一种基于磁珠的cd4+t淋巴细胞自动捕获与计数系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，包括微流控芯片及配套驱动装置。微流控芯片包括：一层盖片和一层结构片。微流控芯片主要包括：反应腔、废液腔、及计数区等功能模块。通过该反应腔，在配套驱动装置的控制下，实现磁珠对检测样品中CD4+T淋巴细胞的快速捕获，以及后续CD4+T淋巴细胞的荧光标记及清洗。各步反应产生的废液进入废液腔储存起来，避免了检测污染。最终在配套驱动装置的控制下，将带荧光标记的CD4+T淋巴细胞分散在芯片的计数区，形成一个单层分布检测体系。利用高灵敏度荧光检测技术，对CD4+T淋巴细胞单层分布体系进行荧光信号分析，则可以实现CD4+T淋巴细胞自动计数。
【专利说明】
一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统
技术领域
[0001]本发明涉及微流控生物芯片技术领域，可以自动完成CD4+T淋巴细胞捕获过程。本发明基于磁珠对CD4+T淋巴细胞的吸附作用，通过微流控芯片及其配套驱动装置之间的相互配合，自动完成磁珠捕获⑶4+T淋巴细胞、⑶4+T淋巴细胞纯化即磁珠清洗，废液移除和磁珠收集等多个反应步骤，最终得到待检测的CD4+T淋巴细胞-磁珠结合样本。芯片上集成蜡阀，用以切换磁珠混合过程和磁珠收集过程。本发明对原始样品，如血液中的CD4+T淋巴细胞进行自动捕获，经过一系列的反应步骤，得到高纯度的CD4+T淋巴细胞-磁珠结合样本，用于后续的扫描检测或照相检测，实现CD4+T淋巴细胞计数，为HIV诊疗提供重要的临床检测?目息O
【背景技术】
[0002]自20世纪90年代初，Manz等人提出微全分析系统(μ-TAS)的概念以来，微全分析研究引起了人们广泛的兴趣，微流控芯片(Microfluidics)，或芯片实验室(Lab on a Chip)正发展成为当今最为前沿、热点的科学研究领域之一，该技术指的是在一块几平方厘米甚至更小的芯片上构建的化学或生物反应器。微流控芯片技术可以把化学或生物等领域中所涉及的样品制备、混合、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元移植到在一块很小的芯片上，或者将多个功能模块集成到一个统一芯片上，将可控流体贯穿整个芯片的微通道网络，构建生物、化学微反应器或微系统。这种微流控芯片的优点包括:通过自动化、流水式的工作模式，大幅度缩短样品处理时间，提高反应效率，简化操作流程，提高检测效率，降低出错概率，提高检测分辨率/灵敏度，降低反应试剂和样品消耗及检测成本。
[0003]作为人体免疫系统的重要免疫细胞，CD4+T淋巴细胞是HIV病毒的攻击对象，所以其检测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。因此对CD4+T淋巴细胞进行计数可以为HIV诊疗提供重要的临床检测信息。目前用于CD4+T淋巴细胞计数方法主要是流式细胞计数的方法，这种方法检测精度高，能实现CD4+T淋巴细胞的绝对计数，但由于其主要分布在大型医院和重点实验室，成本十分昂贵，因而不利于大范围推广。目前基于微流控芯片的CD4+T淋巴细胞计数日益为人们所重视。微流控芯片通过集成多个微反应器，以及由微阀、微栗、微通道构成的可控性微流体网络，能为CD4+T淋巴细胞捕获和计数提供理想的平台。为实现操作简单、成本低廉的CD4+T淋巴细胞计数提供一种全新的方法。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于设计一种基于磁珠原理的⑶4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，包括微流控芯片及其驱动装置。该系统能够通过磁珠对原始样品，如血液、唾液中的CD4+T淋巴细胞进行捕获，通过清洗CD4+T淋巴细胞，最后将磁珠规则的排列在计数区，通过高灵敏度荧光检测方法，如荧光显微成像或者荧光信号强度检测，能够实现对计数区细胞进行计数检测。
