一种制备可物理再生蛋白质芯片的方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种利用阵列化微小毛细空间固定蛋白质溶液和微纳磁珠或量子点制备可物理再生蛋白质芯片的方法。
技术背景:
[0002]蛋白质是生命体特有的活性物质，它们既作为结构单元构筑生命体，又作为功能单元执行生命活动。许多蛋白质可以与另外一些蛋白质或基因片段等特异性结合，如抗体与抗原的结合、配体与受体的结合、酶与底物的结合等。利用蛋白质之间这种特异性结合可以实现对细菌、病毒等有害物质的检测，蛋白质芯片就是在此背景下诞生的一种快速高效的检测手段。蛋白质芯片是生物芯片的一种，它与另一大类基因芯片的最大区别是需要具备保持蛋白质活性的能力，蛋白质离开水就会失去活性。
[0003]将特定蛋白质固定到芯片基板可以使用共价结合的化学方法，也可以使用非共价结合的物理方法。有报道认为，可以将组氨酸标记的蛋白质固定到镍氨三乙酸处理过的盖玻片上(ZhuH,BilginM,Bangham R,et al.Global Analysis ofProtein Activities UsingProteome Chips.Science2001 ；293(5537):2101-05)，但是结合不够稳定，容易受到化学品如盐类的干扰，而且芯片必须保存在高湿度的密封容器中。也有通过对纯化制备蛋白质用的凝胶进行化学修饰处理的办法，将蛋白质以化学结合方式固定在富含水分的凝胶中，该方法较好地解决了蛋白质活性保持的问题，但是芯片仍为一次性使用，成本较高。
[0004]采用物理方法将蛋白质固定到芯片基板，理论上讲具有制作成本低和芯片容易再生复用，但是如何固定牢固并保持蛋白质活性是这种方法需要解决的关键问题。单就物理固定方法而言，电场、磁场等技术复杂且芯片不透明，给后续检测造成很大困难；直接将蛋白质点入凝胶简便易行，不足之处是存在蛋白质扩散会使阵点扩大、浓度降低，还可能使阵点相连；在基板上打孔的办法也是可行的，但是微孔加工成本高，质量也难以保证。
【发明内容】
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[0005]该发明要解决的关键问题是将蛋白质溶液或者将固定在微小磁珠或量子点上的蛋白质连同水，通过物理方法固定在芯片基板上，形成实用的蛋白质芯片。为解决上述技术问题，本发明首先通过刻蚀办法在单晶硅片上制备出每个阵点具有筒状结构的阴模；然后采用可硬化透明材料填充阴模即可将阴模上的筒形结构转变为表面突出的筒；这些呈阵列分布的微小的筒作为蛋白质溶液的容器，筒内壁经过亲水处理，可以较好地固定蛋白质溶液并保持其生物活性；在微筒的侧面有狭窄的缝隙，一方面在吸取蛋白液时起到排气的作用，另一方面在检测时起到增大与环境液体或气体接触面的作用。
【附图说明】
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[0006]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明。
[0007]图1是单筒式阵列阴模三维透视图。
[0008]图2是多筒式阵列阴模三维透视图。
[0009]图3是芯片一级阵列和二级阵列示意图。
[0010]图4是单筒式蛋白质芯片三维效果图。
[0011]图5是多筒式蛋白质芯片三维效果图。
【具体实施方式】
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[0012]第一步是设计阵列及花样设计。
[0013]首先是根据使用需求和制造工艺设计单个阵点对应筒的结构。筒的结构设计为柱形，优选为圆柱形设计，以避免拐角处应力集中。筒外径10-100微米，高度10-100微米，筒壁厚3-10微米；每个筒侧面开有1-4条狭缝，狭缝宽度1-5微米。筒可以是单筒，也可以是厚3-10微米肋片分割成的复合筒。
[0014]图1和图2分别对应单筒和多筒两种优选设计实例。对于图1所示单筒结构，筒外径50微米，壁厚5微米，筒深30微米，筒壁有一条狭缝，狭缝宽2微米。图2对应多筒结构，一个圆柱形筒被内部十字形肋片分割为四个近似三棱柱形筒，每个小筒向外的侧面有一条狭缝；圆柱外径50微米，壁厚5微米，肋片厚5微米，筒高30微米，狭缝宽2微米。
[0015]接下来设计筒阵列。考虑到显微检测的方便性、检测结果的重复性以及检测的种类，阵列可以从2X2到1X 10甚至更多。由筒组成的一级阵列还可以作为复合阵点构建更大的二级阵列。
[0016]图3是一个付诸制造的阵列设计实例:一级阵列为5X5，阵列周期为100微米；二级阵列也是5 X 5，阵列周期为I毫米；单张芯片尺寸为1X 10毫米。
