一条与牛病毒性腹泻病毒e2蛋白相结合的多肽序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，主要涉及牛病毒性腹泻病毒E2结合多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea, BVD)是引发牛病毒性腹泻的主要 病原。它主要会引起牛腹泻、持续性感染以及流产等症状，该病毒在全球范围内广泛流行， 给养牛产业造成巨大损失。BVD属于黄病毒科瘟病毒属，为单股正链RNA病毒。E2位于BVDV ORF 2077-3198位；该蛋白有374个氨基酸组成，有5个非常保守的糖基化位点。E2是病毒 的结构蛋白，会形成表面突起。在BVDV的结构蛋白中，E2蛋白的免疫原性最强，是BVDV的 最主要抗原性部位，同时也是与抗BVDV抗体的结合区域，还能介导免疫中和反应，参与宿 主细胞识别和吸附。
[0003] 噬菌体展示技术是当前研宄多肽与蛋白质作用的一种有效手段。这一技术将多肽 的编码序列克隆到噬菌体壳蛋白的合适位置，并且要保证其正确的翻译序列，也不影响噬 菌体壳蛋白的正常功能，这样噬菌体表达的壳蛋白结构中将会存在外源多肽的序列；伴随 着噬菌体子代的重新组装，外源多肽序列将展示在噬菌体的表面。在一般情况下，外源展示 的多肽具备一定的空间结构和生物活性，可以与相应的靶分子进行结合。展示肽库与靶蛋 白分子结合后，洗去未结合的噬菌体，然后将与靶分子结合的噬菌体洗脱下来感染细胞扩 增，经过3到6轮的"吸附-洗脱-扩增"，噬菌体与靶分子的结合特异性将逐步提高；经过 多次筛选之后，最终可以筛选到与靶分子相结合的高亲和噬菌体。
【发明内容】
[0004] 本发明借助噬菌体肽库展示技术，利用表达纯化的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白进 行多轮筛选，最终得到可特异结合牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多肽克隆株，挑选其克隆株 进行序列测定，其多肽序列为KRLREL ;人工合成此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，人 工合成的多肽可与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白有良好的结合能力。借助本发明的多肽，可用 于对牛病毒性腹泻病毒抗原进行定量和定性检测。
[0005] 本发明的技术方案： 一条可与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白结合的多肽序列为KRLREL。
[0006] 所述多肽序列为线性结合多肽。
[0007] 所述的多肽序列，包括以所述的多肽序列为核心，任何对此多肽序列的延长和修 饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定蛋白质。
[0008] 将所述多肽序列用于牛病毒性腹泻病毒或者猪瘟病毒的E2蛋白，其中包括但不 局限于酶联免疫反应检测。
[0009] 所述的多肽序列在用于对牛病毒性腹泻病毒抗原进行定量和定性检测中的应用。
[0010] 本发明的积极有益效果： (1)本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白进行 多轮筛选，最终得到可特异结合牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多肽克隆株。挑选其克隆株进 行序列测定，其多肽的核心序列为KRLREL ;人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明， 此人工合成的多肽可与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白很好结合。本发明多肽与E2蛋白的亲和 力常数可达3· 26X 109L/mol，亲和力较好。
[0011] (2)由于病毒难以纯化，因此针对病毒的抗体获得非常不易，本发明设计合成的多 肽很好地规避了这一难题，可用人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。
[0012] (3)本发明的人工合成多肽与人工接种BVD、人工表达BVD E2蛋白均可以结合，而 且与其它病毒蛋白均不反应，特异性较高。
[0013] (4)本方法较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过 对多肽进行标记，可快速地对牛病毒性腹泻病毒E2蛋白进行定性和定量检测。
【附图说明】
[0014] 图1 :利用多肽测定培养牛病毒性腹泻病毒、表达蛋白的结果。
[0015] 图中横坐标上，1为牛病毒性腹泻病毒接种MDBK细胞，2为表达牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白，3为MDBK细胞对照；纵坐标为OD值。