[0005]本发明设计了一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，该系统包括微流控芯片、驱动装置。
[0006]微流控芯片包括盖片和结构片。盖片上设有排气孔;结构片包括进样口、进样通道、反应室、排液通道、废液腔、废液腔排气孔、蜡阀、存蜡腔、磁珠收集通道、计数区、磁珠挡槽、残液腔和残液腔排气通道;盖片上的排气孔与残液腔排气通道相连组成了残液腔的排气通道。盖片与结构片相粘接使反应腔、废液腔、残液腔和各通道形成封闭结构。
[0007]驱动装置包括:步进电机、步进电机支架、磁铁、芯片托盘、芯片托盘上盖一、芯片托盘上盖二、加热膜、光电开关挡片、光电开关一、光电开关二、光电开关支架、底座、控制器及显示模块。芯片托盘是芯片与驱动装置的接口。使用时，操作人员将芯片沿芯片托盘的上开口插入托盘底部即可实现芯片与驱动装置之间的相互定位和固定。
[0008]微流控芯片中，盖片和结构片的材料可以是聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或是其它聚合物材料。
[0009]微流控芯片中，盖片与结构片之间的粘接方式，既可以采用有机溶剂、或热粘接实现化学粘接，也可以采用压敏双面胶实现物理粘接。
[0010]微流控芯片中设计有一个微小的加样孔，允许通过手工或自动加样枪加入反应样品和反应试剂。
[0011]微流控芯片中设计有一个基于三角形的漏斗状反应室，通过步进电机带动芯片转动，使磁珠和反应样品或反应试剂在反应室中充分混合，从而实现磁珠捕获CD4细胞和清洗CD4细胞的目的。
[0012]微流控芯片中设计有一个排液通道和废液腔，其作用是收集整个反应过程中产生或残留的废液。
[0013]微流控芯片中设计有一个废液腔排气孔，其作用是使废液腔与外界大气相连，保证芯片中反应室与废液腔间气压平衡，防止出现因废液腔中气压增大而引起的废液残留无法排净的问题。
[0014]微流控芯片中设计有一个初始处于封闭状态的蜡阀，其作用是当磁珠、CD4+T淋巴细胞、及试剂反应结束后，通过加热方式打开蜡阀，使得磁珠能够经磁珠收集通道进入计数区。具体工作原理如下:在CD4细胞捕获或清洗过程中，关闭蜡阀，使磁珠在反应室中与反应样品或反应试剂充分混合；当磁珠、CD4+T淋巴细胞、及试剂反应完成后，在磁珠收集通道上的蜡阀打开后，在步进电机驱动下，使芯片托盘及芯片围绕中心垂直位置来回周期性转动，通过控制其转动速度及角度，使得由于转动产生的离心力能够驱动磁珠通过磁珠收集通道，进入到计数区。
[0015]微流控芯片中设计有一个磁珠收集通道，其作用是连接反应室和计数区，使磁珠尽可能无残留的通过磁珠收集通道到达计数区。具体工作原理是:磁珠收集通道呈平缓斜坡状，其一端高度与反应腔持平，另外一端高度与计数区持平，使得磁珠能够顺利进入计数区。
[0016]微流控芯片中设计有一个计数区，其作用是使磁珠在该区域单层分布，从而实现对所有磁珠进行检测，避免磁珠重叠带来的检测误差。基于不同的检测方式，计数区可以设计成不同的形状，如狭窄的直线区域，或者面积较大的倒三角漏斗形区域，具体工作原理如下:当计数区设计成直线形时，可以采用扫描的方法或抽样照相方法进行检测；当计数区设计成倒三角漏斗形时，可以采用整体照相的方法进行检测。
[0017]微流控芯片中设计有一个磁珠挡槽，该磁珠挡槽为一种多孔性的透气透水结构件，其作用是使残液或空气可以自由透过挡槽进入残液腔，而磁珠被截留在计数区。
[0018]微流控芯片中设计有一个残液腔，其作用是用以收集当磁珠由反应腔进入到计数区时，同时进入到计数区的废液，残液腔上部设计了一个排气通道，排气通道与盖片上的排气孔组成了残液腔排气通道，其作用是保持磁珠收集过程中系统的气压平衡，防止磁珠因计数区气压增大而引起的堵塞。
[0019]驱动装置中，芯片托盘、芯片托盘上盖一和芯片托盘上盖二组成了芯片插槽，用于固定微流控芯片。
[0020]驱动装置中，初始状态下，通过光电开关一与光电开关挡片的相互作用，使得芯片托盘及芯片停留在中心垂直位置，在步进电机驱动下，让芯片托盘及芯片围绕中心垂直位置实现左右来回周期性摆动，通过合理的控制转动速度及角度，在反应腔内实现磁珠、CD4+T淋巴细胞样品、及试剂之间的强制混合，显著提高磁珠对⑶4+T淋巴细胞的捕获吸附效率。
