一种复方草决明茶的质量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种复方草决明茶的质量检测方法，该方法包含丹参鉴别的步骤，所述的丹参鉴别是采用薄层色谱法进行丹参的鉴别，并以丹参素钠为对照品，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸体积比为20∶10∶15∶4的混合液为展开剂；还包括以橙黄决明素和大黄酚为对照品，采用高效液相色谱法对决明子的含量进行测定步骤。本发明的丹参鉴别方法和决明子含量测定方法简单、专属性强、准确度高、重现性好，在产品的生产过程中，用本发明方法能有效地控制产品的质量，从而确保复方草决明茶的临床疗效和安全性。
【专利说明】
_种复方草决明茶的质量检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种复方草决明茶的质量检测方法。属于医药领域。
【背景技术】
[0002] 随着经济的飞速发展，人们的生活节奏越来越紧张，加班、熬夜、生活压力大等导 致生活不规律，出现了便秘等常见的临床疾病，长此以往，体内毒素无法及时排出，可诱发 肿瘤等更加严重的疾病。复方草决明茶具有泻浊润肠的功能，适用于气虚肠燥型高脂血症 的辅助治疗，其处方中包含丹参和决明子，但是现行检测方法存在缺陷:对丹参的薄层色谱 法鉴别项以原儿茶酸为对照，方法专属性差，不能有效的控制产品的质量，且展开剂中含 苯，对人体不利;决明子的含量测定方法复杂、准确度低、重现性差。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种复方草决明茶的质量检测方法，包含丹参鉴别的步骤， 所述的丹参鉴别是采用薄层色谱法进行丹参的鉴别，并以丹参素钠为对照品，以氯仿：乙酸 乙酯：丙酮：甲酸体积比为20:10:15:4的混合液为展开剂;还包括以橙黄决明素和大黄酚为 对照品，采用高效液相色谱法对决明子的含量进行测定步骤，本发明方法简单、专属性强。
[0004] 本发明所述复方草决明茶的质量检测方法，其特征在于:包含丹参鉴别的步骤，所 述的丹参鉴别是采用薄层色谱法进行丹参的鉴别，并以丹参素钠为对照品，以氯仿：乙酸乙 酯:丙酮：甲酸体积比为20:10:15:4的混合液为展开剂。
[0005] 上述薄层色谱法采用硅胶GF254薄层板，展出后以氨蒸气熏后，置紫外光灯 (365nm)下检视。
[0006] 上述质量检测方法还包括以橙黄决明素和大黄酚为对照品，采用高效液相色谱法 对决明子的含量进行测定。
[0007]上述质量检测方法中高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂，以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。
[0009]上述质量检测方法中高效液相色谱的检测波长为284nm，理论板数按大黄酚峰计 算应不低于10000。
[0010] 上述复方草决明茶的质量检测方法中所述的丹参鉴别包括如下步骤：
[0011] (1)复方草决明茶用水进行超声提取，提取液调pH值至酸性，用有机溶剂提取，制 得供试品溶液；
[0012] (2)取丹参素钠对照品，制成对照品溶液；
[0013] (3)吸取供试品溶液和对照品溶液，分别点于硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙 酸乙酯-丙酮-甲酸（20:10:15:4)为展开剂，展开后，经氨蒸气熏，置紫外光灯(365nm)下检 视。
[0014]具体地，上述复方草决明茶的质量检测方法中所述的丹参鉴别包括如下步骤： [0015] (1)取复方草决明茶lg，研细，加水20ml，超声处理10分钟，离心，取上清液，用稀盐 酸调节pH值至2,用乙酸乙酯20ml振摇提取，提取液低温蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为 供试品溶液；
[0016] (2)取丹参素钠对照品，加甲醇制成每lml含O.lmg的溶液，作为对照品溶液；
[0017] (3)照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液2μ1， 对照品溶液ΙμL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(20: 10:15:4)为展开剂，展开，取出，瞭干，置氨蒸气中熏10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。
[0018] 上述复方草决明茶的质量检测方法中所述高效液相色谱法对决明子的含量进行 测定步骤包括：
[0019] (1)复方草决明茶用有机溶剂提取，酸水解，用有机溶剂提取，制得供试品溶液；
[0020] (2)取橙黄决明素对照品和大黄酚对照品，分别制成对照品溶液；
