一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法
一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，所述方法为利用电化学测试得到活细胞受药物刺激后的电流?时间曲线，同时进行电子顺磁共振波谱测试，得到电化学池中活细胞在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度?电流关系曲线；同样对过氧化氢标准溶液进行电子顺磁共振波谱测试，得到过氧化氢标准溶液在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度?过氧化氢浓度标准曲线，综合上述建立的三种曲线得到任意时间下的活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度，完成活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。本发明使得活细胞释放的过氧化氢浓度的定量检测更加准确，能实现原位实时监测活细胞所释放过氧化氢的浓度，具有广泛的应用前景。
【专利说明】
一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法
技术领域
[0001]本发明属于检测分析技术领域，涉及一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，尤其涉及一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法。
【背景技术】
[0002]活性氧不仅包括一些氧自由基，如超氧阴离子，羟基自由基等，还包括具有较高活性的一些分子如过氧化氢和单线态氧。与其他活性氧相比，过氧化氢性质相对稳定、容易在细胞与细胞周围环境之间扩散。一方面，人体内自发产生的适量的过氧化氢是相当重要的，在信号传导、神经传递、血小板凝集、免疫系统控制、学习和记忆、细胞常规生长、重要的生命化合物的合成和机体的新陈代谢中，都发挥了重要的作用。然而，当过氧化氢产生过量，或是机体自身的抗氧化剂的量大量减少时，过氧化氢就变得相当有害了。它们通过氧化一些功能性生物分子，使得细胞脂质膜，蛋白质组织、酶、碳水化合物和DNA等发生氧化损伤，造成细胞损坏或死亡，与癌症、炎症以及一些神经系统疾病密切相关。总之，在正常生理环境中，一定量的过氧化氢对于生命体是必不可少的，但过量的活性氧就会造成危害。因此，原位实时准确监测细胞产生过氧化氢的浓度对细胞信号传导研究、疾病诊断具有重要意义。
[0003]目前，大多数的过氧化氢检测方法，如色谱法、滴定法、紫外-可见光谱法、荧光法等，总的来说都比较耗时，易受干扰物影响，且难以原位实时检测。电化学方法，特别是基于纳米材料和酶修饰电极的电流型传感器由于实验过程简单、灵敏度高、选择性高而受到广泛关注。在通过电化学的方法对细胞外产生的过氧化氢做定量检测的工作中，目前主要是先用修饰电极构建安培电流与过氧化氢的浓度的标准曲线，然后通过实际细胞体系产生的安培电流曲线在标准曲线上读取或者计算出细胞产生的过氧化氢的浓度。这种方法经常被用作定量分析的手段，但是在活细胞体系中，这种制作标准曲线的方法存在一定缺陷。一方面，如果在将细胞接种到工作电极表面之后构建标准曲线，加入的标准溶液中的部分过氧化氢会扩散到细胞内部并被细胞内的酶等代谢分解掉，这样实际体系中测试得到的过氧化氢浓度往往是偏高的。另一方面，如果在将细胞接种到工作电极表面之前构建标准曲线，也就是说构建标准曲线时电极表面是不含有细胞的，这在电极活性面积、导电性方面与实际检测体系中所用的生长有贴壁细胞的工作电极不一致，因此所测试得到的过氧化氢浓度也是不准确的。
[0004]因此，在本领域需要开发一种能够原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，尤其是提供一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法。
[0006]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]—方面，本发明提供一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，所述方法为利用电化学测试得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线，与此同时进行电子顺磁共振波谱测试，得到电化学池中活细胞在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-电流关系曲线；同样对过氧化氢标准溶液进行电子顺磁共振波谱测试，得到过氧化氢标准溶液在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，综合上述建立的三种曲线得到任意时间下的活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度，完成活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。
[0008]本发明所述方法将电子顺磁共振波谱技术与电化学分析相结合来实现活细胞中过氧化氢浓度的原位实时检测，使得定量检测更加准确，解决了现有技术无法实现活细胞中过氧化氢浓度的原位实时检测的问题。
[0009]在本发明中，所述检测活细胞中过氧化氢浓度的方法包括以下步骤:
[0010](I)将三电极工作体系插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，所述三电极工作体系的工作电极上接种有活细胞，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线；
[0011](2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线；
[0012](3)配制过氧化氢(H2O2)标准溶液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线；
[0013](4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤
(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。
[0014]本发明通过将对过氧化氢有灵敏准确响应但原位实时性检测稍差的电子顺磁共振波谱技术与电化学相结合，利用电子自旋共振法(ESR)辅助电化学分析法进行标准曲线的构建，这个方法不涉及电极和活细胞之间的矛盾，可以实现活细胞外产生的过氧化氢的准确定量检测，而电化学分析则可对活细胞产生过氧化氢的过程原位实时检测。本发明提供的检测方法，避免了单纯使用电化学方法和电子顺磁共振检测的缺陷，使得定量检测更加准确，尤其适用于对活细胞体系产生过氧化氢浓度的原位实时准确监测，在疾病检测等生物医学领域具有重要应用价值。
[0015]优选地，步骤(I)所述三电极工作体系是以Ag/AgCl电极作为参比电极，采用铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡(ITO)电极作为工作电极。
[0016]优选地，所述表面修饰的氧化铟锡(ITO)电极从靠近氧化铟锡电极的一侧起表面逐层分别修饰有石墨烯、贵金属纳米颗粒、过氧化氢分解酶和细胞粘附剂。
[0017]优选地，所述表面修饰的氧化铟锡(ITO)电极的制备方法如下:
[0018]A、利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理；