[0021]每次强制混合完成后，通过光电开关挡片及光电开关一的相互作用，在步进电机驱动下，使得芯片托盘及芯片回到初始的中心垂直位置，随后，在步进电机驱动下，让芯片托盘及芯片从中心垂直位置朝某一个固定方向转动，直到光电开关挡片遮挡光电开关二，芯片处于该位置时，一方面，反应腔内的磁珠会被芯片背面的磁铁所吸附，另一方面，在自然重力作用下，反应腔内的废液会顺着排液通道进入废液腔。
[0022]在微流控芯片中，与反应腔相连的磁珠收集通道中，串入了一个初始处于封闭状态的蜡阀，当磁珠、CD4+T淋巴细胞及试剂反应结束后，通过加热方式打开蜡阀，使得磁珠能够经磁珠收集通道进入计数区。
[0023]当磁珠、CD4+T淋巴细胞及试剂反应完成后，磁珠收集通道上的蜡阀打开，在步进电机驱动下，使芯片托盘及芯片围绕中心垂直位置来回周期性转动，通过控制其转动速度及角度，使得由于转动产生的离心力能够驱动磁珠通过磁珠收集通道，进入到计数区。由于计数区的垂直高度为数十个微米，与CD4+T淋巴细胞尺寸在同一个数量级范围，细胞会在计数区呈单层分布，通过高灵敏度荧光检测方法，如荧光显微成像或者荧光信号强度检测，能够实现细胞计数检测。
[0024]微流控芯片的反应腔被设计成基于三角形的漏斗状，芯片高速转动过程中，在离心力作用下，磁珠能够顺利进入磁珠收集通道，并最终到达计数区。
[0025]微流控芯片反应腔与计数区之间有一个磁珠收集通道，用于将反应腔中的磁珠转移到计数区，磁珠收集通道呈平缓斜坡状，其一端高度与反应腔持平，另外一端高度与计数区持平，使得磁珠能够顺利进入计数区。
[0026]微流控芯片的细胞计数区可以被设计成不同的形状，如狭窄的直线区域，或者面积较大的倒三角漏斗形区域，以适应不同的细胞检测方式。
[0027]微流控芯片的计数区下游末端有一个磁珠挡槽，该磁珠挡槽为一种多孔性的透气透水结构件，允许当细胞由反应腔进入到计数区时，废液或者空气能够由此进入到残液腔，而磁珠则被截留在计数区。
[0028]在微流控芯片计数区的下游集成了一个残液腔，用以收集当磁珠由反应腔进入到计数区时，同时进入到计数区的废液，残液腔有与外界连通的通气孔。
[0029]驱动装置上有一个加热膜，用以加热融化处于磁珠收集通道中蜡阀中的石蜡，打开蜡阀，使得磁珠能够由反应腔进入计数区。
[0030]本发明的有益效果:本发明设计了一种基于磁珠吸附原理的⑶4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，基于磁珠对CD4+T淋巴细胞的吸附作用，通过微流控芯片及其驱动装置之间的相互配合，自动完成CD4+T淋巴细胞捕获和清洗以及磁珠收集和单层阵列等操作步骤，最后利用高灵敏度荧光检测技术，对CD4+T淋巴细胞单层分布体系进行荧光信号分析，则可以实现⑶4+T淋巴细胞自动计数。
[0031]本发明基于不同的检测方法提出了两种计数区设计，其中一种基于扫描或抽样照相的方式将计数区设计成一种直线形计数区，另一种基于整体照相的方式将计数区设计成倒三角漏斗形计数区。
【附图说明】
[0032]图1:为本发明⑶4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统的结构示意图。
[0033]图2:为本发明⑶4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统的驱动装置示意图。
[0034]图3:为本发明CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统的微流控芯片示意图。
[0035]图4:为本发明CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统中磁珠混合、磁珠清洗、废液移除和磁珠收集的原理示意图。
[0036]附图标记说明:
[0037 ] 吸水纸一18芯片托盘一19芯片托盘上盖一一20