[0016] 图2 :利用本发明的多肽与其它病毒交叉反应的结果。
[0017] 图中横坐标为不同包被ELISA板细胞培养物的不同待检病毒；纵坐标为OD值。
【具体实施方式】
[0018] 实例1噬菌体随机肽库的筛选 用纯化表达的BVD E2蛋白包被聚氯乙烯板，每孔100 μ 1(100 μ I /ml)包被，置于4°C 条件下过夜，用PBST洗涤后再用5%的BSA液封闭。
[0019] 将稀释后的噬菌体肽库100 μ 1加入到相应的孔中，室温条件下孵肓2h，用TBST液 冲洗8-10次，每孔加入洗脱液200 μ 1，室温条件下振荡5-8min，吸出洗脱液并中和至中性。
[0020] 中和后的洗脱液可以用于滴度测定和下一轮培养；将LB培养后的噬菌体进行离 心收集，用于下一轮的筛选。
[0021] 不同筛选轮次的噬菌体富集鉴定见表1，洗脱液的滴度测定结果见表2。
[0022] 实例2筛选多肽的鉴定 (1)将接种的牛病毒性腹泻病毒的MDBK细胞培养液进行超声破碎，然后以2 μ g/ml (蛋 白量计）进行ELISA板包被；以同样方式将人工表达的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和未接种 病毒的MDBK做对照进行包被。在进行特异性试验时，将不同病毒蛋白进行包被。
[0023] (2)将人工合成的多肽KRLREL偶联辣根过氧化物酶，以100ng/ml的量，每孔加入 到上述ELISA板中50μ1，震荡器上混匀，37°C条件下避光孵育30min ; (3) 用酶标板洗板机洗6次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各 孔，再甩干，如此重复洗涤6次； (4) 根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100 μ 1，在酶标板震荡器上震 荡30秒，室温（23±3°C) 10分钟充分显色； (5) 每孔加入50 μ I 2M的硫酸液终止反应，在酶标板震荡器上震荡30秒，然后用酶标 仪读取各孔在450纳米处的吸光值，判定结果。
[0024] 结果表明，人工合成多肽与人工接种BVD、人工表达BVD E2蛋白均可以结合(见图 1)，除与猪瘟病毒的交叉反应比较高外，与其它病毒蛋白均不反应，其特异性较高(见图2)。
[0025] 表1每轮亲和筛选中噬菌体的量
【主权项】
1. 一条可与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白结合的多肽序列，其特征是，所述多肽序列为 KRLREL〇
2. 根据权利要求1所述的多肽序列，其特征是，所述多肽序列为线性结合多肽。
3. 根据权利要求1所述的多肽序列，其特征是，其中包括以所述的多肽序列为核心， 任何对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生 物素及特定蛋白质。
4. 根据权利要求1所述的多肽序列，其特征是，将所述多肽序列用于牛病毒性腹泻病 毒或者猪瘟病毒的E2蛋白，其中包括但不局限于酶联免疫反应检测。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的多肽序列在用于对牛病毒性腹泻病毒抗原进行定 量和定性检测中的应用。
【专利摘要】本发明主要涉及牛病毒性腹泻病毒E2结合多肽及其应用，该多肽序列为KRLREL，是一种线性结合多肽，以多肽序列为核心，可以对此多肽序列的延长和修饰，修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定蛋白质。本发明借助噬菌体肽库筛选技术，利用表达纯化的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白进行多轮筛选，最终得到可特异结合牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多肽克隆株；挑选其克隆株进行序列测定，其多肽的核心序列为KRLREL；人工合此多肽进行ELISA结合实验，结果证明，此合成多肽能与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白很好的结合；本发明较人工表达蛋白再进行免疫获得蛋白抗体的过程简便，更易操作；通过对多肽进行标记，可快速地生产试剂盒或试纸条（卡）对牛病毒性腹泻病毒E2蛋白进行定量和定性检测。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104597256
【申请号】CN201510078014
【发明人】王方雨, 邓瑞广, 邢广旭, 罗俊, 胡骁飞, 赵东, 余秋颖
【申请人】河南省农业科学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月14日