[0019]B、将氧化石墨烯溶液旋涂到步骤A得到的氧化铟锡玻璃表面，置于肼蒸汽中进行原位还原，得到表面修饰有石墨烯的氧化铟锡玻璃；
[0020]C、将贵金属纳米颗粒溶液加至步骤B得到的氧化铟锡玻璃表面，干燥，而后将其在过氧化氢分解酶溶液中浸润，得到修饰有贵金属纳米颗粒和酶的氧化铟锡(ITO)电极；
[0021]D、将细胞粘附剂溶液加至步骤C得到的电极表面，干燥得到所述表面修饰的氧化铟锡电极。
[0022]优选地，在表面修饰的氧化铟锡(ITO)电极的制备中，在利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理前，先将氧化铟锡玻璃分别置于丙酮、乙醇和超纯水中依次超声10-30分钟，例如10分钟、13分钟、15分钟、18分钟、20分钟、23分钟、25分钟、28分钟或30分钟。
[0023]在本发明中，利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理的目的是增加亲水性和铺展性有利于其后续修饰。
[0024]优选地，步骤13所述氧化石墨稀溶液的浓度为0.01-0.lmg/mL，例如0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL或0.lmg/mL。
[0025]优选地，步骤8所述原位还原的温度为50-70°(:，例如51°(:、52°(:、53°(:、54°(:、561€、58°C、60°C、62°C、64°C、66°C、68°C或70°C。
[0026]优选地，步骤B所述原位还原的时间为4-12小时，例如4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。
[0027]优选地，步骤C所述贵金属纳米颗粒为银纳米颗粒、金纳米颗粒或铀纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合，优选金纳米颗粒。
[0028]优选地，步骤C所述金贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒的质量百分数为0.01-0.05%，例如0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%或
0.05%。
[0029 ] 优选地，步骤(3所述贵金属纳米颗粒溶液与步骤B所述氧化石墨稀溶液的体积比为1:2-2:1;例如1:2、1:1.8、1:1.5、1:1.3、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
[0030]优选地，步骤C所述过氧化氢分解酶为辣根过氧化物酶。
[0031 ] 优选地，步骤C所述过氧化氢分解酶溶液的浓度为l_5mg/mL，例如lmg/mL、1.3mg/mL、I.5mg/mL、I.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或 5mg/mL。
[0032]优选地，步骤D所述细胞粘附剂为由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列组成的环状短肽(简称RGD环肽)。
[0033]优选地，所述细胞粘附剂溶液的浓度为l_5mg/mL，例如lmg/mL、1.3mg/mL、1.5mg/mL、I.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或 5mg/mL。
[0034]优选地，步骤D所述细胞粘附剂溶液与步骤C所述金纳米颗粒溶液的体积比为1:2-2:1，例如1:2、1:1.8、1:1.5、1:1.3、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
[0035]优选地，步骤(I)所述电解液为磷酸盐缓冲溶液。
[0036]优选地，步骤(I)所述药物为佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。
[0037]优选地，步骤(I)所述活细胞为能够在工作电极上贴壁生长的活细胞，对活细胞种类没有限制，只要是贴壁生长即可，具体的可以是Hela或其它肿瘤细胞。
[0038]优选地，在本发明的检测活细胞中过氧化氢浓度的方法中，步骤(2)所述羟基自由基捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物。
[0039]优选地，步骤(2)所述加入羟基自由基捕获剂使其在活细胞培养液中的浓度为20-80mM，例如 20mM、25mM、30mM、3 5mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM 或 80mM，优选40-50mM。
[0040]优选地，步骤(2)所述紫外光的波长范围为280-320nm，例如280nm、290nm、300nm、305nm、308nm、31 Onm、315nm、318nm 或 320nm。
[0041]在本发明中，步骤(3)所述ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，是以过氧化氢浓度的对数值(log值)为横坐标，以ESR信号强度为纵坐标建立的关系曲线。
[0042]在本发明中，步骤(3)所述过氧化氢标准溶液的浓度为10—9-10—3mol/L，例如10一9mol/L、8 X 10—Vol/L、5 X 10—Vol/L、3 X 10—Vol/L、8 X 10—7mol/L、5 X 10—7mol/L、3 X 10—7mol/L、5 X 10—W/L、I X 10—6mol/L、8 X 10—W/L、4 X 10—W/L、I X 10—W/L、8 X 10—4mol/L、5 X 10—4mol/L或I X 10—3mol/L。
[0043]优选地，步骤(3)所述配制过氧化氢标准溶液时所选定的过氧化氢的浓度梯度为IX 10—6、5 X 10—6、I X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—5mol/L。当然也可以选择其他浓度梯度的过氧化氢标准溶液，只要该标准溶液中每个样品的浓度在10—9-10—3mol/L即可。
[0044]优选地，步骤(3)所述羟基自由基捕获剂为5，5_二甲基-1-吡咯啉氮氧化物。
[0045]优选地，步骤(3)所述加入羟基自由基捕获剂使其在过氧化氢标准溶液中的浓度等于步骤(2)所述羟基自由基捕获剂在活细胞培养液中的浓度。
[0046]优选地，步骤(3)所述紫外光的波长范围为280-320nm，例如280nm、290nm、300nm、305nm、308nm、31 Onm、315nm、318nm 或 320nm。
[0047]优选地，在本发明中，利用电子顺磁共振波谱仪记录ESR谱图。
[0048]作为优选技术方案，本发明所述检测活细胞中过氧化氢浓度的方法具体包括以下步骤:
[0049](I)以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡电极作为工作电极组成三电极工作体系，将其插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线；
[0050](2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线；
[0051 ] (3)配制10—4、10—5、10—6、10—7和10—8mol/L浓度的过氧化氢溶液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线；