[0038]芯片托盘上盖一.一21步进电机一22步进电机支架一23
[0039]磁铁一 24光电开关一一 25光电开关二一 26
[0040]光电开关支架一 27底座一 28结构片一 29
[0041]盖片一 30第二结构片一 31加热膜一 32
[0042]光电开关挡片一17反应室一 I废液腔一 2
[0043]残液腔一 3进样口一4进样通道一 5
[0044]排液通道一6废液腔排气孔一 7蜡阀一 8
[0045]存蜡腔一9磁珠收集通道一 10第一计数区一11
[0046]磁珠挡槽一12残液腔排气通道一 13 通气孔一 14
[0047]第二计数区一15磁珠挡槽一 16
【具体实施方式】
[0048]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，通过结合附图对各组成部分的详细说明将会更好地描述实现本发明。应该指出，所描述的实施例仅视为说明的目的，而不是对本发明的限制。
[0049]图1展示了CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统的装配结构示意图，包括微流控芯片、驱动装置。通过微流控芯片与驱动装置之间的相互配合，实现CD4+T淋巴细胞的自动捕获与计数。
[0050]图2为驱动装置的示意图，由步进电机22、步进电机支架23、磁铁24、芯片托盘19、芯片托盘上盖一20、芯片托盘上盖二 21、加热膜32、光电开关挡片17、光电开关一25、光电开关二26、光电开关支架27、底座28组成。其中，芯片托盘上盖一20、芯片托盘上盖二21依次固定在芯片托盘19上，芯片托盘上盖一 20和芯片托盘上盖二 21相平行;芯片托盘19、芯片托盘上盖一 20、芯片托盘上盖二 21组成了芯片插槽用于定位和固定微流控芯片，芯片托盘19固定在步进电机22的输出轴上，步进电机22安装在步进电机支架23上，通过控制步进电机22的转动，带动芯片托盘19以及微流控芯片运动。芯片托盘19底部固定有光电开关挡片17，光电开关一 25固定在底座28上，当芯片托盘19及微流控芯片处于垂直方向时，光电开关挡片17的位置与光电开关一25的位置重合，即芯片初始位置设定为垂直方向，光电开关二26固定在光电开关支架27上，光电开关支架27固定在底座28上，当芯片托盘19及微流控芯片略高于水平方向(3°-5°)时，光电开关挡片17的位置与光电开关二26的位置重合，此时反应后的废液通过排液通道6排出。磁铁24固定在步进电机支架23上，其作用是废液移除过程中吸附反应室I中的磁珠，防止磁珠随废液排到废液腔2中。加热膜32固定在芯片托盘19上，加热膜32的中心与结构片29上的蜡阀8的中心重合，其作用是控制蜡阀的打开或关闭。因此通过控制步进电机22运动方式以及定位位置，能够实现磁珠与反应试剂或反应样品的混合、废液移除等操作，通过控制加热膜32，能够控制蜡阀的打开与关闭。【具体实施方式】与图解见图4。
[0051]图3为微流控芯片设计示意图，其中，图3A为微流控芯片的组合结构图，微流控芯片由结构片29和盖片30组成。盖片30上有一个通气孔14，通气孔14与残液腔排气通道13组成了残液腔的排气通道。图3B为结构片29的结构示意图，结构片29由进样口4、进样通道5、反应室1、排液通道6、废液腔2、废液腔排气孔7、蜡阀8、存蜡腔9、磁珠收集通道10、第一计数区11、磁珠挡槽12、残液腔3、残液腔排气通道13组成。反应室I与废液腔2之间通过排液通道6连接，反应室I的一侧角部设有进样口 4，进样口 4通过进样通道5与反应室I连接;反应室I的另一侧与磁珠收集通道10连接，磁珠收集通道10的端部设有蜡阀8，蜡阀8与存蜡腔9连接;磁珠收集通道10与第一计数区11连接，第一计数区11与残液腔3连接，第一计数区11与残液腔3的连接处设有磁珠挡槽12。
