所得到的cDNA序列具有编码在上方示出的具有220个氨基酸残基的蛋白的开放读框。该蛋白序列与图23的序列相比缺少8个氨基酸残基。
图25是由被设计用于比较enovin在正常病变组织中的表达水平的实验所获得的结果的曲线图。示出了在多发性硬化和阿尔采默病人的脑组织中enovin和GAPDH的表达。
图26是检测enovin和GAPDH在帕金森病和癌症中的表达水平所获得结果的曲线图。
保藏物业已于1999年5月6日按照1997年4月28日的布达佩斯条约的规定对包括编码enovin的DNA序列的质粒EVNmat/pRSETB进行了保藏，保藏号为LMBP3931，保藏场所是比利时微生物协调保藏中心(BCCM)，Laboratorium voor Moleculaire-Plasmidencollectie(LMBP)B9000，Ghent，比利时。材料和方法材料所使用的天然Taq聚合酶、氨苄青霉素、IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)、X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)以及所有的限制酶均购自Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)。10mMdNTP混合物购自生命技术公司(Gaithersburg，MD，美国)。TOPO-TA试剂盒购自Invitrogen BV(Leek，荷兰)。Qiagen质粒小量或中量DNA纯化试剂盒，Qiaprep Spin微量制备试剂盒以及Qiaquick凝胶提取试剂盒购自Qiagen GmbH(杜塞尔多夫，德国)。cDNA文库、MarathonTmReady cDNA试剂盒、人多种组织cDNA(MTCTM)I组和II组多组织Northern印迹、Advantage-GC cDNA PCR试剂盒获自Clontech实验室(Palo Alto，CA，美国)。所有PCR反应是在GeneAmp PCR系统9600循环仪(Perkin Elmer，Foster市，CA，美国)中进行的。LB(Luria-Bertani)培养基包括10克/升的胰蛋白胨、5克/升酵母提取物和10克/升氯化钠。2×YT/氨苄青霉素平板包括16克/升胰蛋白胨、10克/升酵母提取物、5克/升氯化钠、15克/升琼脂和100毫克/升氨苄青霉素。
数据库同源性检索和序列比较。
用完整的人神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF；保藏号Q99748)、neurturin(NTN；保藏号P39905)和persephin(PSP；保藏号AF040962)cDNA衍生的蛋白序列作为查询序列，对每天更新的EMBL/GenBank人表达序列标记(EST)和基因组数据库进行BLAST(基础局部排比检索工具；Altschul等，1990)检索。
用保藏号为AC005038的基因组序列和存在于GenBank数据库中的若干ESTs进行另外的BLAST检索，并显示检测到的与该基因组序列的同源性。
通过用BESTFIT程序(遗传学计算机组序列分析软件包，8.0版，威斯康逊大学，Madison，WI，美国)对序列进行成对的比较，计算GDNF家族成员之间的百分相同性和百分相似性。DNA或蛋白序列的排比用ClustalW排比程序(EMBL，海德堡，德国)进行。
用于PCR和DNA测序的寡核苷酸合成所有的寡核苷酸引物是从Eurogentec(Seraing，比利时)订购的。插入专一性测序引物(15-和16-聚体)以及用于PCR反应的引物是手工设计的。DNA是在Qiagen-tip-20或-100阴离子交换柱或Qiaquickspin柱(Qiagen GmbH，杜塞尔多夫，德国)上制备的，并用30微升TE-缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA(钠盐)，pH8.0)从所述柱中回收。
用ABI prism BigDye终止循环测序试剂盒对两股链进行测序反应，并且在应用生物系统377XL测序仪(Perkin Elmer，ABI分部，Foster市，CA，美国)上运行。将SequeneherTM软件用于序列组装和人工编辑(GeneCodes，AnnArobor，MI，美国)。新型GDNF同系物的克隆EMBL保藏号为AC005038的从67411到68343号核苷酸的DNA片段所翻译的蛋白序列与成熟的NTN和PSP同源，将该片段用于设计PCR扩增的寡核苷酸引物。在表1中示出了所使用的不同的引物。
表1用于AC005038的片段的PCR扩增的引物。
引物名称引物序列PNHsp1 5′-CGGTGCACTCAGGTGATTCCTCC-3′PNHsp2 5′-GGCAGCAAACCCATTATACTGGAACC-3′PNHsp3 5′-CGCTGGTGCAGTGGAAGAGCC-3′PNHsp4 5′-CTGCACCCCCATCTGCTCTTCC-3′PNHap1 5′-GCAGGAAGAGCCACCGGTAAGG-3′PNHap2 5′-CCAGTCTGCAAAGCCCTGGAGC-3′用引物PNHsp3和PNHap1扩增源于不同人组织的cDNA(胎儿大脑、全胎儿、前列腺或肺Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech实验室)、前额皮质、海马体和小脑cDNA)和人基因组DNA上的502bp的片段。根据来自EMBL/GenBank数据库的基因组序列(保藏号AC005038)，预计要扩增的片段的G+C含量为76％。因此，扩增是用Advantage-GC cDNAPCR试剂盒(Clontech实验室，Palo Alto，CA，USA)，该试剂盒对富含GC的DNA序列的扩增进行了优化。PCR反应是在50微升的总体积中进行的，其中含有1×GC cDNA PCR反应缓冲液，0.2mM dNTP，1MGC-MELTTM，200nM引物PNHsp3和PNHap1，1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物，以及1-5微升的cDNA或0.5微克的基因组DNA。将样品加热到95℃保持5分钟，并循环35轮，参数为，在95℃下45秒，在58℃下1分钟，在72℃下40秒，最后一个步骤是在72℃下7分钟。最后用2.5U的天然Taq DNA聚合酶处理，以便添加A-突出端。在1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(钠盐)，pH8.3)中在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR产物。从凝胶上切除预计大小(495bp)的PCR片段，并用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化。对PCR片段进行测序，以便证实其同一性，并用TOPO TA试剂盒按照生产商的方法克隆到质粒载体pCR2.1-TOPO上。将大约20ng纯化的片段与1微升pCR2.1-TOPO载体混合于5微升的总体积中。在室温下(20℃)温育反应混合物5分钟。用热休克转化方法将2微升的反应混合物转入TOP1OF’感受态细胞(Invitrogen BV)中，并铺平板于补充了10mM IPTG和2％(w/v)X-gal的2×YT/氨苄青霉素平板上，进行兰色-白色筛选。在生长过夜之后从所述平板上挑选白色菌落，放入添加了100mg/l氨苄青霉素的5毫升LB培养基中生长，并用Qiaprep Spin微量制备试剂盒制备质粒DNA。通过用EcoRI进行限制性消化证实预期大小的插入片段的存在。对若干阳性克隆的质粒插入片段进行测序，并用ClustalW排比程序对所获得的序列进行比较。