[0052](4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤
(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。
[0053]相对于现有技术，本发明具有如下有益效果:
[0054]与单一电化学分析方法相比，本发明将电子顺磁共振波谱技术与电化学方法结合，将利用电子顺磁共振波谱技术所得到的信号强度作为一个中间量，所建立的标准曲线能更加准确的反映活细胞测试体系中过氧化氢的浓度;与单一电子顺磁共振方法相比，本发明利用电子顺磁共振波谱技术与电化学方法结合可以原位实时监测活细胞所释放过氧化氢的浓度。本发明将电子顺磁共振波谱技术与电化学方法完美结合，使得活细胞释放的过氧化氢浓度的定量检测更加准确，解决了现有技术无法实现活细胞中过氧化氢浓度的原位实时检测的问题，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0055]图1是本发明中工作电极的制备过程示意图。
[0056]图2是本发明实施例1得到的电流-时间关系曲线，曲线I为细胞接种到工作电极上后加入PMA刺激下产生的电流-时间关系曲线，曲线2为细胞接种到工作电极上后但是无PMA刺激情况下产生的电流-时间关系曲线；曲线3为仅有PMA刺激但是未接种细胞到工作电极情况下产生的电流-时间关系曲线。
[0057]图3是本发明实施例1步骤(3)测试得到的活细胞培养液的ESR谱图.
[0058]图4是本发明实施例1建立的ESR信号强度-电流的关系曲线。
[0059]图5是本发明实施例1步骤(4)测试得到的不同浓度的过氧化氢标准溶液的ESR谱图。
[0060]图6是本发明实施例1建立的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线。
【具体实施方式】
[0061]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0062]实施例1
[0063](I)工作电极(即表面修饰有石墨烯、金纳米颗粒、辣根过氧化物酶和细胞粘附剂RGD环肽的ITO电极并在其表面接种有活细胞)的制备，具体包括以下步骤(其制备过程如图1所示):
[0064]A、将ITO玻璃置于丙酮、乙醇、超纯水中依次超声20分钟，然后使用氧等离子体对其表面进行处理，以增加亲水性和铺展性有利于后续修饰；
[0065]B、将浓度为0.06mg/mL的氧化石墨烯溶液旋涂到上述ITO玻璃表面，然后置于肼蒸汽中于60 0C原位还原1小时；
[0066]C、将10微升金纳米颗粒溶液滴加到上述修饰有石墨烯的ITO表面，室温下自然干燥，而后在4°C条件下，将上述电极浸润到辣根过氧化物酶溶液中至少24小时，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗表面三次，得到修饰有金纳米颗粒和酶的氧化铟锡(ITO)电极；
[0067]D、10微升RGD环肽溶液滴加到步骤C得到的电极表面，4°C下自然干燥，得到所述表面修饰的氧化铟锡电极，而后Hela细胞接种到表面修饰的氧化铟锡电极表面，得到工作电极。
[0068](2)电流-时间关系曲线的建立
[0069]以Ag/AgCl电极作为参比电极，采用铂片或铂丝作为对电极，利用上述得到的表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡电极作为工作电极，将上述三电极插入到0.0lmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，形成一个三电极电化学测试系统，以开始加入PMA药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间(Omin)，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后O到60分钟内的电流-时间曲线，结果如图2所示。
[0070](3)ESR信号强度-电流关系曲线的建立
[0071]在进行步骤(2)的同时，每隔5或10分钟，即分别于0、10、20、25、30、35、40、5011^11时用毛细管取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，使其在活细胞培养液中的浓度为50mM，经280-320nm波段的紫外光照射30min后，使活细胞培养液中的过氧化氢充分分解为羟基自由基，采用X-band电子顺磁共振波谱仪(FA200，日本JEOL公司)记录ESR谱图，结果如图3所示。
[0072]对得到的ESR谱图以及步骤(2)得到的电流-时间曲线进行分析，取相同时间点的ESR信号强度(谱图中间两个信号峰强度的平均值)和电流值(某时间点的电流值减掉起始时间的电流值)，以电流值作为横坐标，以ESR信号强度作为纵坐标，拟合得到如图4中的关系曲线，线性回归方程为y = 60.3+731.5x，ESR信号强度与电流值呈良好的线性关系，相关系数为0.995。
[0073](4)ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线的建立
[0074]配制浓度分别为IX 10—6、5 X 10—6、1 X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—5moVL的过氧化氢标准溶液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，使其在过氧化氢标准溶液中的浓度为50mM，经280-320nm波段的紫外光照射30min后，使过氧化氢标准溶液中的过氧化氢充分分解为羟基自由基，采用X-band电子顺磁共振波谱仪记录ESR谱图，结果如图5所示。利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小，以过氧化氢浓度的对数值作为横坐标，以ESR信号强度作为纵坐标，得到如6所示的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，线性回归方程为y = 1995.3+273.0x，线性相关系数为0.997。
[0075](5)根据如上建立的曲线，可以从图2读出加入药物刺激后任意时间点的电流值；根据图4将电流值换算成ESR信号强度;最后，从图6读出这一 ESR信号强度所对应的过氧化氢的浓度值，由此完成对活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。