[0052]其中，废液腔2中放入吸水纸18用以吸收废液;第一计数区11的长度由加入的磁珠的量及大小决定，即第一计数区11的长度需足够长从而能将磁珠单层铺开，进而避免磁珠的堆叠;盖片30与结构片29粘接好后形成了微流控芯片。图3C为第二结构片31的设计示意图，第二结构片31的结构与结构片29的结构一致，第二结构片31与结构片29的区别在于计数区(11和15)的形状不同和磁珠挡槽(12和16)的大小不同，第二计数区15为倒三角漏斗形，第二结构片31是基于整体照相方法设计，其优点在于第二计数区15设计紧凑，磁珠充分铺开时所需芯片长度小。
[0053]图4为本发明磁珠混合、磁珠清洗、废液移除及磁珠收集工作原理示意图。如图4所示，芯片托盘固定在步进电机轴上，控制器通过控制步进电机转动带动芯片托盘以及微流控芯片运动；芯片托盘底部固定了一个光电开关挡片，在芯片托盘初始位置即垂直方向处的底座上固定有一个光电开关一，控制器通过检测光电开关挡片是否挡住光电开关一即能达到检测芯片托盘运动位置的目的。图4A为磁珠混合过程或磁珠清洗过程示意图，磁珠混合或清洗过程中，蜡阀关闭，控制器控制电机从初始位置(a)开始转动一定角度后到达位置(b)后反向转动到位置(C)，通过控制电机使芯片在位置(b)和位置(C)之间来回高速转动，使磁珠充分混合达到最大效率捕获CD4+T淋巴细胞的目的；图4B为废液移除过程示意图，控制器控制电机从初始位置(e)转动，当控制器检测到光电开关二被光电开关挡片挡住时即芯片到达位置(f)时，控制器控制电机停止一段时间，等待废液移除后，控制器控制电机反向转动，使微流控芯片返回初始位置(g)，此时废液移除过程完成;如图4C所示，磁珠收集过程如下所示:首先控制器控制电机运动由初始位置(h)运动到位置(i)时，控制器控制加热膜加热，融化蜡阀中的蜡，液蜡由于重力作用流入存蜡腔中，此时蜡阀打开，然后控制电机复位后进行往复运动，运动过程与磁珠混合或磁珠清洗过程中的运动过程一致，控制器控制电机从初始位置(j)开始转动一定角度后到达位置(k)后反向转动到位置(I)，通过控制电机使微流控芯片在位置(k)和位置(I)之间来回高速转动，由于离心力的作用，磁珠将通过磁珠收集通道到达计数区，由于磁珠挡槽中固定了用于拦截磁珠的膜，因而磁珠最终将排列在计数区中，此时磁珠收集过程完成。
[0054]实施例1
[0055]一种基于磁珠吸附原理的⑶4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，可以自动完成⑶4+T淋巴细胞捕获(磁珠混合)、CD4+T淋巴细胞清洗、废液移除和磁珠收集过程，最终利用高灵敏度荧光检测技术，对CD4+T淋巴细胞单层分布体系进行荧光扫描，并对荧光信号进行分析，则可以实现CD4+T淋巴细胞自动计数。其工作原理如下:芯片中加入样品和磁珠后，通过控制电机使芯片中的磁珠和样品充分混合，从而使磁珠充分捕获样品中的CD4+T淋巴细胞，然后将残液移除后，加入清洗液将磁珠表面残留的杂质进行清洗得到纯化后的捕获CD4+T淋巴细胞的磁珠，最后，打开蜡阀，利用离心力收集纯化后的磁珠，使磁珠在第一计数区11中单层分布，利用扫描的方式对第一计数区11的磁珠依次照射激发荧光，并进行荧光信号采集分析，即可获得最终的检测结果，从而实现CD4+T淋巴细胞自动计数。
[0056]如图3A和3B所示，该微流控芯片的尺寸为100mm X 50mm X 2mm(长X宽X高)。芯片材料可以是聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或是其它聚合物材料。反应腔的容积为380微升，其形状为一个长度为24mm，总高度为23mm，深度Imm的漏斗形，进样口和通气孔均为宽度1mm、深度Imm的通道，废液腔尺寸50mmX 14mmX Imm(长X宽X高)，磁珠收集通道为一个坡度平缓的斜坡状通道，其宽度为1mm，芯片第一计数区11尺寸为30mm X ImmX
0.05mm(长X宽X高)，适用于直径为25μπι到50μπι的磁珠。微流控芯片由盖片30和结构片29组成。盖片30上有一个通气口 14，结构片29由进样口 4、进样通道5、反应室1、排液通道6、废液腔2、废液腔排气孔7、蜡阀8、存蜡腔9、磁珠收集通道1、第一计数区11、磁珠挡槽12、残液腔3、残液腔排气通道13组成。盖片30上的通气口 14与结构片29上的残液腔排气通道13组成了残液腔的排气通道。