为了获得新型GDNF同系物的其他编码序列，用引物PNHsp1和PNHap1通过PCR扩增基于EMBL/GenBank序列(保藏号AC005038)的具有预计的931bp大小的片段。PCR反应是在50微升的总体积中进行的，其中含有1×GC cDNA PCR反应缓冲液，0.2mM dNTP，1M GC-MELTTM，200nM的引物PNHsp3和PNHap1，1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物，和1-5微升的源于小脑、前额皮质或海马体的cDNA或0.5微克的基因组DNA。将样品加热到95℃保持5分钟，并循环35轮，参数为，在95℃下45秒，在58℃下1分钟，和在72℃下1分30秒，最后一个步骤是在72℃下7分钟。在1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(钠盐)，pH8.3)中在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分析PCR产物。用嵌套引物(PNHsp2和PNHap2)进行第二轮扩增。将1微升第一轮扩增的反应产物用于50微升的总体积中，其中含有1×GC cDNA PCR反应缓冲液，0.2mM dNTP，1M GC-MELTTM，200nM的引物PNHsp2和PNHap2，以及1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物。将样品加热到95℃保持5分钟，并循环35轮，参数为，在95℃下45秒，在58℃下1分钟，在72℃下1分30秒，最后一个步骤是在72℃下7分钟。在1×TAE缓冲液中在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分析样品。将预计大小(870bp)的PCR片段从所述凝胶上切除，并用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化。对PCR片段进行测序以便证实其同一性，用2.5U Taq聚合酶处理，并用TOPO TA克隆试剂盒按照生产商的说明克隆到质粒载体pCR2.1-TOPO上。将大约20ng的纯化片段与1微升pCR2.1-TOPO载体混合于5微升的总体积中。在室温(20℃)下培养反应混合物5分钟。用热休克转化方法将2微升的反应混合物转入TOP10F’感受态细胞中，并铺平板于补充了10mM IPTG和2％(w/v)X-gal的2×YT/氨苄青霉素平板上，进行兰色-白色筛选。在含有100mg/l氨苄青霉素的5毫升LB培养基中生长，并用Qiaprep Spin微量制备试剂盒制备的质粒DNA。通过用EcoRI进行限制性消化证实预期大小的插入片段的存在。用ClustalW排比程序对所获得的序列进行比较。
通过RT-PCR分析分析enovin基因表达将寡核苷酸引物PNHsp3和PNHap1(参见表1)用于专一性PCR扩增enovin的502bp的片段。PCR扩增是用标准化为六种不同管家基因的mRNA表达水平的人多种组织cDNA(MTCTM)组进行的。用enovin专一性引物进行的PCR扩增是在50微升的总体积中进行的，其中含有5微升的cDNA，1×GC cDNA PCR反应缓冲液，0.2Mm dNTP，1M GC-MELTTM，400nM的引物PNHsp3和PNHap1，以及1微升Advantage KlenTaq聚合酶混合物。将样品加热到95℃保持30秒，并循环35轮，参数为，在95℃下30秒，以及在68℃下30秒。在1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(钠盐)，pH8.3)中在1.2％(w/v)琼脂糖凝胶上分析样品，并用Eagle Eye II摄像系统(Stratagene，La Jolla，CA，美国)获得溴化乙锭染色凝胶的图象。
用人neurturin和persephin蛋白序列对每天更新的EMBL/GenBank数据库进行的相似性检索，得到了一种编码推测的类似于神经营养因子GDNF、NTN和PSP的新型蛋白的基因组DNA序列，它被命名为enovin(EVN)。用编码enovin的区域旁侧的基因组DNA序列进行的其他数据库同源性检索得到了源于不同人组织的若干表达序列标记(EST)克隆(前列腺上皮[保藏号AA533512(ID1322952)]，肺癌[保藏号AA931637]以及甲状旁腺肿瘤[保藏号AA844072])。这些克隆含有位于与GDNF、PSP或NTN同源的区域以外的DNA序列，但证实了enovin mRNA是在正常和肿瘤组织中表达的。
用基于基因组序列的引物(PNHsp3和PNHap1)进行的初始PCR扩增得到了来自胎儿、胎儿大脑、前列腺、前额皮质、海马体、小脑cDNA和来自基因组DNA的大约500bp的片段，但没有得到来自肺cDNA的该片段。对所述片段进行克隆和序列分析得到了一个具有474bp的DNA序列，它能被翻译成具有139个氨基酸残基的预测的蛋白序列，其中包括转化生长因子β(TGF-β)蛋白家族所有成员特有的7个保守的半胱氨酸(Kingsley，1994)(图1)。该序列还含有一个用于裂解前结构域(RAAR，23-26号氨基酸位置)的RXXR基序(Barr，1991)，在GDNF、NTN和PSP蛋白序列上前结构域序列的相当位置上存在一种类似的裂解位点。推测enovin前结构域的裂解在体内发生于该位点。成熟的EVN蛋白序列含有113个氨基酸残基(图1中27-139号残基)，并具有11965Da的计算分子量，其等电点为11.8。在成熟序列上存在一个潜在的N-糖基化位点(NST位于121-123号氨基酸位置上)。而且，在已知的神经营养因子GDNF、NTN和PSP的成熟形式之间保守的若干区域也存在于enovin中(图2)。表2归纳了通过BESTFIT程序比较GDNF家族成员的成熟蛋白序列的结果。示出了百分相同性和百分相似性。用于该比较的GDNF、NTN、PSP和EVN成熟序列始于RXXR裂解位点后面的第一个氨基酸。
表2用BESTFIT程序对成熟的人GDNF家族成员进行成对的比较。
比较 ％相同性％相似性EVN vs GDNF 38.8 47.2EVN vs NTN 51 56.1EVN vs PSP 53.3 57.8GDNF vs NTN 44.8 57.3GDNF vs PSP 44.3 50NTN vs PSP 50 54.4通过以上比较可以看出，成熟的enovin蛋白与persephin和neurturin的相关程度高于与GDNF的相关程度。
用基于基因组EMBL/GenBank序列(保藏号AC005038)的引物对源于前额皮质cDNA的enovin DNA序列的较大的片段进行扩增、克隆和序列分析，得到了一个819bp的序列(图3)。该序列包括一个位于30-32号核苷酸位置上的推测的ATG起始密码子，并包括一个延伸至位于285-287号核苷酸位置上的终止密码子的开放读框(图3中的读框A)。该区域的翻译蛋白序列未表现出与数据库中的任何已知蛋白具有相似性。第二个读框(图3中的读框B)中的cDNA序列的翻译得到了一种具有159个氨基酸残基的预测的蛋白序列。该序列包括RXXR裂解位点(B43-B46号位置；460-471号核苷酸位置)，并且该序列相当于成熟enovin序列(B47-B169号位置；472-810号核苷酸位置)。该开放读框包括RXXR裂解位点，并且成熟的enovin编码序列从334号核苷酸位置(其前面是框内终止密码子)延伸到位于811-813号位置上的终止密码子，但不包括编码起始甲硫氨酸残基的ATG密码子。与persephin相似(Milbrandt等，1998)，我们假定在源于EVN基因的mRNA转录物的主要部分中存在一个未剪接的内含子。GDNF和TNT在其相应的前结构域编码区也具有一个内含子(Matsushita等，1997，Heuckeroth等，1997)。
为了评估enovin的不同的mRNA转录物的存在，用位于可能的上游ATG起始密码子的5’的enovin编码序列5’末端引物(引物PNHsp5[5’-GCA AGC TGC CTC AAC AGG AGG G-3’]和嵌套引物PNHsp6[5’-GGT GGG GGAACA GCT C从CAA TGG-3’]以及位于3’末端(引物PNHap1和嵌套引物PNHap2[参见表1]的引物进行RT-PCR实验。用人多种组织cDNA组(Clontech MTC组I和II)、胎儿心脏cDNA文库(Clontech)和源于人小脑、海马体或前额皮质的cDNA进行实验(Masure等，1998)。按所述方法用引物PNHsp5和PNHap1在富含GC条件下(advantageGC-PCR试剂盒，Clontech)进行30轮(95℃-30秒，60℃-30秒，72℃-1分钟)初级PCR反应。用引物PNHsp6和PNHap2在相同条件下对1微升的初级PCR产物进行30轮巢式PCR反应。所得到的PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行分析，其大小分布在±350bp至±800bp。对凝胶上的若干带进行纯化，并对该PCR片段进行直接测序。还将某些纯化的PCR产物克隆到载体pCR2.1-TOPO(TOPO-TA克隆试剂盒，Invitrogen)然后再测序。序列分子证实了含有enovin序列的不同mRNA分子的存在。将所获得的片段序列与基因组enovin序列进行比较，这样使得我们能够确定存在于基因组序列上的若干可能的5’和3’剪接位点(图21)。所有这些剪接位点相当于供体和受体剪接位点的共有序列(Senapathy，P.Shapiro，M.B.&Harris，N.L.(1990)剪接接合，分支点位点，和外显子序列统计学、鉴定、和在基因组工程中的应用。酶学方法183，252-278)。所鉴定的不同的enovin剪接变体及其在不同人组织中的存在归纳于图22中。在五种测序的转录物中只有两种在从ATG起始密码子开始翻译之后能产生有功能的enovin蛋白。这两种转录物编码具有228或220个氨基酸的蛋白，分别具有47和39个氨基酸残基的预测的信号肽，在图23(长的变体)和图24(短的变体)中示出了这两种变体的预测的蛋白序列。所述长的变体可以根据图21的DNA序列通过切除位于5’-1和3’-1位置上的第一个内含子和位于5’-2和3’-3位置上的第二个内含子而推测。开放读框翻译时，图23的预期蛋白序列即可以得到。较短的变体可以根据图21的DNA序列通过切除位于5’-1和3’-2位置上的第一个内含子和位于5’-2和3’-3位置上的第二个内含子而推测。在翻译所述开放读框之后，获得了图24的预测的蛋白序列。