[0076]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，其特征在于，所述方法为利用电化学测试得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线，与此同时进行电子顺磁共振波谱测试，得到电化学池中活细胞在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-电流关系曲线；同样对过氧化氢标准溶液进行电子顺磁共振波谱测试，得到过氧化氢标准溶液在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，综合上述建立的三种曲线得到任意时间下的活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度，完成活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将三电极工作体系插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，所述三电极工作体系的工作电极上接种有活细胞，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线； (2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线； (3)配制过氧化氢标准溶液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线； (4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述三电极工作体系是以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡电极作为工作电极； 优选地，所述表面修饰的氧化铟锡电极从靠近氧化铟锡电极的一侧起表面逐层分别修饰有石墨稀、贵金属纳米颗粒、过氧化氢分解酶和细胞粘附剂。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面修饰的氧化铟锡电极的制备方法如下: A、利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理； B、将氧化石墨烯溶液旋涂到步骤A得到的氧化铟锡玻璃表面，置于肼蒸汽中进行原位还原，得到表面修饰有石墨烯的氧化铟锡玻璃； C、将贵金属纳米颗粒溶液加至步骤B得到的氧化铟锡玻璃表面，干燥，而后将其在过氧化氢分解酶溶液中浸润，得到修饰有贵金属纳米颗粒和酶的氧化铟锡电极； D、将细胞粘附剂溶液加至步骤C得到的电极表面，干燥得到所述表面修饰的氧化铟锡电极。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤A所述利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理前，先将氧化铟锡玻璃分别置于丙酮、乙醇和超纯水中依次超声10-30分钟； 优选地，步骤B所述氧化石墨稀溶液的浓度为0.01-0.lmg/mL； 优选地，步骤B所述原位还原的温度为50-70 °C ； 优选地，步骤B所述原位还原的时间为4-12小时； 优选地，步骤(^所述贵金属纳米颗粒为银纳米颗粒、金纳米颗粒或铀纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合，优选金纳米颗粒； 优选地，步骤C所述金贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒的质量百分数为0.01-0.05% ； 优选地，步骤(^所述贵金属纳米颗粒溶液与步骤B所述氧化石墨稀溶液的体积比为1:2-2:1； 优选地，步骤C所述过氧化氢分解酶为辣根过氧化物酶； 优选地，步骤0所述过氧化氢分解酶溶液的浓度为l-5mg/mL ； 优选地，步骤D所述细胞粘附剂为由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列组成的环状短肽； 优选地，所述细胞粘附剂溶液的浓度为l_5mg/mL; 优选地，步骤D所述细胞粘附剂溶液与步骤C所述金纳米颗粒溶液的体积比为1:2-2:1。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述电解液为磷酸盐缓冲溶液； 优选地，步骤(I)所述药物为佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯； 优选地，步骤(I)所述活细胞为能够在工作电极上贴壁生长的活细胞。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述羟基自由基捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物； 优选地，步骤(2)所述加入羟基自由基捕获剂使其在活细胞培养液中的浓度为20-80mM，优选40-50mM; 优选地，步骤(2)所述紫外光的波长范围为280-320nm。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述过氧化氢标准溶液的浓度为10—9-10—3mol/L; 优选地，步骤(3)所述配制过氧化氢标准溶液时所选定的过氧化氢的浓度梯度为I X 10—6、5 X 10—6、I X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—W/L ； 优选地，步骤(3)所述羟基自由基捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物； 优选地，步骤(3)所述加入羟基自由基捕获剂使其在过氧化氢标准溶液中的浓度等于步骤(2)所述羟基自由基捕获剂在活细胞培养液中的浓度； 优选地，步骤(3)所述紫外光的波长范围为280-320nm。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，利用电子顺磁共振波谱仪记录ESR谱图。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测活细胞中过氧化氢浓度的方法包括以下步骤: (1)以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡(ITO)电极作为工作电极组成三电极工作体系，将其插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线； (2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线； (3)配制10—4、10—5、10—6、10—7和10—Vol/L浓度梯度的过氧化氢溶液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线； (4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。
【文档编号】G01N24/10GK105866206SQ201610227973
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】宫建茹, 刘倩, 辛琪
【申请人】国家纳米科学中心
【专利摘要】本发明提供了一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，所述方法为利用电化学测试得到活细胞受药物刺激后的电流?时间曲线，同时进行电子顺磁共振波谱测试，得到电化学池中活细胞在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度?电流关系曲线；同样对过氧化氢标准溶液进行电子顺磁共振波谱测试，得到过氧化氢标准溶液在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度?过氧化氢浓度标准曲线，综合上述建立的三种曲线得到任意时间下的活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度，完成活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。本发明使得活细胞释放的过氧化氢浓度的定量检测更加准确，能实现原位实时监测活细胞所释放过氧化氢的浓度，具有广泛的应用前景。
【专利说明】
一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法
技术领域