[0021] (3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定。
[0022] 具体地，上述复方草决明茶的质量检测方法中所述高效液相色谱法对决明子的含 量进行测定步骤包括：
[0023] (1)取复方草决明茶1 g，研细，加入甲醇50ml，加热回流2小时，放冷，滤过，取滤液 25ml蒸干，残渣加稀盐酸30ml，水浴加热1小时，冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30ml， 合并三氯甲烷液，回收溶剂蒸干，残渣加无水乙醇-乙酸乙酯（2:1)混合溶液使溶解，转移至 25ml量瓶中，并稀释至刻度，滤过，取滤液作为供试品溶液；
[0024] (2)取橙黄决明素对照品和大黄酚对照品，加无水乙醇和乙酸乙酯（2:1)混合溶液 制成每lml含橙黄决明素1 Oyg、大黄酚20yg的混合溶液，作为对照品溶液；
[0025] (3)测定：照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D)，分别吸取对照品 溶液与供试品溶液各?〇μ1，注入高效液相色谱仪测定，高效液相色谱的条件为：以十八烷基 硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相Β，按如下方式进行 梯度洗脱：
[0027] 本发明所采用的丹参鉴别方法和决明子含量测定方法简单、专属性强、准确度高、 重现性好，在产品的生产过程中，用本发明方法能有效地控制产品的质量，从而确保复方草 决明茶的临床疗效和安全性。
[0028] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0029] 图1是实施例1和对比例1供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图。
[0030] 图2是实施例1中耐用性试验的供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图。
[0031] 图3是实施例1中耐用性试验的供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图。
[0032] 图4是对比例2供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图。
[0033] 图5是对比例2供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图。
[0034] 图6是对比例2供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图。
[0035] 图7是实施例2大黄酚对照品溶液的高效液相色谱图。
[0036] 图8是实施例2橙黄决明素对照品溶液的高效液相色谱图。
[0037] 图9是实施例2供试品溶液的高效液相色谱图。
[0038] 图10是实施例2阴性对照液的高效液相色谱图。
[0039] 图11是实施例2橙黄决明素对照品溶液的高效液相色谱图。
[0040] 图12是实施例2大黄酚对照品溶液的高效液相色谱图。
[0041 ]图13是实施例2供试品溶液（140304)的高效液相色谱图。
[0042] 图14是实施例2橙黄决明素对照品溶液的高效液相色谱图。
[0043] 图15是实施例2大黄酚对照品溶液的高效液相色谱图。
[0044]图16是实施例2供试品溶液（140304)的高效液相色谱图。
[0045] 图17是实施例2橙黄决明素对照品溶液的高效液相色谱图。
[0046] 图18是实施例2大黄酚对照品溶液的高效液相色谱图。
[0047]图19是实施例2供试品溶液（140304)的高效液相色谱图。
[0048] 附图标记说明
[0049] 图1、图4、图5和图6中：1、2、3-供试品溶液，4-丹酚酸B对照品溶液，5-丹参素钠对 照品溶液，6-阴性对照液。
[0050] 图2、图3中：1、2、3_供试品溶液，4-丹参素钠对照品溶液，5-阴性对照液。
【具体实施方式】
[0051]以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0052] 实施例1 [0053]丹参的鉴别 [0054] 1鉴别方法
[0055] (1)取复方草决明茶1袋内容物粉碎，过三号筛，取lg，加水20ml使溶解，离心，取上 清液，用稀盐酸调pH值至2,加乙酸乙酯20ml，振摇提取，回收提取液至干，残渣加甲醇5ml使 溶解，作为供试品溶液；
[0056] (2)取丹参素钠对照品，加甲醇制成每lml含0. lmg的溶液，作为对照品溶液;取不 含丹参的阴性样品lg，加水20ml使溶解，离心，取上清液，用稀盐酸调pH值至2,加乙酸乙酯 20ml，振摇提取，回收提取液至干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为阴性供试品溶液；