根据图22B中带的强度判断，最长的转录物似乎在大多数组织中的含量最丰富。较短的转录物产生移码，得到了一种缺少与GDNF、NTN和PSP同源的成熟enovin氨基酸序列的翻译蛋白。两种最小的转录物甚至缺少所述成熟编码序列部分，包括7个高度保守的半胱氨酸残基中的2个。图22B表示所述主要剪接变体在不同人组织中的分布。功能性enovin mRNA在几乎所有实验过的组织中表达，这些组织包括大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、骨骼肌、结肠、小肠、外周血白细胞、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘和胎儿心脏。在某些人组织(例如小脑、海马体)中，通过PCR只能扩增非功能性转录物。据我们所知，以前还没有披露过非功能性mRNA转录物的出现能达到如此程度。这一发现的生物学意义尚有待研究。尽管对NTN和PSP在不同组织中的表达尚不十分清楚，其表达水平似乎更低，并且其表达也在更大程度上局限于某些组织(Kotzbauer等，1996，Milbrandt等，1998)。
Enovin在enovin表达质粒的大肠杆菌结构中的重组表达用引物PNHsp4和PNHap2(表1)对来自人基因组DNA的414bp的PCR片段进行扩增，并用TA-克隆(Invitrogen)将其克隆到载体pCR2.1-TOPO上。通过序列分析证实插入片段的序列。将含有具有enovin共有序列的插入片段的克隆(克隆36)用于随后构建一种表达质粒。设计在其5’末端含有合适的限制位点的两种引物。正向引物PNHexp-sp1(5’-GCG GAT CCG GCT GGG GGC CCG GGC A-3’)含有一个BamHI位点(在下面划线)，而反向引物PNHexp-ap1(5’-GCC TCG AGTCAG CCC AGG CAG CCG CAG G-3’)含有一个XhoI限制位点(也在下面划线)。使用所述引物扩增来自克隆36的编码成熟enovin的343bp的片段(在图1中81-422号位置)。所述PCR反应是在50微升的总体积中进行，其中含有1×GC cDNA PCR反应缓冲液，0.2mM dNTP，1MGC-MELTTM，200nM引物PNHexp-sp1和PNHexp-ap1，1微升AdvantageKlenTaq聚合酶混合物，以及10ng来自克隆36的质粒DNA。将样品加热到94℃保持5分钟，并循环25轮，参数为，在94℃下45秒，在58℃下1分钟，在72℃下30秒，最后一个步骤是在72℃下7分钟。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化所得到的50微升产物，并以30微升的体积洗脱DNA。在37℃下，在1×缓冲液B(BoehringerMannheim)中以30微升的反应体积用10U BamHI和10U XhoI对25微升的该纯化产物进行消化1小时。在1×TAE缓冲液40mM Tris-乙酸，1mM EDTA(钠盐)，pH8.3)中在1％(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳，然后将预测的353bp的片段从所述凝胶上切除，并用Qiaquick凝胶提取试剂盒进行纯化，将所得到的片段连接到用BamHI和XhoI线性化的载体pRSET B(Invitrogen)上。通过全序列分析证实所得质粒结构(Hevnmat/pRSETB)的插入。所得到的结构编码一种具有146个氨基酸的蛋白，预测的分子量为15704Da，包括一个融合到成熟enovin编码序列框内的NH2-末端6×His-标记。所得到蛋白的NH2-末端氨基酸序列为MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPAGGPGS(成熟的enovin序列为黑体，在6个His标记下面划线)。
在BL21(DE3)大肠杆菌细胞中表达enovinenovin蛋白的重组生产基本上是按照由Creedon等(1997)所披露的生产Neurturin的方法生产的，对该方法进行了改进。为了生产重组enovin蛋白，将质粒hEVNmat/pRSETB转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)，并在30℃(225rpm)或37℃(300rpm)条件下在2×YT/氨苄青霉素-培养基(16g/l胰蛋白胨，10克/升酵母提取物，5克/升氯化钠，和100毫克/升氨苄青霉素)中生长到OD600大约为0.5，然后添加IPTG达到0.2mM的最终浓度，以便诱导表达。在进行3个小时的诱导之后，通过离心收获细胞沉淀物，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，离心并冷冻保藏。为了纯化和重新折叠，将细胞沉淀物重新悬浮于超声处理缓冲液中(20mM Tris-HCl，pH8.0，300mM氯化钠，1mM 2-巯基乙醇，蛋白酶抑制剂(CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物片剂(BoehringerMannheim，每50毫升缓冲液1片)和每500毫克细胞沉淀1毫克溶菌酶)。通过超声处理破坏细胞，并通过离心收获包含体。在缓冲液A(8M尿素，20mM Tris-HCl，pH7.6，200mM氯化钠，1mM 2-巯基乙醇)中溶解包含体，并在37℃下温育30分钟。然后添加Ni-NTA树脂(镍次氮基三乙酸，Qiagen)。在37℃下振荡40分钟，然后用缓冲液A洗涤样品1次，并加样到5毫升NI-NTA柱上。用10×柱体积的缓冲液A、10×柱体积的pH为7.2的缓冲液A和10×柱体积的pH为7.2的缓冲液A+10mM咪唑对所述柱进行连续洗涤。Enovin以4×柱体积的pH为7.2的缓冲液A+200mM咪唑从柱中洗涤。
Enovin重新折叠是通过在4℃下在复性缓冲液(0.1M磷酸钠，0.15M氯化钠，3μM半胱氨酸，0.02％Tween-20，10％甘油，0.01M Tris-HCl，pH8.3)中通过逐步的过夜透析进行的，在每一步骤中所述缓冲液含有减少量的尿素(6M至4M至3M至2M至1M至0.5M至0M尿素)。将纯化的蛋白等分，在-20℃下保存，并进一步用于功能性实验。
Enovin基因的染色体定位用根据EMBL保藏号AC005038的序列设计的引物EVN(7)-spl(5’-TTC GCG TGT CTA CAA ACT CAA CTC CC-3’)和PNHap1(5’-GCA GGAAGA GCC ACC GGT AAG G-3’)扩增来自小脑cDNA的Enovin基因的一个3.3kb的片段。PCR反应是在50微升的总体积中进行的，其中含有1×Expand Long Template PCR反应缓冲液(Boehringer Mannheim)，0.5mM dNTP，1M GC-MELTTM(Clontech)，400nM的引物EVN(7-sp1)和PNHap1，以及1微升的小脑cDNA。首先，在94℃下反应2分钟之后，加入0.75微升的Expand Long Template聚合酶(BoehringerMannheim)，并循环10轮，94℃下10秒，58℃下30秒，68℃下3分钟。然后再进行20轮反应，每1轮将68℃下的时间延长20秒。还包括最后在68℃下7分钟。在0.8％琼脂糖/TAE凝胶上电泳之后纯化所得到的3.3kb的片段，用TA-克隆(Invitrogen)克隆到载体pCR2.1-TOPO上。对一种克隆的3.3kb插入片段进行的全序列分析证实获得了相当于EMBL数据库中的基因组序列(保藏号AC005038)的cDNA序列。在从小脑cDNA中获得的cDNA上没有内含子被剪接掉。
