一种盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物分析检测技术领域，特别是一种黄酮类药物含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸黄酮哌醋（3-甲基黄酮-8-羧酸乙哌啶基醋盐酸盐，Flavoxate hydrochloride，FX)属于黄酮类化合物，是一种平滑肌松弛药，对泌尿生殖系统的平滑肌有 选择性的解痉作用，临床上以片剂或胶囊的形式用于治疗各种下尿路感染或梗阻性疾病， 可以消除尿频、尿急、尿失禁及尿道膀胱平滑肌痉挛引起的下腹部疼痛。药代动力学研宄表 明，FX在静脉给药或口服给药时，在体内迅速吸收并代谢成3-甲基黄酮-8-羧酸（MFA)，从 尿中排出。定量分析FX及其代谢产物MFA在药剂、血液、尿液等样品中的方法有很多种，包 括紫外分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光分析法和膜电位法等。其中对于 盐酸黄酮哌酯片剂比较普遍的分析方法是2010版药典紫外分光光度法，将药物片剂研磨 后用盐酸溶液溶解，利用紫外-可见分光光度法测定293 nm波长下的吸光度，对照标品计 算出药物含量。由于盐酸黄酮哌酯在此波长下的紫外吸收强度弱，因此该方法所需药物浓 度为20 μ g/mL，药物样品消耗量大。而高效液相色谱法，分析检测速度慢，药品及溶剂消耗 量大。
[0003] 荧光分析法具有灵敏度高、分析速度快、手续简便和环境友好等优点，在药物分析 中的应用已有不少研宄报道。但是，黄酮类化合物的内源荧光普遍不强，有应用价值的荧光 分析方法不多。2015年，埃及人Zaazaa等报道了尿液中FX代谢产物MFA的荧光分析方法， 并用于泌尿灵片剂中FX的测定。此方法将FX在碱性条件下水解，然后用HCl调节pH至 中性，蒸干溶液，再用甲醇溶解残留物后测定荧光，MFA甲醇溶液的荧光峰位于人 x/ <m= 338 / 390 nm。由于MFA本身荧光强度较弱，表面活性剂也不能敏化该化合物，因此MFA甲 醇溶液的测试浓度是4 μ g/mL，且测定灵敏度不高。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种盐酸黄酮哌酯的荧 光测定方法，将盐酸黄酮哌酯在碱性条件下水解，利用荧光法测定其含量，具有灵敏度高、 操作简便的特点。
[0005] 本发明所述技术问题是以下述技术方案实现的： 一种盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，所述方法包括如下步骤： a、 制备样品溶液 将盐酸黄酮哌酯片研碎用甲醇浸泡，提取上清液，用甲醇稀释成样品溶液，所述样品溶 液的浓度为〇· 05 - 0· 01mg/ml ; b、 绘制标准曲线 配制不同浓度的FX标准溶液，标准溶液的浓度范围为0. 020-0. 500 μ g/mL ;将FX标 准溶液在强碱性环境下沸水浴加热，冷却后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量/ 2em= 302 / 410 nm的荧光强度心，以荧光强度值盐酸黄酮哌酯的浓度cf乍标准工作 曲线，得出两者的回归方程； c、测定样品浓度 将步骤a制得的样品溶液用去离子水稀释至浓度为0. 1-1. 0 μ g/mL，将稀释后的样品 溶液中在强碱性环境下沸水浴中加热，冷却后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量 / Jem= 302 / 410 nm的荧光强度为心，利用回归方程计算盐酸黄酮哌酯片样品溶液中FX 的浓度。
[0006] 上述盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，步骤b和步骤C中所述强碱性环境为在溶液 中加入2. 0 mL L 0 mol/L的NaOH溶液，溶液的pH值大于13. 0。
[0007] 上述盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，所述沸水浴中加热的时间为大于等于2小 时。