[0001]本发明属于检测分析技术领域，涉及一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，尤其涉及一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法。
【背景技术】
[0002]活性氧不仅包括一些氧自由基，如超氧阴离子，羟基自由基等，还包括具有较高活性的一些分子如过氧化氢和单线态氧。与其他活性氧相比，过氧化氢性质相对稳定、容易在细胞与细胞周围环境之间扩散。一方面，人体内自发产生的适量的过氧化氢是相当重要的，在信号传导、神经传递、血小板凝集、免疫系统控制、学习和记忆、细胞常规生长、重要的生命化合物的合成和机体的新陈代谢中，都发挥了重要的作用。然而，当过氧化氢产生过量，或是机体自身的抗氧化剂的量大量减少时，过氧化氢就变得相当有害了。它们通过氧化一些功能性生物分子，使得细胞脂质膜，蛋白质组织、酶、碳水化合物和DNA等发生氧化损伤，造成细胞损坏或死亡，与癌症、炎症以及一些神经系统疾病密切相关。总之，在正常生理环境中，一定量的过氧化氢对于生命体是必不可少的，但过量的活性氧就会造成危害。因此，原位实时准确监测细胞产生过氧化氢的浓度对细胞信号传导研究、疾病诊断具有重要意义。
[0003]目前，大多数的过氧化氢检测方法，如色谱法、滴定法、紫外-可见光谱法、荧光法等，总的来说都比较耗时，易受干扰物影响，且难以原位实时检测。电化学方法，特别是基于纳米材料和酶修饰电极的电流型传感器由于实验过程简单、灵敏度高、选择性高而受到广泛关注。在通过电化学的方法对细胞外产生的过氧化氢做定量检测的工作中，目前主要是先用修饰电极构建安培电流与过氧化氢的浓度的标准曲线，然后通过实际细胞体系产生的安培电流曲线在标准曲线上读取或者计算出细胞产生的过氧化氢的浓度。这种方法经常被用作定量分析的手段，但是在活细胞体系中，这种制作标准曲线的方法存在一定缺陷。一方面，如果在将细胞接种到工作电极表面之后构建标准曲线，加入的标准溶液中的部分过氧化氢会扩散到细胞内部并被细胞内的酶等代谢分解掉，这样实际体系中测试得到的过氧化氢浓度往往是偏高的。另一方面，如果在将细胞接种到工作电极表面之前构建标准曲线，也就是说构建标准曲线时电极表面是不含有细胞的，这在电极活性面积、导电性方面与实际检测体系中所用的生长有贴壁细胞的工作电极不一致，因此所测试得到的过氧化氢浓度也是不准确的。
[0004]因此，在本领域需要开发一种能够原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，尤其是提供一种原位实时检测活细胞中过氧化氢浓度的方法。
[0006]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]—方面，本发明提供一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，所述方法为利用电化学测试得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线，与此同时进行电子顺磁共振波谱测试，得到电化学池中活细胞在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-电流关系曲线；同样对过氧化氢标准溶液进行电子顺磁共振波谱测试，得到过氧化氢标准溶液在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，综合上述建立的三种曲线得到任意时间下的活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度，完成活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。
[0008]本发明所述方法将电子顺磁共振波谱技术与电化学分析相结合来实现活细胞中过氧化氢浓度的原位实时检测，使得定量检测更加准确，解决了现有技术无法实现活细胞中过氧化氢浓度的原位实时检测的问题。
[0009]在本发明中，所述检测活细胞中过氧化氢浓度的方法包括以下步骤:
[0010](I)将三电极工作体系插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，所述三电极工作体系的工作电极上接种有活细胞，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线；
[0011](2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线；
[0012](3)配制过氧化氢(H2O2)标准溶液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线；
[0013](4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤
(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。
[0014]本发明通过将对过氧化氢有灵敏准确响应但原位实时性检测稍差的电子顺磁共振波谱技术与电化学相结合，利用电子自旋共振法(ESR)辅助电化学分析法进行标准曲线的构建，这个方法不涉及电极和活细胞之间的矛盾，可以实现活细胞外产生的过氧化氢的准确定量检测，而电化学分析则可对活细胞产生过氧化氢的过程原位实时检测。本发明提供的检测方法，避免了单纯使用电化学方法和电子顺磁共振检测的缺陷，使得定量检测更加准确，尤其适用于对活细胞体系产生过氧化氢浓度的原位实时准确监测，在疾病检测等生物医学领域具有重要应用价值。
[0015]优选地，步骤(I)所述三电极工作体系是以Ag/AgCl电极作为参比电极，采用铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡(ITO)电极作为工作电极。
[0016]优选地，所述表面修饰的氧化铟锡(ITO)电极从靠近氧化铟锡电极的一侧起表面逐层分别修饰有石墨烯、贵金属纳米颗粒、过氧化氢分解酶和细胞粘附剂。
[0017]优选地，所述表面修饰的氧化铟锡(ITO)电极的制备方法如下:
[0018]A、利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理；
[0019]B、将氧化石墨烯溶液旋涂到步骤A得到的氧化铟锡玻璃表面，置于肼蒸汽中进行原位还原，得到表面修饰有石墨烯的氧化铟锡玻璃；
[0020]C、将贵金属纳米颗粒溶液加至步骤B得到的氧化铟锡玻璃表面，干燥，而后将其在过氧化氢分解酶溶液中浸润，得到修饰有贵金属纳米颗粒和酶的氧化铟锡(ITO)电极；
[0021]D、将细胞粘附剂溶液加至步骤C得到的电极表面，干燥得到所述表面修饰的氧化铟锡电极。
[0022]优选地，在表面修饰的氧化铟锡(ITO)电极的制备中，在利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理前，先将氧化铟锡玻璃分别置于丙酮、乙醇和超纯水中依次超声10-30分钟，例如10分钟、13分钟、15分钟、18分钟、20分钟、23分钟、25分钟、28分钟或30分钟。
[0023]在本发明中，利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理的目的是增加亲水性和铺展性有利于其后续修饰。
[0024]优选地，步骤13所述氧化石墨稀溶液的浓度为0.01-0.lmg/mL，例如0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL或0.lmg/mL。
[0025]优选地，步骤8所述原位还原的温度为50-70°(:，例如51°(:、52°(:、53°(:、54°(:、561€、58°C、60°C、62°C、64°C、66°C、68°C或70°C。