基本上按公开的荧光素原位杂交(FISH)分析方法(Heng等，1992，Heng&Tsui，1993)进行染色体作图研究。在0.18毫克/毫升5-溴-2’脱氧尿苷(BrdU)处理之前，在37℃下培养人淋巴细胞68-72小时，以便使该细胞群体中的细胞周期同步。对同步化的细胞进行洗涤，并在37℃下再培养6小时。收获细胞，并用标准方法制备载玻片，包括低渗处理，固定和风干。将用于Enovin的3.3kb的探针生物素化，并用FISH检测。在55℃下烘烤载玻片1小时，用RNase处理，并在70℃下在用2×氯化钠/Cit(20×氯化钠/Cit为3M氯化钠，0.3M柠檬酸二钠，pH7.0)中制备的70％甲酰胺中变性2分钟，然后用乙醇脱水。在加样到变性的染色体载玻片上之前将探针变性。在杂交过夜之后洗涤载玻片，并分别在照相胶片上记录FISH信号和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚带形，通过重叠FISH信号和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚带形染色体实现FISH作图资料与染色体带的排比(Heng&Tsui，1993)。在所使用的条件下，该探针的杂交效率大约为72％(在100个检查过的有丝分裂图片中，有72个在一对所述染色体上出现信号)。由于4’，6-二脒基-2-苯基吲哚带被用于鉴定所述特殊的染色体，对来自探针和1号染色体的短臂之间的信号进行了排比。根据来自10张照片的总的结果进一步确定其详细的位置(图4A)。在所使用的条件下，通过FISH检测没有发现其他位点，因此，我们认为Enovin位于人的1号染色体的p31.3-p32.3处。在图4B中示出了所述作图结果的一种例子。
根据国家生物技术信息中心(NCBI，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap)的基因图谱数据，可以推断，含有Enovin序列的基因组克隆(EMBL保藏号AC005038)位于1号染色体的标记D1S2843和D1S417之间。它相当于1号染色体的p31.1-p32.3的区域，证实了通过FISH分析所获得的数据。
通过Northern印迹和斑点印迹分析确定的Enovin的组织分布按照生产商的说明用含有2微克源于不同人组织的富含poly(A)的RNA(Clontech实验室，Palo Alto，CA，美国；MTNTM印迹I，MTNTM印迹II和胎儿MTNTM印迹II)的Northern印迹与α32P-dCTP随机引物标记(High Prime试剂盒，Boehringer Mannheim)的897bp的Enovin片段杂交。该片段是通过用引物PNHsp1和PNHap1对前额皮质cDNA进行PCR扩增获得的，然后克隆到载体pCR2.1-TOPO上，该片段含有的Enovin序列的897bp，一直到终止密码子，并包括成熟的Enovin蛋白的完整的编码序列。
Enovin mRNA是以大约4.5kb的主转录物检测到的(图5A-C)。Enovin mRNA能在多种组织中表达，最主要的是在心脏、骨骼肌、胰腺和前列腺中表达。某些较小的转录物存在于诸如胎盘(4kb，2.4kb和1.6kb)和前列腺(4kb和1.6kb)之类的组织中。在胎儿组织中，一种主要的2.4kb的转录物存在于肝脏中，并以较少的含量存在于肺中。其他转录物还存在于胎儿肾脏、肝脏、肺和大脑中。
另外，让含有源于不同人组织和发育阶段的富含poly(A)的RNA的RNA主印迹(Clontech实验室)与897bp的Enovin探针杂交。用于制备该印迹的富含poly(A)的RNA样品由生产商相对8种不同的管家基因的mRNA表达水平进行过规范化。Enovin mRNA是普遍表达的，不过最高的mRNA含量出现在前列腺、脑垂体、气管、胎盘、胎儿肺、胰腺和肾脏中(图5D+E)。
构建GFRα-IgG-Fc融合载体将不包括编码信号肽和参与GPI-锚定的COOH-末端疏水性区的序列的GFRα-1、GFRα-2和GFRα-3的cDNA区(分别编码27-427、20-431和28-371号氨基酸)以框内形式克隆到表达载体Signal pIg plus(R&D系统欧洲有限公司)上。由这些结构表达所产生的蛋白包括17个氨基酸的NH2-末端CD33信号肽，GFRα蛋白区和243个氨基酸的COOH-末端人IgGl-Fc融合域。用GFRα融合结构转染CHO细胞，并用500微克G418筛选稳定转染的细胞。用抗Fc抗体筛选永久性克隆。为了纯化GFRα融合蛋白，在无血清培养基中生长细胞，并每隔3天之后收集培养基。对培养基进行离心，并加样到蛋白A柱(蛋白A Sepharose，Pbarmacia生物技术)。用0.1M柠檬酸钠pH3.0洗脱结合的蛋白，并收集到1M Tris缓冲液，pH8.4中。通过在280nm的吸收值估计蛋白浓度，使用1.5的消光系数。将这种纯化的可溶性GFRα-1到-3 Fc融合蛋白用于随后的结合研究。
表面胞质共振分析表面胞质共振(SPR)实验是用BIAcore3000仪器在25℃下进行的。用enovin和NGF作为固定化配体进行分析。首先用400mM N-乙基-N-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和100mM N-羟基-琥珀酰亚胺的1∶1的混合物对F1传感芯片的羧基化基质进行10分钟的活化。然后以5微升/分钟的流速将溶解在10mM乙酸缓冲液，pH4.5中的重组enovin和NGF加样到所述活化的表面上。用1M盐酸乙醇胺使未被占据的活性基团失活。为了进行结合实验，以10微升/分钟的流速在10-100nM的HEPES缓冲的盐溶液(150mM氯化钠，3.5mM EDTA，0.05％P-20，10mM HEPES，pH7.4)中对浓度为10-100nM的可溶性GFRα1-3-Fc进行超融合。检测其结合3分钟，并检测其解离1分钟，然后用5mM氢氧化钠再生。解离是用HEPES缓冲盐溶液超融合启动的。用BIAcore评估软件3.0计算结合率(ka)，解离率(kd)和平衡解离常数(KD，以Kd/Ka计算)。
结果用SPR测定可溶性GFRα1-3与固定化enovin的结合。与enovin的专一性结合只能用可溶性GFRα3检测。GFRα1和GFRα2不能结合于固定化的enovin。所观察到的GFRα3的结合是专一性的，因为不能与NGF结合。在独立的对照实验中检测到TrkA-Fc(NGF受体)与固定化的NGF的专一性结合，而不与固定化的enovin结合。
根据用三种不同浓度的GFRα获得的结合曲线，推导出了表3中的以下常数。以上结果证实GFRα3能专一性地结合enovin。表3Ka(l/Ms) Kd(l/s) KD(M)GFRα3 1.65 1055.08 10-43.1 10-9由于GDNF、NTN、PSP都能促进不同类型神经细胞的维持和存活，预测enovin对神经细胞具有相同的生物学作用，并且有可能对其他类型的细胞产生类似作用。因此，预计enovin蛋白一般可被用于神经疾病的治疗中，这些疾病包括帕金森病、阿尔采默病、外周神经病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、外周神经创伤或损伤以及接触神经毒素造成的损伤。
Enovin还可用于神经保护的多个方面。考虑到它对不同神经细胞群体存活的影响以及对在我们的SH-SY5Y细胞模型上观察到的对轴突延伸的影响，我们认为该化合物可能具有神经保护和神经再生用途。
上述结论基于以下观察。紫杉醇能在NGF-分化的PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞中诱导神经细胞程序死亡(Nuydens等提出)，因此，紫杉醇诱导的细胞毒性具有通过DNA片段化、Annexin V标记和bc1-2保护检测到的神经细胞程序死亡的特征。因此，推而广之，可以推测紫杉醇能在分化的SH-SY5Y细胞中诱导细胞程序死亡。现已证实Enovin能够减弱这种细胞死亡，并因此可以在总体上逆转神经细胞的程序死亡。
因此，所述化合物可用于在其中业已观察到细胞程序死亡的下列神经变性疾病的治疗中风(Hakim1998)，帕金森病(Marsden等，1998)，阿尔采默病(NAGY等，1998)、亨廷顿病病(Wellington等，1997)，神经创伤(Smirnova等，1998)，外周神经病(Srinivisan等，1998)。
作为最后的临床证据的一个例子，我们业已证实这种神经营养因子确实能保护分化的SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞不受紫杉醇诱导的细胞毒性的影响。