[0057] (3)照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法，吸取供试品溶液2μ1，对照品 溶液各ΙμL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯:丙酮：甲酸= 20:10:15:4 为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏10分钟后，置紫外光灯(365nm)下检视，结果见附 图1。
[0058]由图可知以丹参素钠为对照，以氯仿：乙酸乙酯：丙酮：甲酸= 20:10:15:4为展开 剂，供试品色谱中在与丹参素钠对照品相应位置上有相同颜色的荧光斑点，分离效果较好， 阴性无干扰。
[0059] 2耐用性试验
[0060] 取供试品溶液、阴性供试品溶液各2μ1及对照品溶液?μL分别点于不同来源的硅胶 G薄层板上(图2为自制手铺板，图3为ΜΝ预制板）。
[0061] 结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点，且 阴性样品均无干扰。结果表明，该方法的专属性和耐用性均较好。
[0062] 对比例1 [0063]丹参的鉴别
[0064] 以丹酚酸Β为对照品，供试品溶液、对照品溶液的制备方法以及测定方法同实施例 1，结果见附图1。
[0065] 由图可知，供试品色谱中在与丹酚酸Β对照品相应位置上有相同颜色的荧光斑点， 但对照品色谱斑点有拖尾，鉴别效果不及实施例1。
[0066] 对比例2 [0067]丹参的鉴别
[0068] (1)供试品溶液的制备方法同实施例1;
[0069] (2)分别以丹参素钠和丹酚酸Β为对照品，对照品的制备方法同实施例1;
[0070] (3)测定方法同实施例1，分别以①三氯甲烷-丙酮-甲酸（25:10:4)、②三氯甲烷-丙酮-甲酸-水(20:10:4:0.5)、③三氯甲烷-丙酮-甲酸-水(25:10:4:0.5)为展开剂，展开， 取出，晾干，置氨蒸气中熏10分钟后，置紫外光灯(365nm)下检视，见附图4、5、6。
[0071] 由图可知，展开剂①供试品色谱中在与丹酚酸B和丹参素钠对照品相应位置上有 相同颜色的荧光斑点，但对照品色谱斑点有拖尾;展开剂②供试品色谱中在与丹酚酸B和丹 参素钠对照品相应位置上有相同颜色的荧光斑点，但与丹参素钠相应位置上背景有干扰； 展开剂③阴性有干扰。
[0072]以上试验结果表明，本发明的复方决明茶质量检测方法，即包含丹参鉴别的步骤， 所述的丹参鉴别是采用薄层色谱法进行丹参的鉴别，以丹参素钠为对照品，以氯仿：乙酸乙 酯:丙酮：甲酸体积比为20:10:15:4的混合液为展开剂，采用硅胶GF254薄层板，展出后以氨 蒸气熏后，置紫外光灯(365nm)下检视，方法专属性强，分离效果好，重现性好，能够有效测 定复方决明茶的质量。
[0073] 实施例2
[0074]复方决明茶的含量测定
[0075] 1测定方法
[0076] 1.1仪器、试药及试剂
[0077] 仪器：岛津LC-2010C HT高效液相色谱仪：日本，岛津公司；色谱柱:Diamonsil C18 150 X4.6mm?5um；Aglient ZOBARX C18 250 X4.6mm；Phenomenex luna C18 250X4.6mm； SCL-LC-lOAvp紫外可见检测器;电子天平:CP22?，北京赛多利斯仪器系统有限公司。
[0078]对照品：橙黄决明素（中国药品生物制品检定所提供，批号：111900-201202)，大黄 酚（中国药品生物制品检定所提供，批号：110796-200513)。
[0079]试剂：乙腈(色谱纯）；供试品及对照品制备所用试剂均为分析纯。
[0080] 样品：复方草决明茶（批号：140302,140304,140311)。
[0081] 1.2测定
[0082] (1)取橙黄决明素对照品、大黄酚对照品，精密称定，加无水乙醇和乙酸乙酯（2:1) 混合溶液制成每lml含橙黄决明素10yg、大黄酚20yg的混合溶液，作为对照品溶液；
[0083] (2)取复方草决明茶(批号：140302)，研细，过三号筛，取lg，精密称定，置具塞锥形 瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加稀盐酸30ml，置水浴中加热水解1小 时，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加 无水乙醇和乙酸乙酯（2:1)混合溶液适量使溶解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0084] (3)测定：照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D)，分别精密吸取对 照品溶液与供试品溶液各1〇μ1，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙 腈为流动相Α，以0.1 %磷酸溶液为流动相Β，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为 284nm，理论板数按大黄酸峰计算应不低于10000。