[0017]第二步是根据以上设计制作光刻掩模，可委托专业服务机构完成。
[0018]第三步是利用掩模在单晶硅片上进行光刻制作阴模，也由专业服务机构完成。
[0019]第四步是翻模制作蛋白质芯片基板。将单晶硅阴模固定在耐热容器底部，阵列花样朝上；根据容器大小和芯片厚度1-5毫米注入适量可硬化有机透明液体；真空脱气；在干燥箱中烘干硬化；将弹性基板从单晶硅阴模上揭下。作为实例，选用聚二甲基硅氧烷商品，按说明书将两组份混合，用量按照芯片厚度为I毫米计算，容器为石英培养皿，真空度取0.01兆帕，脱气时间I小时，烘干温度80度，烘干时间5小时。图4和图5分别为依照以上两个设计实例翻模制备的蛋白质芯片基板三维效果图。
[0020]第五步是加载蛋白液。可以采用气压、液压、电泳或直接毛细吸附等多种办法实现。
[0021]作为一个实例，采用已申请专利的实时定量检测毛细管电泳蛋白质芯片制备装置(申请号201210539488.6)，该装置可以采用电泳工作方式或气压方式通过石英毛细管精确加载，根据芯片阵点筒大小选取内径25-100微米毛细管，对于以上两个设计实例，选用内径50微米毛细管，10干伏电压,持续I秒。
[0022]另一实例是将固定在直径20微米磁珠或量子点上的蛋白质溶液涂敷在亲水的盖玻片表面，厚度5-20微米；将图5型芯片基板的阵列花样面向下压在盖玻片表面，基板变形量5-10微米，保持I秒钟即可。该实例中，一方面，蛋白液通过毛细作用进入阵列筒；另一方面，量子点或磁珠的直径稍大于阵列筒的内径，下压芯片基板时借助基板弹性被强制嵌入筒内，这种空间卡位办法起到加强蛋白固定的作用。
[0023]第六步是蛋白质芯片的物理再生处理。采用超生波清洗机，先加入去离子水和洗涤剂清洗1-2遍，再用干净去离子水清洗2-3遍，置于烘干箱70-90度烘干0.5-3小时即可。
【主权项】
1.一种制备可物理再生蛋白质芯片的方法，包括硅片光刻制备模板、透明有机物聚合硬化翻模制备芯片基板、蛋白质溶液加载形成芯片等步骤，其特征在于:光刻模板为阴模，经过翻模制备的蛋白质芯片基板上的阵点为突出基板表面的柱形微筒，微筒外径10-100微米，高度10-100微米，筒壁厚3-10微米。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:在柱形筒内部添加厚度3-10微米肋片，使一个阵点上的一个筒变为包含数个小筒的复合筒。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:在每个筒的侧面开有1-4条宽度1-5微米的狭缝，在加载蛋白质溶液时作为排气通道。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:蛋白质溶液通过毛细管电泳或毛细吸入加载到阵点上的微筒内，蛋白质溶液的溶剂起到保持蛋白质活性的作用。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于:通过压力将固定在直径稍大于微筒内径的磁珠或量子点上的蛋白质连同其结合的溶剂一起压入微筒，微筒借助空间卡位将磁珠或量子点连同蛋白质和溶剂固定。
6.按照权利要求4、权利要求5所述的制备方法，其特征在于:由于蛋白液借助物理方法被固定在芯片阵点上的微筒中，在芯片使用完毕后，可以使用超声波清洗等物理方法清除蛋白质溶液、磁珠或量子点，实现芯片的物理再生和循环使用。
【专利摘要】发明“一种制备可物理再生蛋白质芯片的方法”涉及采用毛细吸附和空间卡位的方法将蛋白质溶液固定到阵列化微筒中的技术方法，旨在解决芯片难以保持蛋白质活性和一次性使用成本高的问题。该方法先利用硅片光刻技术制作阴模；之后将可聚合有机物液体涂敷在阴模表面，经真空脱气和加热聚合硬化，将透明弹性蛋白质芯片基板从阴模上揭下，得到具有一级或两级阵列的、每个一级阵点一筒或一点多筒的阵列；利用毛细管电泳三维点样技术或者压力接触将蛋白质溶液加载到微筒内，最终获得蛋白质芯片。微筒侧面设计有狭缝，在下压时起到排气通道的作用。该微筒储液型蛋白质芯片在使用完毕后可通过超声波清洗和干燥处理等物理方法再生，实现循环使用。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104749373
【申请号】CN201310739794
【发明人】仓怀兴, 张力, 段秉亚, 马建华
【申请人】中国科学院生物物理研究所
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月30日