存活性测定方法通过向每一个孔中添加补充了0.02mM吩嗪硫酸甲酯(PMS，Sigma)的100微升溶解在DMEM(37℃)中的1毫克/毫升2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-硫代苯基]-2H-四唑-5-carboxanilide(XTT，Sigma)来测定细胞存活性。然后在37℃下培养所述平板2.5小时。在450nm下读出光密度(分子装置)，用650nm作为对照。XTT实验基于四唑盐XTT向红色甲臢产物转化。该反应是用线粒体酶进行的。
神经分化的方法1.人成神经纤维瘤SH-SY5Y细胞中的分化用25nM星型孢菌素对SH-SY5Y细胞进行5天的分化。在开始实验之后72小时测定Enovin的作用(参见Jalava等，“蛋白激酶抑制剂星型孢菌素在SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞中通过a、b、z PKC独立途径诱导成熟的神经表型”，细胞生理学杂志，155，301-312(1993))。
2.测定轴突延伸通过以下方法对神经元的形态改变进行自动定量。简单地讲，在适当时间将戊二醛直接加入培养基中，并在室温下放置30分钟。这样能确保在该时间点的细胞的形态能反映真实的情况。在Axiovert显微镜(Zeiss Oberkochen，德国)上通过透射光模式观察所述细胞，在该显微镜上装配有一个由Indy工作站(Silicon Graphics，Mountain View，美国)驱动的Marzhauser扫描镜台。用一个MX5摄象机(HCS)获取图象。在64个并列的图象中对大约3000个细胞进行评价，形成8×8的图象方阵。图象的实际排比能确保轴突能够从一个图象视野进入另一个。用具有曲线结构的无系统误差的检测器对由多克隆tau抗体标记过的轴突延伸进行自动检测(Steger 1998)。分析软件能自动计算总的细胞体面积，细胞体数量以及总的轴突长度。
为了研究Enovin对不同类型细胞的影响，进行了2个实验。一个是DNA合成实验，另一个是趋化性实验。
DNA合成实验在37℃下在5％二氧化碳和95％的空气中在含有10％FBS的DMEM(39-SK、HSMC、大鼠成骨细胞)或在确定成分的培养基(软骨细胞和HUVEC)中维持包括人表皮成纤维细胞(39SK)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人平滑肌细胞(HSMC)、人软骨细胞、和大鼠成骨细胞在内的细胞。为了进行DNA合成实验，以5000细胞/孔的密度将细胞接种到96孔组织培养平板上的含有10％FBS的DMEM中，并培养24小时。然后用含有各种浓度Enovin和0.1％BSA的DMEM(对于39-SK、成骨细胞、HSMC、软骨细胞而言)或含有各种浓度Enovin和0.5％FBS的DMEM(对于HUVEC而言)取代所述培养基，并将细胞培养24小时。然后，用100微升含有5％FBS和0.1μi[3H]-胸苷的DMEM 100μl取代所述培养基。在进行2小时的脉冲标记之后，在室温下用甲醇/乙酸(3∶1，体积/体积)固定细胞。用80％的甲醇洗涤固定的细胞2次。将所述细胞在0.05％胰蛋白酶(100微升/孔)中溶解30分钟，然后在0.5％SDS(100微升/孔)中再溶解30分钟。将细胞裂解物的等分试样(180微升)与2毫升的闪烁混合物合并，并用液体闪烁计数器测定细胞裂解物的放射活性(Wallac1409)。
趋化性实验按照在“DNA合成实验”中所披露的方法维持细胞。用12孔改进的Boyden室分析Enovin的趋化性活性(McQuillan，D.J.，Handley，C.J.，Campbell，M.A.，Bolis，S.，Milway，V.E.，Herington，A.C.，(1986)，“通过血清和胰岛素样生长因子-I在培养的牛关节软骨中促进蛋白聚糖的合成”，生物化学杂志240423-430)。用0.05％胰蛋白酶和0.5mM EDTA对细胞进行胰酶消化，并重新悬浮在DMEM中。向Boyden室的底部孔中加入含有各种浓度Enovin的培养基的150微升的等分试样。将包被有0.1毫克/毫升I型胶原的聚碳酸酯膜(8微米)放置在所述底部孔的上面，然后组装顶部孔。向顶部孔中加入细胞的100微升的等分试样(70,000细胞/毫升)。在进行6小时的培养之后，将所述装置分开。去掉保留在所述膜顶部上的细胞。用10％的甲醛固定所述膜15分钟，然后用Gill’s强苏木精染色，在显微镜下统计细胞(250倍的放大倍数)，并使用每一个孔的5个区域的细胞数量的平均数。每一个实验至少重复4次。结果以对照(含有0.1％BSA的DMEM)的倍数形式表示。
如图8-18中的结果所示，Enovin对所使用的每一种细胞的增殖没有影响，或者对HUVEC细胞的迁移没有影响(图14)，如上文所述。Enovin对SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞有影响。这证实了Enovin对神经细胞的选择性影响。
业已证实GDNF和NTN通过由配体结合亚基GFRα-1或GFRα-2以及信号亚基cRET蛋白酪氨酸激酶组成的信号复合体传导信号。预计Enovin是通过一种由GFRα结合配偶体(GFRα-1、GFRα-2、最近鉴定的幼儿受体GFRα-3或其他尚未鉴定的GFRα家族成员)与cRET或其他信号配偶体组成的类似的信号复合体发挥其生物学作用。实际上，我们的结合资料证实，Enovin能专一性地结合于GFRα-3上。
在人类中，在GDNF或cRET上的种系突变能导致若干疾病表型，包括多发性内分泌腺瘤形成和家族性先天性巨结肠(SHCR)(Romeo等，1994，Edery等，1994，Angrist等，1996)。这两种疾病都与肠无力相关，其中先天性巨结肠是婴儿的先天性腹梗阻的最常见的诱因。有趣的是，GDNF或cRET剔除小鼠表现出与肾发育不全和肠道神经节细胞缺乏症十分相似的病理学症状(Sanchez等，1996；Moore等，1996；Pichel等，1996)。Enovin可能与肠道或肾脏的类似的疾病相关，或者由于它是普遍表达的，因此在身体的其他外周器官的发育中起着重要作用。
配体及其受体的相互作用通常是通过来自这两种蛋白上的特定的残基之间的特殊的键的相互作用实现的。一种蛋白的片段可以用作激活剂激活其受体，产生对细胞的生长促进和存活维持作用。因此，Enovin的部分或根据Enovin蛋白序列合成的肽可被用作激活剂或拮抗剂来调节其受体GFRα-3。使用肽合成或重组技术，可以生产出由GDNF、NTN或PSP或任何其他神经营养或生长因子与Enovin部分组成的杂合生长因子，以便得到具有新的特征的新型合成生长因子。
为了检验Enovin在足底注射到大鼠体内后是否能够改变大鼠的紫杉醇诱导的传感缺陷，进行了两个预实验。在第一个实验中，检验了用Enovin进行单一的处理是否能够逆转紫杉醇诱导的传感缺陷，而在第二个实验中检验了Enovin是否能够阻止紫杉醇诱导的缺陷的发展。
紫杉醇诱导的传感异常随时间的恢复方法使用体重为300-340克的雄性Sprague-Dawley大鼠。对所述动物进行单独圈养，让其自由摄取食物和水。在开始实验之前，将所述动物放入标准的观察笼中，在15分钟的适应期之后，评估针刺反射。为了达到这一目的，用针刺激所述动物右爪的足底表面，并以有(得分＝1)或无(得分＝0)统计对该针刺的反应。每一个时期内，重复以上过程3次，两个连续的针刺反应中时间间隔为1分钟；因此，所述针刺实验包括3次测定对针刺的反应。仅将在3次针刺中都具有正常反应的大鼠用于该实验。
连续3天在上午每日给所述动物右侧后脚的足底注射50微升的紫杉醇(3毫克/毫升paclitaxel，溶解在cremophor和脱水醇加水中)。在次日上午，再次评价针刺反应，并筛选对3次针刺没有任何反应的动物。将这些动物随机分成小组(n＝10/组)，在右侧后脚的足底注射75微升的载体、盐水或23或130微克/毫升Enovin。由于在用载体和盐水处理的动物之间没有发现差别，将这两组合并(对照组)，在最后一次处理之后第1、4、5和7天，在上午(上午8-9点)和下午(下午330-430)进行针刺实验。在第8天的上午进行最后一次针刺实验。对每一只动物来说，随时间测定对针刺反应的累计得分。由于总共9次针刺实验(每次包括3次针刺)是在最后一次药物处理之后进行的，在该实验的总时间之后所得到的最大得分为27。
结果连续3天在足底反复注射紫杉醇，会在大部分动物上导致急性炎性反应，使其缺乏对针刺刺激的反应。足底注射盐水或载体不会影响紫杉醇诱导的缺陷型。在第一次测定时，在20个对照中仅有4个表现出对3次针刺的至少1次反应，并且第一次测定的对照的平均(±SEM)针刺得分为0.25(±0.12)；这与实验开始的情况不同，那时平均得分为3.0(±0.0)，因为所有的动物都对针刺有反应。即使是在测定之后8天，对照的反应性仍然受到损害，在20只大鼠中有11只至少有1次有反应，平均针刺得分为0.75(±0.18)。在该对照组中，没有一只大鼠能对3次针刺都表现出正常的反应。随时间发生的对照的针刺累计得分在图19中给出。由于在为期8天的时间内对所述动物进行了9次实验，在每一次实验中3次针刺所达到的最高得分为27。如曲线图所示，在实验时间内足底注射盐水或载体不能逆转紫杉醇诱导的缺陷。在该实验结束时对照的平均总的累计得分为5.10(±0.87)；它为要达到的最高得分的18.9％。