[0026]优选地，步骤B所述原位还原的时间为4-12小时，例如4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。
[0027]优选地，步骤C所述贵金属纳米颗粒为银纳米颗粒、金纳米颗粒或铀纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合，优选金纳米颗粒。
[0028]优选地，步骤C所述金贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒的质量百分数为0.01-0.05%，例如0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%或
0.05%。
[0029 ] 优选地，步骤(3所述贵金属纳米颗粒溶液与步骤B所述氧化石墨稀溶液的体积比为1:2-2:1;例如1:2、1:1.8、1:1.5、1:1.3、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
[0030]优选地，步骤C所述过氧化氢分解酶为辣根过氧化物酶。
[0031 ] 优选地，步骤C所述过氧化氢分解酶溶液的浓度为l_5mg/mL，例如lmg/mL、1.3mg/mL、I.5mg/mL、I.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或 5mg/mL。
[0032]优选地，步骤D所述细胞粘附剂为由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列组成的环状短肽(简称RGD环肽)。
[0033]优选地，所述细胞粘附剂溶液的浓度为l_5mg/mL，例如lmg/mL、1.3mg/mL、1.5mg/mL、I.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或 5mg/mL。
[0034]优选地，步骤D所述细胞粘附剂溶液与步骤C所述金纳米颗粒溶液的体积比为1:2-2:1，例如1:2、1:1.8、1:1.5、1:1.3、1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
[0035]优选地，步骤(I)所述电解液为磷酸盐缓冲溶液。
[0036]优选地，步骤(I)所述药物为佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。
[0037]优选地，步骤(I)所述活细胞为能够在工作电极上贴壁生长的活细胞，对活细胞种类没有限制，只要是贴壁生长即可，具体的可以是Hela或其它肿瘤细胞。
[0038]优选地，在本发明的检测活细胞中过氧化氢浓度的方法中，步骤(2)所述羟基自由基捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物。
[0039]优选地，步骤(2)所述加入羟基自由基捕获剂使其在活细胞培养液中的浓度为20-80mM，例如 20mM、25mM、30mM、3 5mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM 或 80mM，优选40-50mM。
[0040]优选地，步骤(2)所述紫外光的波长范围为280-320nm，例如280nm、290nm、300nm、305nm、308nm、31 Onm、315nm、318nm 或 320nm。
[0041]在本发明中，步骤(3)所述ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，是以过氧化氢浓度的对数值(log值)为横坐标，以ESR信号强度为纵坐标建立的关系曲线。
[0042]在本发明中，步骤(3)所述过氧化氢标准溶液的浓度为10—9-10—3mol/L，例如10一9mol/L、8 X 10—Vol/L、5 X 10—Vol/L、3 X 10—Vol/L、8 X 10—7mol/L、5 X 10—7mol/L、3 X 10—7mol/L、5 X 10—W/L、I X 10—6mol/L、8 X 10—W/L、4 X 10—W/L、I X 10—W/L、8 X 10—4mol/L、5 X 10—4mol/L或I X 10—3mol/L。
[0043]优选地，步骤(3)所述配制过氧化氢标准溶液时所选定的过氧化氢的浓度梯度为IX 10—6、5 X 10—6、I X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—5mol/L。当然也可以选择其他浓度梯度的过氧化氢标准溶液，只要该标准溶液中每个样品的浓度在10—9-10—3mol/L即可。
[0044]优选地，步骤(3)所述羟基自由基捕获剂为5，5_二甲基-1-吡咯啉氮氧化物。
[0045]优选地，步骤(3)所述加入羟基自由基捕获剂使其在过氧化氢标准溶液中的浓度等于步骤(2)所述羟基自由基捕获剂在活细胞培养液中的浓度。
[0046]优选地，步骤(3)所述紫外光的波长范围为280-320nm，例如280nm、290nm、300nm、305nm、308nm、31 Onm、315nm、318nm 或 320nm。
[0047]优选地，在本发明中，利用电子顺磁共振波谱仪记录ESR谱图。
[0048]作为优选技术方案，本发明所述检测活细胞中过氧化氢浓度的方法具体包括以下步骤:
[0049](I)以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡电极作为工作电极组成三电极工作体系，将其插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线；
[0050](2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线；
[0051 ] (3)配制10—4、10—5、10—6、10—7和10—8mol/L浓度的过氧化氢溶液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线；
[0052](4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤
(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。
[0053]相对于现有技术，本发明具有如下有益效果:
[0054]与单一电化学分析方法相比，本发明将电子顺磁共振波谱技术与电化学方法结合，将利用电子顺磁共振波谱技术所得到的信号强度作为一个中间量，所建立的标准曲线能更加准确的反映活细胞测试体系中过氧化氢的浓度;与单一电子顺磁共振方法相比，本发明利用电子顺磁共振波谱技术与电化学方法结合可以原位实时监测活细胞所释放过氧化氢的浓度。本发明将电子顺磁共振波谱技术与电化学方法完美结合，使得活细胞释放的过氧化氢浓度的定量检测更加准确，解决了现有技术无法实现活细胞中过氧化氢浓度的原位实时检测的问题，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0055]图1是本发明中工作电极的制备过程示意图。
[0056]图2是本发明实施例1得到的电流-时间关系曲线，曲线I为细胞接种到工作电极上后加入PMA刺激下产生的电流-时间关系曲线，曲线2为细胞接种到工作电极上后但是无PMA刺激情况下产生的电流-时间关系曲线；曲线3为仅有PMA刺激但是未接种细胞到工作电极情况下产生的电流-时间关系曲线。
[0057]图3是本发明实施例1步骤(3)测试得到的活细胞培养液的ESR谱图.