[0008] 上述盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，步骤b和步骤c中沸水浴加热的溶液经冷却 至室温后测定焚光光谱。
[0009] 上述盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，步骤c中所述稀释后样品溶液中的甲醇含量 ^ 10% 〇
[0010] 本发明利用FX在强碱性水溶液中有荧光增强现象，加热可加速荧光物质产生的 原理，通过测定MFA分子吡喃酮环分解后所形成产物的荧光，用标准曲线法计算得出FX 的浓度，解决了 FX和MFA化合物自身荧光较弱，表面活性剂也不能使其产生敏化荧光的问 题。利用荧光分析方法测定盐酸黄酮哌酯片中的FX含量，灵敏度高，分析速度快，测试条件 简便，环境友好。与Zaazaa等人报道的荧光分析法相比，本发明的检出限为I. Ing/mL，灵敏 度约高70倍。其报道的荧光分析法为先将片剂样品在I. 0 mol/L NaOH溶液中水解3h，然 后用HCl调节pH至中性，蒸干溶液，再用甲醇溶解残渣后测量荧光；而本法为样品经甲醇溶 剂提取后在强碱性水溶液中沸水浴加热2 h，冷却至室温后测量荧光即可，操作简便、省时， 同时在水溶液中测定较甲醇溶液中测定环境友好。反应体系在沸水浴中加热可加速裂解反 应的进行，缩短反应时间。与药典记载的紫外分光光度法比较，紫外分光光度法所需药物浓 度为2 μ g/mL，本法分析所需药物是它的十分之一，用药量大大减少。检测结果与对照药典 所记载紫外分光光度法一致，因此所述测定方法准确可靠。 toon] 由于黄酮类化合物的r-吡喃酮环碱分解反应具有普遍性，而且反应所产生的酚 酸类化合物很可能具有荧光，因此，本方法也可适用于其他黄酮类化合物的荧光分析。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明标准曲线法的荧光光谱谱图（人x = 302 nm，Jeni = 410nm); 图2是本发明采用标准曲线法绘制的荧光强度值与盐酸黄酮哌酯浓度的标准工作曲 线； 图3是本发明采用标准加入法绘制的荧光强度值与盐酸黄酮哌酯浓度的标准工作曲 线； 图4是本发明荧光反应中溶液的pH值与荧光强度的关系图； 图5是本发明荧光反应中溶液加热时间与荧光强度的关系图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0014] 本发明盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法包括如下步骤： 步骤a、样品溶液的制备 将盐酸黄酮哌酯片研碎用甲醇浸泡12小时以上，提取上清液置于容量瓶中，用甲醇稀 释成样品溶液，配制的盐酸黄酮哌酯片样品溶液浓度为0.10 - 〇.〇lmg/ml。所述甲醇为色 谱纯的甲醇溶液。
[0015] 步骤b、绘制标准曲线 将分析纯的盐酸黄酮哌酯用甲醇溶解并稀释成不同浓度的标品溶液，标品溶液的浓度 范围1-10 μ g/mL，在一系列IOml容量瓶中，分别加入一定体积的标品溶液，用于配制浓度 成梯度的一系列标准溶液，使定容后的标准溶液浓度范围为〇. 020-0. 500 μ g/mL，并且标准 溶液中甲醇的体积百分含量应小于10%。然后在每个容量瓶中加入2.0 mL 1.0 mol/L的 NaOH溶液，加去离子水至约7 mL。将一系列容量瓶放置在沸水浴中加热2 h，冷却至室温，以 去离子水定容并摇匀，使用荧光分光光度计扫描荧光光谱(测量<x/ Im= 302 / 410 nm 的荧光强度)，并绘制以盐酸黄酮哌酯的浓度为横坐标、荧光强度值为纵坐标的标准曲线， 在0. 020-0. 500 μ g/mL范围内，得到荧光强度厶和盐酸黄酮哌酯的浓度c的回归方程。