在第一次测定之后，足底注射75微升的23微克/毫升Enovin一次会导致在10只大鼠中有4只至少有一次有反应，平均针刺得分为0.70(±0.33)。在第8天，所有10只动物都至少有一次对针刺有反应，并且在10只大鼠中有5只出现了正常反应。在第8天时该组的平均针刺得分为2.20(±0.29)。与对照相比，在为期8天的测定结束时平均累计得分明显提高(Mann-Whitney U-实验，双尾，p＜0.01)，达到了平均针刺得分为14.50(±1.96)(图19)。这一结果为所述最高得分的53.7％。
另外，足底注射130微克/毫升Enovin相对对照而言具有改善了的效力。在注射130微克/毫升Enovin之后第一次测定时，10只大鼠中有6只至少一次有反应，平均针刺得分为1.10(±0.35)。在第8天，所有10只动物都至少一次对针刺作出反应，平均针刺得分为2.60(±0.22)。在10只大鼠中有8只对3次针刺都能作出正常反应。在该实验结束时，该组的平均累计总的针刺得分为17.20(±1.94)。这一结果为可能的总得分的63.7％，并且相对对照组有显著改善(p＜0.01)。
随时间预防紫杉醇诱导的传感缺陷方法使用体重为300-340克的雄性Sprague-Dawley大鼠。对所述动物进行单独圈养，让其自由摄取食物和水。在开始实验之前，将所述动物放入标准的观察笼中，在15分钟的适应期之后，评估针刺反射。为了达到这一目的，用针刺激所述动物右爪的足底表面，并以有(得分＝1)或无(得分＝0)统计对该针刺的反应。每一个时期内，重复以上过程3次，两个连续的针刺反应中时间间隔为1分钟；因此，所述针刺实验包括3次测定对针刺的反应。仅将在3次针刺中都具有正常反应的大鼠用于该实验(针刺得分＝3)。在进行所述对照测定之后，将这些动物随机分成小组(n＝10/组)，在右侧后脚的足底注射75微升的载体、盐水或23或130微克/毫升Enovin。由于在用载体和盐水处理的动物之间没有发现差别，将这两组合并(对照组)，连续3天每日给所述动物右侧后脚的足底注射50微升的紫杉醇(3毫克/毫升paclitaxel，溶解在cremophor和脱水醇加水中)。在紫杉醇处理之后第1、4、5和7天，在上午(上午8-9点)和下午(下午330-430)进行针刺实验。在第8天的上午进行最后一次针刺实验。对每一只动物来说，随时间测定对针刺反应的累计得分。由于总共9次针刺实验(每次包括3次针刺)是在紫杉醇处理之后进行的，在该实验的总时间之后所得到的最大得分为27。
结果在紫杉醇处理之前足底注射盐水或载体不能在针刺实验中抑制紫杉醇诱导的缺陷型。在使用紫杉醇之后的第一次检验时，在20只大鼠中有8只至少有一次对针刺有反应，平均针刺得分为0.60(±0.18)。在第8天，仍然存在紫杉醇诱导的缺陷，在20只动物中仅有8只有反应，平均得分为0.8(±0.25)。在2只动物上存在标准化的针刺反射。随着时间推移，累计的针刺得分也降低，得到的平均值为6.55(±1.08)，这一结果为最高得分的24.3％(图20)。
用23微克/毫升Enovin预处理能减弱紫杉醇诱导的针刺缺陷。在第1天，10只动物中有8只至少有一次有反应，并且平均针刺得分为1.70(±0.40)。在第8天，所有动物都有反应，平均得分为2.50(±0.27)。在这里，7只动物对所有的针刺处理表现出正常反应。就随时间累计的反应而言(图20)，平均总的得分相对对照水平明显改善(p＜0.01)，达到18.40(±1.73)，这一结果为最大值的68.1％。
在用130微克/毫升Enovin进行预处理之后获得了相当的结果。在这里，10只动物中有6只在第一次实验时有反应，平均针刺得分为1.70(±0.31)。在第8天，所有动物至少一次对针刺刺激有反应，平均得分为2.40(±0.22)，有一半的动物3次反应都正常。就累计得分而言，在第8天获得的平均得分为17.70(±1.92)，占总得分的65.5％。
该实验系列表明，单一一次足底注射Enovin能够减弱紫杉醇诱导传感缺陷，这一结果是通过针刺实验测定的。当在使用紫杉醇之前和之后使用药物时，观察到了活性。
Enovin是主要由外周和中枢神经成分、风湿性/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征的可能候选物，并能够在经表皮、外部、局部、中枢(如硬膜外、鞘内等)和系统使用之后在传感过程中起着调节作用。
另外，可以用Enovin作为诊断工具筛选在上述部位发生的生理病理学变化。
比较Enovin mRNA在正常和病变组织中的表达。
用ABI Prism7700序列检测系统(TaqMan；Perkin Elmer)，使用由英国的Pharmagene实验室有限公司(Royston)开发并完成的专利技术对Enovin mRNA的表达进行定量分析。该系统使用一种发生荧光的探针，以便在PCR期间产生序列专一性荧光信号。所述探针是连接了荧光标记和猝灭染料的寡核苷酸，它位于正向和反向PCR引物之间。在完整的情况下，所述荧光标记的强度被所述猝灭染料所抑制。如果所述探针构成复制复合体的一部分，所述荧光标记会被Taq聚合酶所固有的从5’到3’的外切核酸酶活性从所述猝灭剂上切除。在反应中，荧光标记信号的增强是PCR产物积累的直接证据。通过确定PCR产物最初被检测的分离PCR轮数(Ct)，确定mRNA靶序列的起始拷贝数(Cn)——荧光信号超过本底范围的点。通过比较实验Ct值和标准曲线确定每一种样品中靶mRNA的量。
RNA制备和质量控制用Tri-Zol试剂(生命技术，Gaithersburg，MD，美国)按照生产商提供的方法，从完整的和亚解剖的组织中分离总RNA。对所有RNA样品的质量控制方法包括评估完整性(完整的18S和28S核糖体RNA)以及确定高丰度(肌动蛋白)和低丰度(运铁蛋白受体)转录物的存在。
引物/探针设计设计一对引物和TaqMan探针，用于扩增来自Enovin的特殊序列引物15’ACGGTTCTCCAGGTGCTGT3’引物35’TGCTGCCGACCCACG3’探针55’CTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACG3’另外，设计一对引物和TaqMan探针，它们跨越一个内含子，并用于扩增人GAPDH基因的一部分引物25’CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT3’引物45’GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC3’探针65’TTTGGTCCGTATTGGGCGCCT3’探针5用荧光剂FAM标记，而探针6用荧光剂VIC标记。
总RNA的DNase处理对于实验的每一种组织来说，2.2ug总RNA在20微升体积的1×DNase缓冲液(Gibco BRL)中在室温下用2单位的无RNase的DNase(Gibco BRL)消化15分钟。通过添加2微升的25mM EDTA溶液终止所述反应。然后在65℃下温育所述样品10分钟，以便使所述酶失活。
第一条cDNA链的合成对于每一种实验的组织来说，用100ng总RNA作模板合成第一条cDNA链。在4毫升的体积中，在存在50nM引物1和2，1×PGR缓冲液II(Perkin Elmer)和5mM氯化镁的条件下，将所述RNA加热到72℃5分钟，并缓慢冷冻到55℃。在添加所有其他的试剂之后，将6毫升的反应物在48℃下培养30分钟，接下来的酶失活步骤是在90℃下进行5分钟。最后的反应条件如下1×PCR缓冲液II、5mM氯化镁、1mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP，12.5单位的MuLV逆转录酶(Gibco BRL)。
第一条cDNA链的PCR扩增源于每一种样品的100ng总RNA的cDNA在一次反应中进行PCR扩增，以便鉴定靶转录物和GAPDH转录物。靶的最终引物/探针浓度为300nM引物1,300nM引物3和200nM探针5，GAPDH为20nM引物2，20nM引物4和100nM探针6。该反应物中其他试剂的最终浓度为4.5％甘油，1×TaqMan缓冲液A(Perkin Elmer)，6.25mM氯化镁，430M dATP，dUTP，dGTP，dCTP，2.5单位的AmpliTaq Gold。所述PCR扩增是在ABI7700序列检测系统中完成的，最初的酶活化步骤是在94℃下进行12分钟，然后进行45轮次的94℃15秒，60℃1分钟(最低循环时间)。