[0057]微流控芯片制备过程如下:I)利用数控铣床按照设计尺寸加工结构片。2)盖片为厚度0.1mm的薄片直接裁剪。3)结构片和盖片在清理、清洗之后，按照如图3Α所示结构组成进行粘接。4)盖片与结构片之间的粘合，采用有机溶剂或热粘接实现化学粘接，或采用压敏双面胶实现物理粘接。
[0058]CD4+T淋巴细胞捕获即磁珠混合过程中，将检测样品及磁珠通过注样孔注入微流控芯片的反应室内。微流控芯片的周期性摆动次数，如1-1000次，步进电机的转速均可以通过驱动装置的触控屏操作界面进行设置，整个驱动装置受控于一个基于微处理器的控制器。启动驱动装置，由步进电机的程序化运动控制来实现磁珠和检测样品、反应试剂之间的充分混合，提高磁珠捕获CD4+T淋巴细胞的效率，降低检测误差，磁珠混合、清洗过程完成后，打开蜡阀，通过利用电机来回高速摆动产生的离心力收集磁珠，磁珠通过平缓的磁珠收集通道进入第一计数区11，在第一计数区11中实现磁珠的单层分布，磁珠捕获完毕后，控制器控制光学检测头对第一计数区11进行扫描检测，获得荧光信号，从而实现CD4+T淋巴细胞计数。
[0059]实施例2
[0060]一种基于磁珠吸附原理的⑶4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，可以自动完成⑶4+T淋巴细胞捕获(磁珠混合)、CD4+T淋巴细胞清洗、废液移除和磁珠收集过程，最终利用照相方法对芯片第二计数区15的CD4+T淋巴细胞和磁珠进行拍照，利用图像处理的方法对样本中的⑶4+T淋巴细胞进行直接计数。其工作原理如下:芯片中加入样品和磁珠后，通过控制电机使芯片中的磁珠和样品充分混合，从而使磁珠充分捕获样品中的CD4+T淋巴细胞，然后将残液移除后，加入清洗液将磁珠表面残留的杂质进行清洗得到纯化后的捕获CD4+T淋巴细胞的磁珠，然后，开启加热膜，使加热膜加热融化蜡阀中的蜡，打开蜡阀，蜡阀开启后，控制电机带动芯片高速转动，利用转动产生的离心力收集纯化后的磁珠，由于第二计数区15的深度小于两倍磁珠直径且大于磁珠直径，因而磁珠在第二计数区15中单层分布，避免照相过程中因磁珠堆叠带来的检测误差，最后对照片进行图像处理，找出照片中的所有CD4+T淋巴细胞，从而实现⑶4+T淋巴细胞自动计数。
[0061 ] 如图3C所示，该微流控芯片的尺寸为80mmX 50mmX 2mm(长X宽X高)。芯片材料可以是聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或是其它聚合物材料。反应腔的容积为380微升，其形状为一个长度为24mm，总高度为23mm，深度Imm的漏斗形，进样口和通气孔均为宽度1mm、深度Imm的通道，废液腔尺寸50mmX 14mmX Imm(长X宽X高)，磁珠收集通道为一个坡度平缓的斜坡状通道，其宽度为Imm，芯片第二计数区15尺寸为Imm X 16mm X 10 X 0.05mm(上底X下底X高X深度)，其形状为一个基于三角形的漏斗状，适用于直径为25μπι到50μπι的磁珠。微流控芯片由盖片30和结构片31组成。盖片30上有一个通气口 14，盖片30和结构片31粘合后组成了封闭的微流控芯片。
[0062]微流控芯片制备过程如下:(I)利用数控铣床按照设计尺寸加工结构片。(2)盖片为厚度0.1mm的薄片，可以直接裁剪。(3)结构片和盖片在清理、清洗之后，按照如图3Α所示结构组成进行粘接。(4)盖片与结构片之间的粘合，既可以采用有机溶剂、或热粘接实现化学粘接，也可以采用压敏双面胶实现物理粘接。
[0063]CD4+T淋巴细胞捕获即磁珠混合过程中，将检测样品及磁珠通过注样孔注入微流控芯片的反应室内。微流控芯片的周期性摆动次数，如1-1000次，步进电机的转速均可以通过驱动装置的触控屏操作界面进行设置，整个驱动装置受控于一个基于微处理器的控制器。启动驱动装置，由步进电机的程序化运动控制来实现磁珠和检测样品、反应试剂之间的充分混合，提高磁珠捕获CD4+T淋巴细胞的效率，降低检测误差，磁珠混合、清洗过程完成后，控制器控制加热膜加热融化蜡阀中的蜡，打开蜡阀，然后利用电机来回高速摆动产生的离心力收集磁珠。磁珠通过平缓的磁珠收集通道进入第二计数区15，在第二计数区15中实现磁珠的单层分布，磁珠捕获完毕后，控制器控制摄像头进行图像采集，并调用算法对图像进行处理，最终实现⑶4+Τ淋巴细胞计数。