[0058]图4是本发明实施例1建立的ESR信号强度-电流的关系曲线。
[0059]图5是本发明实施例1步骤(4)测试得到的不同浓度的过氧化氢标准溶液的ESR谱图。
[0060]图6是本发明实施例1建立的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线。
【具体实施方式】
[0061]下面通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0062]实施例1
[0063](I)工作电极(即表面修饰有石墨烯、金纳米颗粒、辣根过氧化物酶和细胞粘附剂RGD环肽的ITO电极并在其表面接种有活细胞)的制备，具体包括以下步骤(其制备过程如图1所示):
[0064]A、将ITO玻璃置于丙酮、乙醇、超纯水中依次超声20分钟，然后使用氧等离子体对其表面进行处理，以增加亲水性和铺展性有利于后续修饰；
[0065]B、将浓度为0.06mg/mL的氧化石墨烯溶液旋涂到上述ITO玻璃表面，然后置于肼蒸汽中于60 0C原位还原1小时；
[0066]C、将10微升金纳米颗粒溶液滴加到上述修饰有石墨烯的ITO表面，室温下自然干燥，而后在4°C条件下，将上述电极浸润到辣根过氧化物酶溶液中至少24小时，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗表面三次，得到修饰有金纳米颗粒和酶的氧化铟锡(ITO)电极；
[0067]D、10微升RGD环肽溶液滴加到步骤C得到的电极表面，4°C下自然干燥，得到所述表面修饰的氧化铟锡电极，而后Hela细胞接种到表面修饰的氧化铟锡电极表面，得到工作电极。
[0068](2)电流-时间关系曲线的建立
[0069]以Ag/AgCl电极作为参比电极，采用铂片或铂丝作为对电极，利用上述得到的表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡电极作为工作电极，将上述三电极插入到0.0lmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，形成一个三电极电化学测试系统，以开始加入PMA药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间(Omin)，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后O到60分钟内的电流-时间曲线，结果如图2所示。
[0070](3)ESR信号强度-电流关系曲线的建立
[0071]在进行步骤(2)的同时，每隔5或10分钟，即分别于0、10、20、25、30、35、40、5011^11时用毛细管取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，使其在活细胞培养液中的浓度为50mM，经280-320nm波段的紫外光照射30min后，使活细胞培养液中的过氧化氢充分分解为羟基自由基，采用X-band电子顺磁共振波谱仪(FA200，日本JEOL公司)记录ESR谱图，结果如图3所示。
[0072]对得到的ESR谱图以及步骤(2)得到的电流-时间曲线进行分析，取相同时间点的ESR信号强度(谱图中间两个信号峰强度的平均值)和电流值(某时间点的电流值减掉起始时间的电流值)，以电流值作为横坐标，以ESR信号强度作为纵坐标，拟合得到如图4中的关系曲线，线性回归方程为y = 60.3+731.5x，ESR信号强度与电流值呈良好的线性关系，相关系数为0.995。
[0073](4)ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线的建立
[0074]配制浓度分别为IX 10—6、5 X 10—6、1 X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—5moVL的过氧化氢标准溶液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，使其在过氧化氢标准溶液中的浓度为50mM，经280-320nm波段的紫外光照射30min后，使过氧化氢标准溶液中的过氧化氢充分分解为羟基自由基，采用X-band电子顺磁共振波谱仪记录ESR谱图，结果如图5所示。利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小，以过氧化氢浓度的对数值作为横坐标，以ESR信号强度作为纵坐标，得到如6所示的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，线性回归方程为y = 1995.3+273.0x，线性相关系数为0.997。
[0075](5)根据如上建立的曲线，可以从图2读出加入药物刺激后任意时间点的电流值；根据图4将电流值换算成ESR信号强度;最后，从图6读出这一 ESR信号强度所对应的过氧化氢的浓度值，由此完成对活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。
[0076]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种检测活细胞中过氧化氢浓度的方法，其特征在于，所述方法为利用电化学测试得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线，与此同时进行电子顺磁共振波谱测试，得到电化学池中活细胞在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-电流关系曲线；同样对过氧化氢标准溶液进行电子顺磁共振波谱测试，得到过氧化氢标准溶液在紫外光照射后的ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线，综合上述建立的三种曲线得到任意时间下的活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度，完成活细胞中过氧化氢浓度的实时检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将三电极工作体系插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，所述三电极工作体系的工作电极上接种有活细胞，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线； (2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线； (3)配制过氧化氢标准溶液，加入羟基自由基捕获剂，经紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线； (4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述三电极工作体系是以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡电极作为工作电极； 优选地，所述表面修饰的氧化铟锡电极从靠近氧化铟锡电极的一侧起表面逐层分别修饰有石墨稀、贵金属纳米颗粒、过氧化氢分解酶和细胞粘附剂。