检测的疾病和组织比较疾病患者和正常对照个体的组织中Enovin mRNA的表达(图25和26)。下面的表中给出了业已研究过的疾病及相关组织。对每一种疾病来说，分析了3个病变的样品和3个对照样品。
统计学分析对于每一组的3个组织来说，计算出Ct值(该值是正常分布的)的平均值和标准误差，然后根据公式Cn＝10((Ct-40.007)/-3.623)换算成Cn值。对所述Ct值进行误差分析(ANOVA)，再比较正常和病变组织的平均Enovin mRNA表达水平。
图25和26表示在病变和对照组织中平均Enovin mRNA拷贝数(±SD；n＝3)。统计分析表明，多发性硬化患者的室周白色物质中Enovin的表达水平明显提高(p＝0.013)。内部GAPDH对照没有表现出明显差别(p＝0.79)。尽管在正常组织的室周白色物质中Enovin的表达水平很低(平均为每100ng总RNA 270拷贝，而GAPDH为200000拷贝)，在多发性硬化患者体内的表达水平高出3倍(825)。
只有一种其他的病变组织表现出与正常对照有明显差别在乳腺管腺癌中，Enovin mRNA表达水平高出6倍(6000对1000；p＝0.007)，不过GADPH对照的值也明显提高(165000对44000，p＝0.03)，有可能体现了mRNA含量的一种普遍提高。
总之，我们发现在多发性硬化患者的室周白色物质中Enovin mRNA的含量得到上调。
用磷专一性抗体细胞基ELISA筛选GFRα3/cRET受体复合体上的Enovin模拟物。
该方法还可用于鉴定诸如GFRα1、GFRα2、GFRα4、TrkA、TrkB、和TrkC的其他神经营养因子受体的激活剂或拮抗剂。
实验使用该实验，通过测定在神经营养途径中活化的关键的信号激酶的激活或者通过测定cRET受体激酶的激活我们可以鉴定神经营养生长因子的激活或拮抗化合物。通过用磷专一性抗体检测磷酸化激酶或受体激酶的量确定所述激活。我们使用能瞬时或永久性表达TrkA、TrkB、、TrkC、GFRα1/cRET、GFRα2/cRET、GFRα3/cRET或GFRα4/cRET的NIH 3T3细胞。
用市售磷专一性抗体检测p42/p44 MAP激酶、PKB激酶、c-jun、CREB、JAN/SAPK激酶和其他激酶的激活。另外，可以用磷专一性cRET抗体消除cRET激活。
所使用的方法如下-NIH3T3细胞在96孔中在10％牛血清中铺板，在刺激之前细胞必须达到80％的连汇。
-次日，用无血清培养基更换培养基，并饥饿细胞18-24小时。
-在饥饿之后，用化合物和神经营养因子作正对照刺激细胞(神经营养因子的浓度为10ng/ml)。
-用由PBS制备的4％的甲醛在4℃下固定细胞20分钟。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗涤细胞5分钟，3次。
-用100微升由PBS配制的0.6％H2O2/0.1％Triton对细胞进行淬灭20分钟。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗涤细胞5分钟，3次。
-用100微升由PBS制备的10％的胎牛血清/0.1％Triton封闭细胞60分钟。
-在4℃下在50微升5％BSA/PBS/0.1％Triton中与磷专一性抗体一起培养所述细胞过夜。抗体稀释液根据实验加以确定，建议的范围是1∶100-1∶250。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗涤细胞5分钟，3次。
-在室温下在50微升5％BSA/PBS/0.1％Triton中与1∶100稀释的第二种交联HRP的抗体培养1小时。
-用200微升PBS/0.1％Triton洗涤细胞5分钟，3次。
-将1片OPD(Sigma)溶解在25毫升缓冲液(3.65克柠檬酸-H2O和5.9克磷酸氢二钠-2H2O，溶解在0.5升水中，pH5.6)，并添加12.5微升H2O2。向每一个孔中添加50微升，并在摇床上培养15分钟(200rpm)，用铝箔覆盖。
-用25微升硫酸终止反应。
-在ELISA读数仪上测定OD490-650。
小脑多巴胺能神经培养物神经培养物通过酶解和机械分散从大鼠胎儿的前侧小脑制备神经培养物。收集组织，并在冰镇的不含钙离子和镁离子的磷酸缓冲的盐溶液中洗涤，该溶液中含有0.6％葡萄糖(PBSG)，并与含有0.1％胰蛋白酶的PBSG一起在37℃下培养30分钟。以2.5 105细胞/平方厘米的密度将该细胞悬浮液铺平板到96孔NUNC组织培养平板上。事先，用聚-L-鸟氨酸和含有10％胎牛血清的CDM涂敷培养平板。在化学组成确定的培养基(CDM)中维持所述培养物，该培养基包括1∶1的Dulbecco’s改进的Eagles培养基和F12营养液的混合物，添加了葡萄糖(0.6％)，谷氨酰胺(2mM)，碳酸氢钠(3mM)，HEPES(5mM)，胰岛素(25微克/毫升)，人运铁蛋白(100微克/毫升)，腐胺(60微克/毫升)，硒酸钠(30nM)，链霉素(100微克/毫升)，和青霉素(100IU/毫升)。
用神经营养因子处理将神经营养因子溶解在0.5％的牛血清白蛋白中作为母液。在开始铺平板3小时之后以及在培养5天之后加入神经营养因子。将相同数量的0.5％的牛血清白蛋白加入对照孔中。
高亲和力多巴胺摄取在10天之后测定多巴胺的摄取。为了进行摄取，用预热的补充了葡萄糖(5mM)、抗坏血酸(100mM)、巴吉林(100mM)的PBS洗涤细胞2次，并与相同的溶液预培养10分钟。用含有50nM[3H]DA的相同的溶液更换所述预培养溶液，并在37℃下继续培养15周。通过用冰镇的PBS进行3次快速洗涤终止摄取。通过在室温下与酸化的乙醇培养30分钟释放积累的[3H]多巴胺。加入4毫升闪烁液(Packard ultima gold MV)之后，用Packard闪烁计数器测定放射性。通过添加20μM可卡因测定非专一性摄取。
表4.Enovin对[3H]多巴胺摄取的影响处理百分对照 n[3H]多巴胺摄取对照100 5Enovin 300ng/l 111 4Enovin 1000ng/l 127 5Enovin 2000ng/l 152 5Enovin 4000ng/l 161 1Enovin 10000ng/l165 2在有或没有Enovin的情况下让细胞生长10天。将未处理过的对照设定为100％。结果是在1-5个独立的实验中获得的。
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缩写表BLAST 基础局部排比检索工具bp 碱基对cDNA 互补DNACNS中枢神经系统EST表达序列标记EVNenovinGDNF 神经胶质细胞系衍生神经营养因子GFRα GDNF家族受体αGPI糖磷脂酰肌醇MTC多组织cDNANTNneurturinPCR聚合酶链反应PNS外周神经系统PSPpersephinRT-PCR 逆转录PCRTGF-β转化生长因子βFISH 荧光原位杂交MTN多组织northernNGF神经生长因子SPR表面胞质共振
权利要求
1.一种分离的核酸分子，编码被称为Enovin并且具有图1所示氨基酸序列的人神经营养生长因子，或编码所述生长因子的功能性等同物、衍生物或生物前体。
2.如权利要求1的核酸分子，它是DNA分子。
3.如权利要求1或2的核酸分子，它是cDNA分子。
4.如权利要求1-3中任一项的核酸分子，具有图1所示序列的从81到419位的核酸序列。
5.一种如权利要求1-5中任一项的分离的核酸分子，具有相当于图21所示序列的从5’-1到3’-1或3’-2或从5’-1或5’-2到3’-2或3’-3任一种被称为剪接变体的序列的核酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项的核酸分子，具有图1或21所示的核酸序列或能够在高严格条件下与它结合的序列。
7.一种能够在高严格条件下与权利要求1-6中任一项所限定的核酸分子杂交的反义分子。
8.一种由权利要求1-6中任一项所限定的核酸分子所编码的分离的人神经营养生长因子。
9.如权利要求8的生长因子，包括图1所示氨基酸序列的从27到159位的氨基酸序列或所述生长因子的功能等同物、衍生物或生物前体。
10.如权利要求8或9的生长因子，包括图1所示氨基酸序列或生长因子的功能等同物、衍生物或生物前体。
11.如权利要求8的生长因子，包括图23或24所示的氨基酸序列。
12.一种表达载体，包括权利要求2-6中任一项所述的DNA分子。
13.含有权利要求7的反义分子的表达载体。
14.如权利要求12或13的表达载体，还包括编码一种报导分子的核酸序列。
15.一种用权利要求12-14中任一项载体转化或转染过的宿主细胞。
16.如权利要求15的宿主细胞，所述细胞是真核细胞或细菌细胞。