[0085]表1梯度洗脱条件
[0087] 2测定方法的评价
[0088] 2.1物质测定
[0089] 采用如本发明测定方法，所得大黄酚对照品溶液、橙黄决明素对照品溶液和供试 品溶液的色谱图见附图7、8、9。
[0090] 通过对比可以看出，供试品溶液在与橙黄决明素和大黄酚相同的保留时间处存在 吸收峰，表明检测效果好、方法专属性强。
[0091] 2.2阴性对照试验
[0092] 在处方中除去决明子药材，按处方中相同的比例和制备方法制成阴性制剂，用本 发明供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液，按相同测定条件进行测定，观察在与橙黄 决明素和大黄酚相同保留时间处是否存在吸收峰，结果见附图10。
[0093] 结果表明，在选定条件下测得的阴性对照溶液液相色谱中，在与2个对照品色谱峰 相同保留时间处无吸收峰，因此说明选定的条件测定该2种成分具有较强的专属性。
[0094] 2.3方法学考察（除耐用性试验外，其余方法学考察项目选取样品批号均为 140311)
[0095] 2.3.1线性关系考察
[0096]分别精密称取橙黄决明素、大黄酚对照品7.52mg、10.43mg，置10ml量瓶中，加无水 乙醇-乙酸乙酯（2:1)使溶解，并稀释至刻度，摇匀（1 )，从（1)中精密吸取5ml，置10ml量瓶 中，加无水乙醇-乙酸乙酯（2:1)稀释至刻度，摇匀（2)，从（2)中精密吸取2ml，置10ml量瓶 中，加无水乙醇-乙酸乙酯（2:1)稀释至刻度，摇匀（3)，从（3)中精密吸取2ml，置10ml量瓶 中，加无水乙醇-乙酸乙酯（2:1)稀释至刻度，摇匀（4)，从(4)中精密吸取2ml，置10ml量瓶 中，加甲醇稀释至刻度，摇匀(5)。分别吸取10μ1，注入液相色谱仪，按实施例2中2.1.2(C)相 同条件测定，记录积分值，并以峰面积的积分值为横坐标，对照品进样量为纵坐标建立标准 曲线，计算回归方程，数据见表2。
[0097]表2线性关系考察
[0099] 橙黄决明素回归方程为：Y= 1.13 X 10-7X+0.0703，r = 0.999,橙黄决明素在 0.0286yg~7.144yg范围内呈良好的线性关系；大黄酚的回归方程为：Y = 3.31X10-7X+ 0.0149，r = 1.000，大黄酚在0.042yg~10.43yg范围内呈良好的线性关系。
[0100] 2.3.2重复性试验
[0101]分别精密量取复方草决明茶(140311)样品6份，按本发明方法测定含量，并计算样 品的RSD%值，结果见表3。
[0102]表3重复性试验结果表(n = 6)
[0104] 结果表明，橙黄决明素和大黄酚含量的RSD分别为1.8%和2.5%，此含量测定方法 的重现性良好。
[0105] 2.3.3准确度试验
[0106] (1)橙黄决明素准确度试验
[0107]精密量取已知含量(含量为〇.494mg/g)的样品9份，每份各0.5g，分别加入橙黄决 明素对照品溶液各1.80ml、2.20ml、3.00ml (浓度为0.108205mg/ml)，按本发明供试品溶液 制备方法制备，并测定含量，计算回收率，结果见表4。
[0108] 平均回收率为100.5%，RSD = 2.1 %，本检测方法准确度较好。
[0109] (2)大黄酚的准确度试验
[01 ?0]精密称取已知含量(含量为0.680mg/g)的样品9份，每份各0.5g，分别加入大黄酸 对照品溶液各2.30ml、3.00ml、4.00ml (浓度为0.1008mg/ml)，按本发明供试品溶液制备方 法制备，并测定含量，计算回收率，结果见表5。
[0111] 平均回收率为91.6%，RSD = 4.5%(n = 9)，本检测方法准确度较好。
[0112] 表4橙黄决明素回收率测定结果
[0114]表5大黄酚回收率测定结果
[0116] 2.4耐用性试验
[0117]取本品含量测定项下供试品溶液(140304)，采用本发明含量测定高效液相色谱条 件，分别以下列色谱柱进行测定，含量测定结果重现性好，见表6。
[0118]表6含量测定结果
[0120] (l)Aglient ZOBAX C18(250X4.6mm)，色谱图见附图 11、12、13;
[0121] (2)Diamonsil C18(150X4.6mm)，5ym，色谱图见附图 14、15、16;
[0122] (3)Phenomenex luna C18(250X4.6mm)，色谱图见附图 17、18、19〇
[0123] 由图11-19可以看出，对于同一色谱柱，供试品溶液在与橙黄决明素和大黄酚相同 的保留时间处存在吸收峰，表明检测效果好、方法专属性强、耐用性好。