[0016] 步骤c、测定样品浓度 取步骤a制成的样品溶液，用甲醇定容至浓度约为10 μ g/mL，取一定体积稀释后的 样品溶液加入IOml容量瓶中，使定容后的盐酸黄酮哌酯片剂样品溶液浓度cs范围在 0. 1-1.0 μ g/mL，在容量瓶中加入2.0 mL 1.0 mol/L的NaOH溶液，加水至约7 mL，在沸水浴 中加热2 h，冷却至室温，以水定容并摇匀。溶液经步骤b所用荧光分光光度计扫描荧光光 谱，测量』ex/ Jem= 302 / 410 nm的荧光强度心。用步骤b得到的线性回归方程计算盐 酸黄酮哌酯片剂样品溶液中的FX浓度。 FX荧光增强反应的机理为，FX在强碱性条件下首先发生酯键水解反应生成MFA，在碱 性条件下，MFA羧基质子电离为阴离子，MFA的吡喃酮碳氧键在强碱加热条件下发生开 环反应得到包含邻羟基苯甲酸结构的荧光化合物(苯环上的羧基与邻位羟基构成了邻羟基 苯甲酸即水杨酸结构)，在碱性条件下由于羧基质子的电离使羧基氧与邻羟基之间可形成 氢键，分子的共轭程度增加，刚性增强，因而产生荧光。FX碱液加热后再经酸化得到MFA，而 不是〃，不饱和酮，说明r-吡喃酮的碳氧键开环反应是可逆的。上述荧光增强反应 的反应式如下：
【主权项】
1. 一种盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： a、 制备样品溶液 将盐酸黄酮哌酯片研碎用甲醇浸泡，提取上清液，用甲醇稀释成样品溶液，所述样品溶 液的浓度为〇? 05 - 0?Olmg/ml; b、 绘制标准曲线 配制不同浓度的FX标准溶液，标准溶液的浓度范围为0. 020-0. 500yg/mL;将FX标 准溶液在强碱性环境下沸水浴加热，冷却后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量^x/ Jem= 302 / 410nm的荧光强度4以荧光强度值0盐酸黄酮哌酯的浓度cf乍标准工作 曲线，得出两者的回归方程； c、 测定样品浓度 将步骤a制得的样品溶液用去离子水稀释至浓度为0. 1-1. 0yg/mL，将稀释后的样 品溶液中在强碱性环境下沸水浴中加热，冷却后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量 <x/人_"= 302 / 410nm的荧光强度为4利用回归方程计算盐酸黄酮哌酯片样品溶液中 FX的浓度。
2. 根据权利要求1所述的盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，其特征在于，步骤b和步骤c 中所述强碱性环境为在溶液中加入2.0mL1.0mol/L的NaOH溶液，溶液的pH值大于13.0。
3. 根据权利要求2所述的盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，其特征在于，所述沸水浴中 加热的时间为大于等于2小时。
4. 根据权利要求3所述的盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，其特征在于，步骤b和步骤c 中沸水浴加热的溶液经冷却至室温后测定荧光光谱。
5. 根据权利要求4所述的盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，其特征在于，步骤c中所述稀 释后样品溶液中的甲醇含量< 10%。
【专利摘要】一种盐酸黄酮哌酯的荧光测定方法，包括如下步骤：盐酸黄酮哌酯片的样品溶液的制备、绘制一系列浓度的FX标准曲线和测定样品浓度。测定样品浓度时将稀释后的样品溶液中在强碱性环境下沸水浴中加热，冷却后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量λex/λem=302/410nm的荧光强度，计算出样品溶液中FX的浓度。本发明利用荧光测定方法测定盐酸黄酮哌酯片中的FX含量，灵敏度高，分析速度快，测试条件简便，环境友好，而且所需样品用量大大减少。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104777142
【申请号】CN201510215149
【发明人】李文红, 魏永巨, 李树山, 郭立达, 吕芳
【申请人】河北工业职业技术学院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月30日