17.一种转基因细胞、组织或生物，它包括能够表达权利要求8-11中任一项的神经营养因子enovin的转基因。
18.如权利要求17的转基因细胞、组织或生物，其中，所述转基因包括权利要求12或14中任一项所述的载体。
19.一种由权利要求15至18中任一项的细胞表达的神经营养生长因子或其功能性等同物、衍生物或生物前体。
20.一种由权利要求17或18的转基因细胞、组织或生物表达的神经营养生长因子或其功能性等同物、衍生物或生物前体。
21.权利要求1-6中任一项的核酸分子用于生产用来治疗或预防患者的神经疾病的药物的用途。
22.如权利要求21的用途，其中，所述神经疾病选自下列一组中的任一种帕金森病、阿尔采默病、与扩增的谷氨酰胺序列相关的神经疾病，如亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、外周神经创伤、由神经毒素造成的损伤、多发性内分泌腺瘤形成、家族性先天性巨结肠、朊病毒相关疾病、Creutzfeld-Jacob病、中风、主要由外周性或中枢神经发生成分、风湿病/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征。
23.将权利要求8-11中任一项的神经营养生长因子用于生产用来治疗或预防神经疾病的药物的用途。
24.如权利要求22的用途，其中，所述神经疾病选自下列一组中的任一种帕金森病、阿尔采默病、与扩增的谷氨酰胺序列相关的神经疾病，如亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、外周神经创伤、由神经毒素造成的损伤、多发性内分泌腺瘤形成、家族性先天性巨结肠、朊病毒相关疾病、Creutzfeld-Jacob病、中风、主要由外周性或中枢神经发生成分、风湿病/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征。
25.一种药物组合物，包括权利要求1-6中任一项的核酸分子及其药理学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。
26.一种药物组合物，包括权利要求8-11中任一项的生长因子及其药理学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。
27.将权利要求7的反义分子用于生产用来治疗或预防由enovin超量表达或活性过高所介导的神经疾病的药物的用途。
28.如权利要求27的用途，所述神经疾病选自下列一组中的任一种帕金森病、阿尔采默病、与扩增的谷氨酰胺序列相关的神经疾病，如亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、外周神经创伤、由神经毒素造成的损伤、多发性内分泌腺瘤形成、家族性先天性巨结肠、朊病毒相关疾病、Creutzfeld-Jacob病、中风、主要由外周性或中枢神经发生成分、风湿病/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征。
29.一种能够结合在权利要求8-11中任一项的生长因子或其表位上的抗体。
30.一种检测样品中生长因子存在的方法，该方法包括让 29的抗体与所述样品反应，并检测所述抗体与所述生长因子的任何结合。
31.如权利要求30的方法，其中，所述抗体与一种报导分子接合。
32.一种用于检测样品中神经营养生长因子的存在的试剂盒或装置，它包括权利要求29的抗体和用于让所述抗体与所述样品反应的方法。
33.一种鉴定人神经营养生长因子的激活剂或拮抗剂的方法，所述方法包括让能表达所述生长因子的受体的细胞组织或生物与一种候选化合物在存在所述生长因子的条件下接触，并比较在所述细胞、组织或生物中以及在对照中RET激活的水平，所述对照没有接触过所述候选化合物。
34.一种鉴定神经营养生长因子的激活剂或拮抗剂的方法，所述方法包括让能表达所述生长因子和cRET的合适的受体的细胞组织或生物与一种候选化合物在存在所述生长因子的条件下接触，测定所述合适的受体作为其一种成分的信号传导途径中的一种信号激酶的活化水平，然后添加对所述信号激酶专一的、与一种报导分子接合的抗体，与没有接触过所述化合物的细胞组织或生物进行比较。
35.如权利要求33或34的方法，其中，所述神经营养生长因子是enovin。
36.如权利要求33-35中任一项的方法，其中，所述细胞组织或生物是NIH 3T3细胞。
37.如权利要求34-36中任一项的方法，其中，所述受体是GFRα1、GFRα2、GFRα3或GFRα4中的任一种。
38.如权利要求34-37中任一项的方法，其中，所述抗体是对p42/p44 MAP激酶、PKB激酶、c-jun、CREB、JNK/SAPIC任一项专一的。
39.一种按照权利要求33-38中任一项的方法鉴定为激活剂或拮抗剂的化合物。
40.将如权利要求39的被鉴定为拮抗剂的任一种化合物或如权利要求1-7中任一项的核酸分子或如权利要求8-11中任一项的神经营养生长因子用于生产用来治疗或预防由人神经营养生长因子表达或活性介导的疾病的药物的用途。
41.将如权利要求39的被鉴定为激活剂的任一种化合物或如权利要求1-7中任一项的核酸分子或如权利要求8-11中任一项的生长因子用于生产用来治疗或预防由人神经营养生长因子的失活介导的疾病的药物的用途。
42.将如权利要求39的被鉴定为激活剂的任一种化合物或如权利要求1-7中任一项的核酸分子或如权利要求8-11中任一项的生长因子用于生产用来治疗由受伤的或受损的胃肠道转运所介导的胃肠道疾病的药物的用途。
43.如权利要求42的用途，其中，所述疾病或症状包括下列疾病中的任一种胃食管回流、消化不良、胃轻瘫、手术后肠闭塞、和假性肠梗阻、小肠或大肠蠕动减弱和/或胃排空推迟、便秘、肠无力、手术后肠无力、过敏性腹部综合征(IBS)、药物诱导的转运延迟、呕吐和细胞毒性药物和辐射诱导的呕吐。
44.将如权利要求39的被鉴定为拮抗剂的任一种化合物或如权利要求1-7中任一项的核酸分子或如权利要求8-11中任一项的生长因子用于生产用来治疗由胃肠蠕动加强介导的胃肠道疾病或症状的药物的用途。
45.如权利要求44的用途，其中，所述疾病包括任一种腹泻，包括分泌性腹泻、细菌诱导的腹泻、胆性腹泻、旅行者腹泻和精神性腹泻、Crohns病、痉挛性结肠、过敏性腹部综合征(IBS)、腹泻流行性过敏性腹部综合征、腹部过敏和与胃肠道过敏相关的痛苦的减弱。
46.一种药物组合物，包括权利要求39的化合物及其药理学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。
47.一种用于生产用来治疗与人神经营养生长因子相关的疾病的药用制剂的方法，该方法包括选择一种按照权利要求33或34的方法鉴定为激活剂或拮抗剂的候选化合物，批量生产所述化合物，并将所生产的化合物配制到药理学上可以接受的载体中。
48.如权利要求47的方法，其中，所述生长因子是enovin。
49.一种药物组合物，包括权利要求29的抗体及其药理学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂。
50.一种分离的人神经营养生长因子，包括一种多肽，该多肽与图1、21、23或24所示的氨基酸酸序列具有至少85％的序列相同性。
51.由LMBP保存的保藏号为LMBP3931的质粒EVNmat/pRSETB。
52.将权利要求39的化合物用于生产用来治疗选自下列一组的任一种疾病的药物的用途帕金森病、阿尔采默病、与扩增的谷氨酰胺序列相关的神经疾病，如亨廷顿病、外周神经病、急性脑损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、外周神经创伤、由神经毒素造成的损伤、多发性内分泌腺瘤形成、家族性先天性巨结肠、朊病毒相关疾病、Creutzfeld-Jacob病、中风、主要由外周性或中枢神经发生成分、风湿病/炎性疾病以及传导紊乱造成的痛苦综合征。
全文摘要
披露了一种分离的核酸分子,它编码被称为enovin、并具有图1、21、23或24所示的氨基酸序列的人神经营养生长因子,或者编码所述生长因子的功能性等同物、衍生物或生物前体。所述生长因子优选包括图1所示序列的从27到139号位置的氨基酸序列,或其功能性等同物、衍生物或生物前体。通过将编码enovin的核酸分子包含在合适的载体中,可将其用于转化宿主细胞、组织或生物。宿主细胞、组织或有机体以及载体也是本发明的组成部分。
文档编号G01N33/68GK1342165SQ99810884
公开日2002年3月27日 申请日期1999年7月14日 优先权日1998年7月14日
发明者H·A·G·格尔茨, S·L·J·马素雷, T·F·梅尔特, M·奇克, L·A·L·维尔东克 申请人:詹森药业有限公司