[0064]上述附图及具体实施例仅用于说明本发明，本发明并不局限于此。在由本发明权利要求所限定的发明实质和范围内对本发明进行细微的改变均落在本发明的保护范围内。如样品反应腔的形状、尺寸，各类功能性及连接性沟道、通孔、连接孔的形状、尺寸等。
【主权项】
1.一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于: 该系统包括微流控芯片、驱动装置;通过微流控芯片与驱动装置之间的相互配合，实现CD4+T淋巴细胞的自动捕获与计数； 驱动装置由步进电机(22)、步进电机支架(23)、磁铁(24)、芯片托盘(19)、芯片托盘上盖一(20)、芯片托盘上盖二(21)、加热膜(32)、光电开关挡片(17)、光电开关一(25)、光电开关二(26)、光电开关支架(27)、底座(28)组成;其中，芯片托盘上盖一(20)、芯片托盘上盖二(21)依次固定在芯片托盘(19)上，芯片托盘上盖一(20)和芯片托盘上盖二(21)相平行;芯片托盘(19)、芯片托盘上盖一(20)、芯片托盘上盖二(21)组成了芯片插槽用于定位和固定微流控芯片，芯片托盘(19)固定在步进电机(22)的输出轴上，步进电机(22)安装在步进电机支架(23)上，通过控制步进电机(22)的转动，带动芯片托盘(19)以及微流控芯片运动;芯片托盘(19)底部固定有光电开关挡片(17)，光电开关一 (25)固定在底座(28)上，当芯片托盘(19)及微流控芯片处于垂直方向时，光电开关挡片(17)的位置与光电开关一 (25)的位置重合，即芯片初始位置设定为垂直方向，光电开关二(26)固定在光电开关支架(27)上，光电开关支架(27)固定在底座(28)上，当芯片托盘(19)及微流控芯片略高于水平方向时即3°-.5°，光电开关挡片(17)的位置与光电开关二(26)的位置重合，此时反应后的废液通过排液通道(6)排出；磁铁(24)固定在步进电机支架(23)上，其作用是废液移除过程中吸附反应室(I)中的磁珠，防止磁珠随废液排到废液腔(2)中；加热膜(32)固定在芯片托盘(19)上，加热膜(32)的中心与结构片(29)上的蜡阀(8)的中心重合，其作用是控制蜡阀的打开或关闭；因此通过控制步进电机(22)运动方式以及定位位置，能够实现磁珠与反应试剂或反应样品的混合、废液移除操作，通过控制加热膜(32)，能够控制蜡阀的打开与关闭； 微流控芯片由结构片(29)和盖片(30)组成；盖片(30)上有一个通气孔(14)，通气孔(14)与残液腔排气通道(13)组成了残液腔的排气通道;结构片(29)由进样口(4)、进样通道(5)、反应室(I)、排液通道(6)、废液腔(2)、废液腔排气孔(7)、蜡阀(8)、存蜡腔(9)、磁珠收集通道(10)、第一计数区(11)、磁珠挡槽(12)、残液腔(3)、残液腔排气通道(13)组成;反应室(I)与废液腔(2)之间通过排液通道(6)连接，反应室(I)的一侧角部设有进样口(4)，进样口(4)通过进样通道(5)与反应室(I)连接;反应室(I)的另一侧与磁珠收集通道(10)连接，磁珠收集通道(10)的顶部设有蜡阀(8)，蜡阀(8)与存蜡腔(9)连接;磁珠收集通道(10)与第一计数区(11)连接，第一计数区(11)与残液腔(3)连接，第一计数区(11)与残液腔(3)的连接处设有磁珠挡槽(12)。2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于: 废液腔(2)中放入吸水纸(18)用以吸收废液;第一计数区(II)的长度由加入的磁珠的量及大小决定，即第一计数区(11)的长度需足够长从而能将磁珠单层铺开，进而避免磁珠的堆叠;盖片(30)与结构片(29)粘接好后形成了微流控芯片；第二结构片(31)的结构与结构片(29)的结构一致，第二结构片(31)与结构片(29)的区别在于计数区的形状不同和磁珠挡槽的大小不同，第二计数区(15)为倒三角漏斗形，第二结构片31是基于整体照相方法设计，其优点在于第二计数区(15)设计紧凑，磁珠充分铺开时所需芯片长度小。