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面修饰的氧化铟锡电极的制备方法如下: A、利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理； B、将氧化石墨烯溶液旋涂到步骤A得到的氧化铟锡玻璃表面，置于肼蒸汽中进行原位还原，得到表面修饰有石墨烯的氧化铟锡玻璃； C、将贵金属纳米颗粒溶液加至步骤B得到的氧化铟锡玻璃表面，干燥，而后将其在过氧化氢分解酶溶液中浸润，得到修饰有贵金属纳米颗粒和酶的氧化铟锡电极； D、将细胞粘附剂溶液加至步骤C得到的电极表面，干燥得到所述表面修饰的氧化铟锡电极。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤A所述利用氧等离子体对氧化铟锡玻璃进行表面处理前，先将氧化铟锡玻璃分别置于丙酮、乙醇和超纯水中依次超声10-30分钟； 优选地，步骤B所述氧化石墨稀溶液的浓度为0.01-0.lmg/mL； 优选地，步骤B所述原位还原的温度为50-70 °C ； 优选地，步骤B所述原位还原的时间为4-12小时； 优选地，步骤(^所述贵金属纳米颗粒为银纳米颗粒、金纳米颗粒或铀纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合，优选金纳米颗粒； 优选地，步骤C所述金贵金属纳米颗粒溶液中贵金属纳米颗粒的质量百分数为0.01-0.05% ； 优选地，步骤(^所述贵金属纳米颗粒溶液与步骤B所述氧化石墨稀溶液的体积比为1:2-2:1； 优选地，步骤C所述过氧化氢分解酶为辣根过氧化物酶； 优选地，步骤0所述过氧化氢分解酶溶液的浓度为l-5mg/mL ； 优选地，步骤D所述细胞粘附剂为由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸序列组成的环状短肽； 优选地，所述细胞粘附剂溶液的浓度为l_5mg/mL; 优选地，步骤D所述细胞粘附剂溶液与步骤C所述金纳米颗粒溶液的体积比为1:2-2:1。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述电解液为磷酸盐缓冲溶液； 优选地，步骤(I)所述药物为佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯； 优选地，步骤(I)所述活细胞为能够在工作电极上贴壁生长的活细胞。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述羟基自由基捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物； 优选地，步骤(2)所述加入羟基自由基捕获剂使其在活细胞培养液中的浓度为20-80mM，优选40-50mM; 优选地，步骤(2)所述紫外光的波长范围为280-320nm。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述过氧化氢标准溶液的浓度为10—9-10—3mol/L; 优选地，步骤(3)所述配制过氧化氢标准溶液时所选定的过氧化氢的浓度梯度为I X 10—6、5 X 10—6、I X 10—5、2 X 10—5、5 X 10—W/L ； 优选地，步骤(3)所述羟基自由基捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物； 优选地，步骤(3)所述加入羟基自由基捕获剂使其在过氧化氢标准溶液中的浓度等于步骤(2)所述羟基自由基捕获剂在活细胞培养液中的浓度； 优选地，步骤(3)所述紫外光的波长范围为280-320nm。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，利用电子顺磁共振波谱仪记录ESR谱图。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测活细胞中过氧化氢浓度的方法包括以下步骤: (1)以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂片或铂丝作为对电极，表面修饰并接种有活细胞的氧化铟锡(ITO)电极作为工作电极组成三电极工作体系，将其插入到电解液中形成三电极电化学测试系统，以开始加入药物刺激活细胞产生过氧化氢为起始时间，采用记时安培法得到活细胞受药物刺激后的电流-时间曲线； (2)在进行步骤(I)的同时，取电化学池中的活细胞培养液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，利用该步骤得到的ESR谱图和步骤(I)得到的电流-时间曲线中同一时间点对应的ESR信号强度和电流大小建立ESR信号强度-电流关系曲线； (3)配制10—4、10—5、10—6、10—7和10—Vol/L浓度梯度的过氧化氢溶液，加入羟基自由基捕获剂5，5-二甲基-1-吡咯啉氮氧化物，经波长范围为280-320nm的紫外光照射后，记录ESR谱图，建立ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线； (4)通过步骤(I)得到的时间-电流曲线得到任意时间下的电流值，然后通过步骤(2)得到的ESR信号强度-电流关系曲线读出相应的ESR信号强度，最后利用步骤(3)得到的ESR信号强度-过氧化氢浓度标准曲线得到任意时间下活细胞受刺激后所释放出的过氧化氢的浓度。
【文档编号】G01N24/10GK105866206SQ201610227973
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】宫建茹, 刘倩, 辛琪
【申请人】国家纳米科学中心
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