[0124] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种复方草决明茶的质量检测方法，其特征在于包含丹参鉴别的步骤，所述的丹参 鉴别是采用薄层色谱法进行丹参的鉴别，并以丹参素钠为对照品，以氯仿：乙酸乙酯:丙酮： 甲酸体积比为20:10:15:4的混合液为展开剂。2. 根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于所述薄层色谱法采用硅胶GF254薄 层板，展出后以氨蒸气熏后，置紫外光灯(365nm)下检视。3. 根据权利要求1-2所述的质量检测方法，其特征在于还包括以橙黄决明素和大黄酚 为对照品，采用高效液相色谱法对决明子的含量进行测定。4. 根据权利要求3所述的质量检测方法，其中高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相B，按如下方式进行梯度 洗脱：5. 根据权利要求4所述的质量检测方法，其中高效液相色谱的检测波长为284nm，理论 板数按大黄酚峰计算应不低于10000。6. 根据权利要求1-5所述复方草决明茶的质量检测方法，其特征在于所述的丹参鉴别 包括如下步骤： (1) 复方草决明茶用水进行超声提取，提取液调pH值至酸性，用有机溶剂提取，制得供 试品溶液； (2) 取丹参素钠对照品，制成对照品溶液； (3) 吸取供试品溶液和对照品溶液，分别点于硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙 酯-丙酮-甲酸(20:10:15:4)为展开剂，展开后，经氨蒸气熏，置紫外光灯(365nm)下检视。7. 根据权利要求6所述复方草决明茶的质量检测方法，其特征在于所述的丹参鉴别包 括如下步骤： (1) 取复方草决明茶lg，研细，加水20ml，超声处理10分钟，离心，取上清液，用稀盐酸调 节pH值至2,用乙酸乙酯20ml振摇提取，提取液低温蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试 品溶液； (2) 取丹参素钠对照品，加甲醇制成每lml含0. lmg的溶液，作为对照品溶液； (3) 照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取供试品溶液2μ1，对照 品溶液ΙμL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（20:10: 15:4)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。8. 根据权利要求1-7所述复方草决明茶的质量检测方法，其特征在于所述的高效液相 色谱法对决明子的含量进行测定步骤包括： (1) 复方草决明茶用有机溶剂提取，酸水解，用有机溶剂提取，制得供试品溶液； (2) 取橙黄决明素对照品和大黄酚对照品，分别制成对照品溶液； (3) 分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定。9.根据权利要求8所述复方草决明茶的质量检测方法，其特征在于所述的高效液相色 谱法对决明子的含量进行测定步骤包括： (1) 取复方草决明茶lg，研细，加入甲醇50ml，加热回流2小时，放冷，滤过，取滤液25ml 蒸干，残渣加稀盐酸30ml，水浴加热1小时，冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30ml，合并 三氯甲烷液，回收溶剂蒸干，残渣加无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液使溶解，转移至25ml 量瓶中，并稀释至刻度，滤过，取滤液作为供试品溶液； (2) 取橙黄决明素对照品和大黄酚对照品，加无水乙醇和乙酸乙酯（2:1)混合溶液制成 每lml含橙黄决明素10yg、大黄酚20yg的混合溶液，作为对照品溶液； (3) 测定:照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D)，分别吸取对照品溶液 与供试品溶液各1〇μ1，注入高效液相色谱仪测定，高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷 键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相Β，按如下方式进行梯度 洗脱：
【文档编号】G01N30/06GK105866274SQ201610203876
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】刘梅森, 黄靖梅, 笔雪艳, 金星, 宋莉萍, 高俊清, 张洪昌, 刘淑梅, 陈立红, 刘德峰, 周振东, 李佳, 李佳一, 刘洋
【申请人】牡丹江友搏药业股份有限公司