3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:驱动装置中，初始状态下，通过光电开关一与光电开关挡片的相互作用，使得芯片托盘及芯片停留在中心垂直位置，在步进电机驱动下，让芯片托盘及芯片围绕中心垂直位置实现左右来回周期性摆动，通过合理的控制转动速度及角度，在反应腔内实现磁珠、CD4+T淋巴细胞样品及试剂之间的强制混合，显著提高磁珠对CD4+T淋巴细胞的捕获吸附效率。4.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:每次强制混合完成后，通过光电开关挡片及光电开关一的相互作用，在步进电机驱动下，使得芯片托盘及芯片回到初始的中心垂直位置，随后，在步进电机驱动下，让芯片托盘及芯片从中心垂直位置朝某一个固定方向转动，直到光电开关挡片遮挡光电开关二，芯片处于该位置时，一方面，反应腔内的磁珠会被芯片背面的磁铁所吸附，另一方面，在自然重力作用下，反应腔内的废液会顺着排液通道进入废液腔。5.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:在微流控芯片中，与反应腔相连的磁珠收集通道中，串入了一个初始处于封闭状态的蜡阀，当磁珠、CD4+T淋巴细胞及试剂反应结束后，通过加热方式打开蜡阀，使得磁珠能够经磁珠收集通道进入计数区。6.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:当磁珠、CD4+T淋巴细胞、及试剂反应完成后，在磁珠收集通道上的蜡阀打开后，在步进电机驱动下，使芯片托盘及芯片围绕中心垂直位置来回周期性转动，通过控制其转动速度及角度，使得由于转动产生的离心力能够驱动磁珠通过磁珠收集通道，进入到计数区；由于计数区的垂直高度为数十个微米，与CD4+T淋巴细胞尺寸在同一个数量级范围，细胞会在计数区呈单层分布，通过高灵敏度荧光检测方法，荧光显微成像或者荧光信号强度检测，能够实现细胞计数检测。7.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:微流控芯片的反应腔被设计成基于三角形的漏斗状，芯片高速转动过程中，在离心力作用下，磁珠能够顺利进入磁珠收集通道，并最终到达计数区。8.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:微流控芯片反应腔与计数区之间有一个磁珠收集通道，用于将反应腔中的磁珠转移到计数区，磁珠收集通道呈平缓斜坡状，其一端高度与反应腔持平，另外一端高度与计数区持平，使得磁珠能够顺利进入计数区。9.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:微流控芯片的细胞计数区能够被设计成狭窄的直线区域或者面积较大的倒三角漏斗形区域，以适应不同的细胞检测方式。10.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的CD4+T淋巴细胞自动捕获与计数系统，其特征在于:微流控芯片的计数区下游末端有一个磁珠挡槽，该磁珠挡槽为一种多孔性的透气透水结构件，允许当细胞由反应腔进入到计数区时，废液或者空气能够由此进入到残液腔，而磁珠则被截留在计数区； 在微流控芯片计数区的下游集成了一个残液腔，用以收集当磁珠由反应腔进入到计数区时，同时进入到计数区的废液，残液腔有与外界连通的通气孔； 驱动装置上有一个加热膜，用以加热融化处于磁珠收集通道中，蜡阀中的石蜡，打开蜡阀，使得磁珠能够由反应腔进入计数区。
【文档编号】G01N15/14GK105842143SQ201610231854
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】邱宪波, 阳勇良, 雷相阳
【申请人】北京化工大学